么林妍，凌碧揚，劉曉樂，劉茵，肖建喜＊

（1.蘭州大學化學化工學院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省化工研究院有限責任公司，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅創(chuàng)翼檢測科技有限公司，甘肅 蘭州 730000）

引言

膠原蛋白是哺乳動物中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占蛋白質(zhì)總質(zhì)量的30%[1-2]。作為主要的結(jié)構(gòu)蛋白，膠原蛋白存在于所有的結(jié)締組織中，可以為組織和器官提供機械強度[3-5]。膠原蛋白具有高度生物活性，參與大量細胞外基質(zhì)的相互作用[6]。它具有合成高分子材料無可比擬的生物相容性、生物可降解性等優(yōu)良性質(zhì)，在醫(yī)藥、化妝品、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[7-10]。

不同于球形蛋白，膠原蛋白具有特征性的三股螺旋結(jié)構(gòu)，該特殊結(jié)構(gòu)在膠原蛋白與其它生物大分子的相互作用中扮演關(guān)鍵角色，直接影響膠原蛋白的降解、細胞黏附等性質(zhì)[2，11]。膠原蛋白在酸、堿、酶或高溫作用下，其三股螺旋結(jié)構(gòu)完全或部分解旋成無規(guī)則卷曲的多肽鏈，形成明膠[12]。膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)被完全破壞，并降解成相對分子質(zhì)量從幾千到幾萬成分復(fù)雜的膠原肽混合物[13]。明膠和膠原肽因為缺乏天然膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，使它們不再具備生物學功能，如細胞粘附、細胞增殖等，極大地限制了它們在醫(yī)用材料中的應(yīng)用。

目前市場上的膠原蛋白主要來自動物組織提取，主要包括堿法、酸法和酶法等[14]。堿法利用氫氧化鈣、氫氧化鈉等堿性試劑在特定的外界環(huán)境條件下提取膠原蛋白，容易造成膠原肽鍵水解，破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)[15，16]。酸法利用酸性試劑（鹽酸、乙酸等）破壞膠原蛋白分子間的鹽鍵和席夫堿鍵以及不同蛋白質(zhì)分子之間的氨鍵，使得膠原蛋白膨脹、溶解，該方法可能會破壞色氨酸、絲氨酸和酪氨酸[17，18]。酶法的條件一般更加溫和，它利用蛋白酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶等）對膠原蛋白進行酶解，破壞共價鍵，得到可溶的膠原蛋白[19，20]。雖然酶法已經(jīng)被廣泛用于提取膠原蛋白，但是過度的酶切仍然會部分破壞三股螺旋結(jié)構(gòu)[21]。

三股螺旋結(jié)構(gòu)作為膠原蛋白的重要質(zhì)量指標，其檢測主要依賴于圓二色譜（CD）[22]和超靈敏差示掃描量熱儀（VP-DSC）[23]。這些方法可迅速評價膠原蛋白是否整體具有三股螺旋結(jié)構(gòu)，然而，膠原蛋白存在部分位點三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞、變性的情況卻較難檢測[24，25]。膠原蛋白的局部變性可能嚴重影響其生物功能[26]，因此，亟需開發(fā)高特異性檢測變性膠原蛋白的方法。最近的研究發(fā)現(xiàn)，具有重復(fù)Gly-Pro-Hyp序列等特殊序列的熒光多肽探針[27]，可以高靈敏、特異性地識別癌癥[28]、關(guān)節(jié)炎[29]和纖維化[30]等病理組織中的變性膠原蛋白。

牦牛是高寒地區(qū)特有的半野生牛種，也是世界上生活在海拔最高處的哺乳動物。全球90%以上的牦牛生活在青藏高原，是我國西部獨有的珍貴資源[31，32]。我們開發(fā)了溫和的生物工藝，從牦牛骨中提取制備了高品質(zhì)的牦牛骨膠原蛋白（YO）。我們利用高特異性的熒光多肽探針和酶切方法，高靈敏地檢測膠原蛋白是否變性。我們成功制備非變性的YO，它保持完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。該YO表現(xiàn)出良好的生物功能，顯著促進了成纖維細胞的黏附和增殖，可以滿足醫(yī)療健康對高品質(zhì)膠原蛋白的需求。

