賀安琪，馬宏瑞＊，姜勤勤，朱超，楊永林

（1.陜西科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.安徽銀河皮革有限公司,安徽 界首 236500；3.榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 榆林 719000）

引言

垃圾滲濾液是一種高濃度有機(jī)廢水，水質(zhì)及水量波動性大，COD、BOD、可生化性隨填埋時間的增長而下降并逐漸維持較低水平[1]，產(chǎn)生量受多種因素如降水量、蒸發(fā)量、地面流失等的影響[2]，其中不僅含有致癌物，還含有多種有機(jī)污染物、重金屬、高氨氮等[3]。目前國內(nèi)外垃圾滲濾液中已查明包含200余種有機(jī)污染物，其中數(shù)十種危害人類健康和環(huán)境，進(jìn)入地下水的污染物更是有上千種，污染物在地下遷移擴(kuò)散，對人類的健康產(chǎn)生極大的威脅[4]。目前垃圾滲濾液的處理方法較多，B.G.Reis等人[5]研究了好氧膜生物反應(yīng)器與納濾（MBR-NF）的集成以及混合芬頓-微濾工藝（FMF-NF）；Minimol Pieus Thanikkal等人[6]采用高級氧化法（AOP）和生物法相結(jié)合處理；Li Xiang等人[7]構(gòu)建了反硝化（DN）-部分硝化（PN）-厭氧氨氧化（Anammox）系統(tǒng)，探討了非控溫條件下季節(jié)溫度變化對垃圾滲濾液脫氮的影響。

近年來生物反應(yīng)墻技術(shù)因其具有修復(fù)綠色、費(fèi)用節(jié)省、長期運(yùn)行、對低濃度污染可有效去除等優(yōu)點(diǎn)受到重視。生物反應(yīng)墻是PRB與強(qiáng)化生物修復(fù)方法的結(jié)合技術(shù)。其中PRB是填充有活性反應(yīng)介質(zhì)材料的被動反應(yīng)區(qū)，污染物質(zhì)通過滲透性反應(yīng)墻時被降解或固定[8]，介質(zhì)可對溶解的有機(jī)物、金屬、核素及其他污染物進(jìn)行降解、吸附、沉淀或去除[9]。地下水環(huán)境的低溫（12~14℃）、寡營養(yǎng)和污染物的毒性、復(fù)雜性，使得實(shí)際修復(fù)中往往需要向生物反應(yīng)墻內(nèi)導(dǎo)入具有特殊新陳代謝能力的微生物，通過微生物對污染物的降解和代謝達(dá)到凈化含水層的目的[10]。營養(yǎng)物質(zhì)[11]、電子受體[12]以及環(huán)境等因素均會影響修復(fù)過程中外源微生物種群和功能多樣性的變化，進(jìn)而影響生物修復(fù)效果[13]。因此，研究生物反應(yīng)墻內(nèi)微生物的數(shù)量及代謝功能多樣性變化，對于檢驗(yàn)外源微生物的功能穩(wěn)定性以及生物反應(yīng)墻構(gòu)建的成敗具有重要意義[14]。

垃圾滲濾液COD 8000~15 000 mg/L，氨氮濃度通常在1000 mg/L以上，含鹽量一般高達(dá)10 000 mg/L以上[15，16]，而制革廢水作為復(fù)雜高負(fù)荷工業(yè)廢水典型代表，含有大量的氯離子、膠原蛋白、脂質(zhì)和表面活性劑等[17]，CODCr約1000~2000 mg/L，氨氮濃度在100 mg/L以內(nèi)，含鹽量通常在2000 mg/L以內(nèi)，同垃圾滲濾液相似屬于高鹽高有機(jī)物廢水，但毒性和處理難度不及垃圾滲濾液。故滲透反應(yīng)墻技術(shù)應(yīng)適用于制革廢水的處理或污染防控，同時滲透反應(yīng)墻對重金屬如鉻的修復(fù)具有一定作用，湖南長沙原鉻鹽廠工程案例證明PRB可使重金屬鉻由50 mg/L降至0 mg/L[18]，王興潤[19]等人研究表明包覆型零價鐵材料作為PRB反應(yīng)介質(zhì)可有效治理鉻渣堆放導(dǎo)致的鉻污染。

本研究通過模擬生物反應(yīng)墻的設(shè)計(jì)構(gòu)建和運(yùn)行，評估其出水COD，生物毒性，抗氧化性以及運(yùn)行期間生物反應(yīng)墻中功能微生物數(shù)量、代謝指紋圖譜及群落多樣性變化。對于處理與垃圾滲濾液類似的制革廢水具有一定借鑒意義和價值。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）供試?yán)鴿B濾液取自江村溝垃圾滲濾液處理廠，COD約為8000~15 000 mg/L。

（2）主要試劑：硫酸銀(Ag2SO4）、硫酸汞（HgSO4）、重鉻酸鉀（K2Cr2O7)均購于嘉興市化學(xué)試劑廠，LB肉湯購于杭州百思生物技術(shù)有限公司，總抗氧化能力試劑盒購于南京建成生物工程研究所，Ecoplate板購自美國BIOLOG公司。

（3）主要儀器：大型恒溫振蕩器（恒科學(xué)儀器有限公司上海中國），電熱式壓力蒸汽滅菌器（新豐醫(yī)療器械有限公司浙江中國），水質(zhì)毒性測試儀（哈希水質(zhì)分析儀器有限公司北京中國），XH-C旋渦混合器（金壇市白塔新寶儀器廠 江蘇 中國），Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國）。