1 實驗部分

1.1 主要材料與儀器

牦牛骨購自甘肅省天?？h；胃蛋白酶（1∶3000）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蛋白分子量Marker（10~245 kDa）購自南通飛宇生物科技有限公司；氨芐西林（Amp），異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），苯甲基磺酰氟（PMSF）購自索萊寶生物科技有限公司；四甲基乙二胺（TEMED）購自南京化學試劑股份有限公司；亞氨基二乙酸購自上海邁瑞爾化學技術(shù)有限公司；丙烯酰胺，過硫酸銨，甲叉雙丙烯酰胺均購自上海國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS）購自Sigma；三羥甲基氨基甲烷（Tris），甘氨酸購自北京博奧拓達科技有限公司；瓊脂糖凝膠4B（Sepharose 4B）購自北京博潤萊特科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司，DHG-9030），電泳儀電源（北京市六一儀器廠，DYY-6C型），冷凍干燥（寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-12N），臺式高速冷凍離心機（湘儀離心機儀器有限公司，H2050R），紫外分光光度計（日本島津公司，μV-1750），圓二色譜儀（英國應(yīng)用光物理公司，Chirascan），透射電子顯微鏡（JEOL公司，JEM-2100），酶標儀（瑞士TECAN公司，Infinite M200），電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國熱電公司，iCAPQc）

1.2 實驗方法

1.2.1 YO的提取

首先用刀將骨頭上的肉割掉，去掉骨髓，洗凈牦牛骨，然后置于25℃烘箱中干燥12 h，得到牦牛骨粉；用10%正丁醇將粉碎后的牦牛骨粉進行脫脂，脫脂結(jié)束，離心取沉淀，水洗至中性；將前步中得到的沉淀用0.5 M鹽酸進行脫鈣，脫鈣結(jié)束，離心取沉淀，水洗至中性；將前步中得到的沉淀浸泡于0.1 mol/L的氫氧化鈉進行除雜，除雜結(jié)束，離心取沉淀，水洗至中性；用含1 g/L胃蛋白酶的0.5 mol/L乙酸溶液提取膠原蛋白，得到粗的膠原蛋白提取液；調(diào)pH至中性，進行酶滅活；8~14 kDa透析袋透析；透析結(jié)束后，冷凍干燥，得到牦牛骨膠原蛋白。

1.2.2 YO的聚丙烯酰胺凝膠電泳表征

a.100 mL 30%丙烯酰胺儲存液的制備：稱取29.2 g丙烯酰胺和0.8 g甲叉雙丙烯酰胺置于燒杯中，加入少量蒸餾水于通風櫥中攪拌至完全溶解，然后把溶液倒入100 mL容量瓶定容，將制備好的溶液轉(zhuǎn)入棕色瓶中，4℃條件避光保存。

b.100 mL SDS-分離膠緩沖液的配置（pH 8.8~8.9）：稱取18.2 g Tris和0.4 g SDS加入24 mL 1 mol/L的HCl中，完全溶解后加蒸餾水定容至100 mL。

c.100 mL SDS-濃縮膠緩沖液的配置（pH 6.8）：稱取6 g Tris和0.4 g SDS加入到48 mL 1 mol/L HCl中，完全溶解后加蒸餾水定容至100 mL。

1.2.3 YO的圓二色譜測試

YO樣品的圓二色譜實驗利用配備有Peltier溫度控制器的Chirascan圓二色譜儀（Applied Photophysics,UK）進行檢測。在pH 7.0，10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）條件下，制備濃度為2 mg/mL的YO樣品。YO樣品，4℃下的波長掃描范圍為210~260 nm，每步間隔為1 nm，平均時間為5 s，每個樣品重復(fù)掃描三次。通過測量YO樣品在225 nm處的峰強度（從4℃升至50℃時，升溫平均速率為1℃/min），確定YO樣品的熱穩(wěn)定性。通過擬合YO三聚體到單體過程中的熱變曲線，并對其進行一階求導(dǎo)，極值的位置對應(yīng)YO的熱變溫度（Tm）。

1.2.4 YO的酶解實驗

通過SDS-PAGE，對YO的酶切實驗進行表征。將所提取YO在85℃加熱20 min得到完全變性的膠原蛋白。選擇的YO和變性的YO，濃度都為3 mg/mL，按體積比1∶1加入3 mg/mL的胃蛋白酶，15℃對樣品進行酶切實驗，選取不同酶切時間（5 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h）的樣品，進行SDS-PAGE表征。

1.2.5 熒光多肽探針對變性膠原蛋白的靶向結(jié)合實驗

我們利用特異性結(jié)合變性膠原蛋白的熒光多肽探針FAM-(GPO)8來檢測牦牛膠原蛋白的變性程度。YO溶解于0.5 mol/L乙酸中，配置濃度為100 μg/mL的膠原蛋白溶液。將膠原蛋白溶液于30、40、50和60℃水浴加熱20 min，制備不同變性程度的牦牛骨膠原蛋白溶液。將膠原蛋白溶液于80℃水浴加熱20 min，制備得到完全變性的牦牛骨膠原蛋白（D-collagen）。非變性和變性膠原蛋白溶液在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中稀釋至2μg/mL。將50μL上述蛋白溶液加入黑色96孔板中，4℃下孵育過夜。室溫下，使用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌孔板五次，除去未結(jié)合的蛋白。在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中配制5μmol/L FAM-(GPO)8多肽探針溶液，將50 μL FAM-(GPO)8多肽探針溶液加入孔板，4℃下孵育5 h。結(jié)合結(jié)束后，室溫下使用10 mM PBS洗滌孔板五次，除去未結(jié)合的多肽探針。待孔板風干后，用Tecan Infinite F200/M200多功能酶標儀（Tecan,M?nnedorf,Switzerland）上測定讀數(shù)，激發(fā)波長為497 nm，發(fā)射波長為530 nm，每組實驗重復(fù)三組。

1.2.6 YO的細胞實驗

1.2.6 .1 YO的細胞黏附實驗

24孔板（組織未處理）分別用牛血清白蛋白（BSA）和非變性YO包被。加入成纖維細胞（HFF-1細胞）之前，用10 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.2~7.4）洗滌24孔板三次。然后將HFF-1細胞懸液（細胞密度為1200個細胞/mm2）加到孔板中，并在37℃下孵育12 h。將粘附的HFF-1細胞用4.0%甲醛溶液固定10 min，用0.1%Triton X-100溶液通透HFF-1細胞5 min，并在室溫下加入含有1%BSA的PBS緩沖液（10 mmol/L，pH 7.2~7.4）封閉0.5 h。將固定的HFF-1細胞與鬼筆環(huán)肽-四甲基羅丹明異硫氰酸酯（索萊寶，中國）10 mmol/L PBS（pH 7.2~7.4）避光共孵育1 h，然后加入Hoechst 33258（Sigma-Aldrich）（1 mL，5μg/mL在超純水）在37℃下孵育10 min，分別染色細胞肌動蛋白和細胞核。成像的結(jié)果利用徠卡（Leica Microsystems Inc.,Wetzlar,Germany）熒光顯微鏡獲得。

1.2.6 .2 YO的細胞增殖實驗

HFF-1細胞（含有15%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基）在含有5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱（溫度設(shè)定37℃）中培養(yǎng)。將體積為100μL的HFF-1細胞懸浮液（每孔5×103個細胞的密度），分別接種于三塊96微孔板中，三塊板分別命名為A,B,C，孵育24 h（37℃，5%CO2）以保證完全貼壁。然后在三塊96微孔板中分別加入100μL質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的非變性牦牛骨膠原DMEM稀釋液，濃度為0.1 mg/mL的變性牦牛骨膠原DMEM稀釋液，對照孔中加入100μL DMEM培養(yǎng)基，在37℃繼續(xù)溫育。1天后，取出A板，然后向各孔中加入100 uL 10%的Cell counting Kit-8（cck-8），置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用Tecan Infinite F200/M200多功能酶標儀（Tecan,M?nnedorf,Switzerland）測量其在450 nm處的光密度（OD）值，摸索合適時間，當只有細胞不含材料的孔OD值達到1左右時，記錄所需時間，停止培養(yǎng)。2天后，取出B板，采取同A板相同的操作，加cck-8后，培養(yǎng)時間同A板保持一致。4天后，取出C板，采取同A板相同的操作，加cck-8后，培養(yǎng)時間同A板保持一致。比較三塊板的OD值，進行細胞增殖研究。HFF-1細胞的活性計算為每種條件三次測量的平均吸收值。

2 結(jié)果與討論

2.1 YO的SDS-PAGE結(jié)果

對提取后的YO聚丙烯酰氨凝膠電泳分析如圖1所示。在高于245 kDa處有β11，β12兩條帶，在約140 kDa處有α1，α2兩條電泳條帶，在小于100 kDa處沒有其它條帶，表明所提取的YO未發(fā)生降解。

圖1 YO的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE photos of YO collagen

2.2 YO的圓二色譜結(jié)果

天然膠原蛋白不能形成α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)，目前已發(fā)現(xiàn)的29種膠原蛋白都呈現(xiàn)共同的結(jié)構(gòu)元素，即三股螺旋結(jié)構(gòu)[33]。它是由三條具有Polyproline II螺旋結(jié)構(gòu)的肽鏈（簡稱α鏈），相互纏繞成繩狀而形成的右手超螺旋結(jié)構(gòu)[34]。通過圓二色譜對牦牛骨膠原蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行表征，結(jié)果如圖2所示。YO在225 nm處具有正峰，在205 nm處具有負峰，該譜圖符合膠原蛋白的特征性三股螺旋結(jié)構(gòu)。熱變實驗表明，YO的解旋溫度為37℃，與人的體溫相似。圓二色譜結(jié)果表明，制備得到的YO整體上保留了膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)。

圖2 YO的圓二色譜表征（A）CD全譜；（B）熱變曲線Fig.2 CD spectra of YO(A)CD spectrum;(B)CD thermal unfolding

2.3 胃蛋白酶不能降解非變性YO

研究表明，具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白可以抵抗胃蛋白酶等蛋白酶的酶解，而變性的膠原蛋白因為喪失三股螺旋結(jié)構(gòu)的保護，而非常容易被蛋白酶降解為不同分子量的片段[35-37,24]。我們利用胃蛋白酶的酶切實驗來檢測提取的YO是否變性。我們將提取的牦牛骨膠原蛋白在85℃加熱20 min制備得到完全變性的YO。YO和變性YO溶液樣品在不同酶切時間下的SDS-PAGE實驗結(jié)果，如圖3所示。

酶切實驗表明，提取的YO不同酶切時間下的電泳條帶基本只有I型膠原蛋白的特征條帶，表明YO保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，可以有效抵抗胃蛋白酶的降解（圖3A）。相反，對于變性的YO，經(jīng)過不同時間的酶切，出現(xiàn)大量降解片段的電泳條帶，表明變性膠原蛋白喪失三股螺旋結(jié)構(gòu)，因此被胃蛋白酶顯著降解（圖3B）。這些實驗結(jié)果表明，我們所制備的YO為非變性膠原蛋白。

圖3 YO的酶切實驗A：非變性YO不同酶切時間的SDS-PAGE，從左到右依次為：5 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h，marker；B：變性YO不同酶切時間的SDS-PAGE，從左到右依次為：5 min、30 min、1 h、2 h、marker、3 h、6 h、12 h、24 hFig.3 Protease digestion of YO(A)SDS-PAGE of non-denatured YO with different digestion times,from left to right:5 min,30 min,1 h,2 h,3 h,6 h,12 h,24 h,marker;(B)Denatured yak bone SDS-PAGE of different digestion times of collagen,from left to right:5 min,30 min,1 h,2 h,marker,3 h,6 h,12 h,24 h

2.4 熒光多肽探針靶向結(jié)合變性YO

最新研究表明，熒光多肽探針FAM-(GPO)8可以高特異性識別變性膠原蛋白，而完全不結(jié)合三股螺旋結(jié)構(gòu)完整的膠原蛋白[38]。我們利用該熒光多肽探針來檢測YO的變性程度。我們通過靶向探針FAM-(GPO)8對不同熱變性程度的膠原進行染色實驗，實驗結(jié)果如圖4所示。圖4A的結(jié)果表明，該靶向探針對提取的YO完全沒有結(jié)合能力，而對完全變性的YO表現(xiàn)出極強的結(jié)合能力。圖4B的結(jié)果表明，不同溫度對YO具有不同程度的變性能力，隨著溫度的逐漸升高，靶向探針結(jié)合能力逐漸增強。實驗結(jié)果表明，我們所制備的YO沒有發(fā)生變性。

圖4 變性膠原蛋白的靶向結(jié)合實驗A：提取的YO和完全變性的YO的結(jié)合能力；B：不同溫度處理的YO的結(jié)合能力Fig.4 The binding experiment of denatured collagenA：The binding ability of collagen and completely denatured collagen;B：The binding ability of collagen after heating at different temperatures

2.5 非變性YO促進細胞黏附

通過熒光顯微鏡觀察成纖維細胞的粘附和伸展性質(zhì)（圖5）。用鬼筆環(huán)肽-四甲基羅丹明異硫氰酸鹽和Hoechst 33258核染料分別對肌動蛋白應(yīng)激纖維和細胞核染色。熒光顯微鏡圖像表明，附著在BSA涂層上的人成纖維細胞（HFF-1）保持球形，其細胞骨架結(jié)構(gòu)發(fā)育不佳（圖5A）。相反地，附著在YO涂層上的HFF-1細胞具有發(fā)達的肌動蛋白細胞骨架結(jié)構(gòu)（圖5B-C）。廣泛的細胞粘附和擴散表明，YO具有優(yōu)良的生物活性。

圖5 不同材料表面成纖維細胞的粘附：（A）BSA；（B）與（C）YOFig.5 Adhesion to fibroblasts on the surface of different materials:(A)BSA;(B)(C)YO

2.6 非變性YO促進細胞增殖

YO對成纖維細胞的增殖能力實驗結(jié)果如圖6所示。空白為未鋪材料的空板，以空白板細胞的活力為100%對照。結(jié)果表明，YO在第一天就顯著促進了細胞增殖，增殖率達到126%。第2天和第4天在未新加培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，細胞依然保持高活力，表明制備的YO可促進成纖維細胞增殖。

圖6 YO促進成纖維細胞的增殖Fig.6 YO promotes fibroblast cell proliferation

3 結(jié)論

本文中，我們基于西北特有的牦牛資源，制備得到了YO。同時，我們采用了一系列的方法，系統(tǒng)地評估了我們所提取的YO的品質(zhì)。

SDS-PAGE實驗表明，提取得到的YO具有I型膠原蛋白的特征性條帶，并且沒有發(fā)生降解。CD結(jié)果表明，YO整體上保持三股螺旋結(jié)構(gòu)，熱變溫度為37℃。進一步的酶切實驗表明，提取的YO可以有效抵抗胃蛋白酶的降解，說明YO沒有發(fā)生變性，它保持完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)。特別突出的是，我們建立變性膠原蛋白的靶向結(jié)合實驗，利用高特異性的熒光多肽探針來檢測YO的變性程度。該靶向探針對提取的YO完全沒有結(jié)合能力，而對完全變性的YO表現(xiàn)出極強的結(jié)合能力，可用于檢測表征不同變性程度的YO。細胞實驗表明，YO對成纖維細胞有良好的粘附能力，并且可以顯著促進成纖維細胞的增殖。我們成功制備未變性的YO，它具有完整的三股螺旋結(jié)構(gòu)和良好的生物功能，可用于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。