1.2 方法

1.2.1 填料選擇及生物反應(yīng)墻模型的構(gòu)建

根據(jù)Blowes等人[20]的研究，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了改良的滲透反應(yīng)墻，選擇石英砂（粗，細(xì)）做進(jìn)出水處填料，陶粒、錳砂、沸石、活性炭做生物反應(yīng)區(qū)填料。粒徑大小活性炭＜沸石＜錳砂＜陶粒，設(shè)置比例為1∶1∶1∶1、1∶1∶1∶2、1∶1∶2∶1、1∶2∶1∶1、2∶1∶1∶1，COD去除率最高為最優(yōu)配比。

建立總長，寬，高分別為700 mm，50 mm，60 mm的生物反應(yīng)墻，自左向右依次填充粗石英砂（進(jìn)水導(dǎo)流區(qū)），細(xì)石英砂，混合填料（生物反應(yīng)區(qū)），細(xì)石英砂（出水區(qū)）。

1.2.2 進(jìn)水濃度及流量的確定

圖1 生物反應(yīng)墻設(shè)計(jì)圖Fig.1 Bioreactor wall design drawing

取垃圾滲濾液：水（①1∶1，②1∶2，…，⑩1∶10）20 uL、土壤浸提液10 uL、LB培養(yǎng)基160 uL于96孔板，置于搖床，以70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)，每24 h讀數(shù)，至超過1/3吸光度＞2；

蠕動泵轉(zhuǎn)速1 r/min，水力停留時間約1.8 h，略短，故取0.1 r/min，出水100 mL用時約6 h，確定該流速。

1.2.3 生物反應(yīng)墻的接種微生物培養(yǎng)及固定

微生物菌株為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，培養(yǎng)及固定方法參照解井坤[21]。取稀釋5倍和10倍的垃圾滲濾液，加入10 g菌粉，以70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)72 h，擴(kuò)繁后固定在聚氨酯泡沫載體上，均勻安置在反應(yīng)墻內(nèi)。

1.2.4 水質(zhì)參數(shù)、毒性及抗氧化性測定

（1）每隔6 h取樣測COD，波動較大，則向生物反應(yīng)區(qū)添加少量馴化菌種；

（2）根據(jù)GB/T15441-1995《發(fā)光細(xì)菌法》[22]，采用發(fā)光細(xì)菌檢測出水水質(zhì)毒性，計(jì)算發(fā)光抑制率；抑制率實(shí)驗(yàn)，LB培養(yǎng)基+配制菌液+出水，70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)至超過1/3（即32個孔）吸光度＞2；

（3）采用血清總抗氧化能力測定法，選取9個出水樣，從培養(yǎng)基用接種環(huán)（酒精燈滅菌）挑取少量特定菌落，接種入已滅菌的50 mL培養(yǎng)基，放置在搖床上以70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)約36 h；依次加入水樣、菌液1 mL，培養(yǎng)基18 mL，以70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)約16 h；吸取上述液體3 mL，漩渦混合器震蕩3 min，37℃恒溫水浴20 min；讀取吸光度（波長520 nm），計(jì)算抗氧化能力。

1.2.5 微生物群落功能多樣性測定

模擬小范圍無菌環(huán)境，采用Biolog-ECO法[23]對生物反應(yīng)區(qū)前、中、后部的上、中、下層微生物數(shù)量進(jìn)行測定。每孔加對應(yīng)區(qū)段的混合液150 uL，空白孔加等量0.9%生理鹽水，用酶標(biāo)儀讀取0 h數(shù)據(jù)后以70 r/min，27℃條件恒溫培養(yǎng)，每24 h讀取數(shù)據(jù)并觀察記錄顏色變化孔數(shù)至超過1/3個孔的吸光度＞2。

1.2.6 微生物代謝指紋圖譜分析（ECO板法）

BIOLOG微平板技術(shù)最初應(yīng)用于臨床，Garland等1991年首次將其應(yīng)用于描述混合的微生物群體特征[24]。Simpson指數(shù)是反映群落中最常見物種優(yōu)勢度的衡量指標(biāo)；Shannon多樣性指數(shù)是研究群落物種豐富度和分布均勻程度的綜合指標(biāo)；McIntosh指數(shù)是群落物種均一性的度量指標(biāo)。

Shannon多樣性指數(shù)：

Simpson指數(shù)（用1/D表示）：

McIntosh指數(shù)：

式中，Ci為反應(yīng)孔的吸光度，R為對照孔的吸光度；n為計(jì)算孔數(shù)；pi為每一孔吸光度除以所有孔吸光度的和以對變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，消除在點(diǎn)樣及培養(yǎng)過程中對吸光度變化帶來的影響誤差，相對吸光度n=Ci-R；N是相對吸光值總和。

1.2.7 CCA分析

利用Canon for windows 4.5軟件繪圖分析。樣方間在種類組成上及環(huán)境因子組成上的相似性表現(xiàn)在排序圖上樣方較集中，群落間的界線比較模糊[25]。箭頭表示環(huán)境因子，箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸之間的正負(fù)相關(guān)性，箭頭連線的長度代表某個環(huán)境因子與群落分布和種類分布之間相關(guān)程度的大小，連線越長，相關(guān)性越大；箭頭連線和排序軸的夾角代表著某個環(huán)境因子與排序軸的相關(guān)性大小，小于90度，角度越小越正相關(guān)，大于90度，角度越大越負(fù)相關(guān)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物反應(yīng)墻進(jìn)水生物毒性

如圖2，垃圾滲濾液稀釋倍數(shù)低（如①~③）時垃圾滲濾液色度較大，吸光度較高，稀釋5倍，功能微生物生長狀況良好且生物毒性維持在10%以內(nèi)，說明該垃圾滲濾液毒性較強(qiáng)。

圖2 不同濃度對微生物生長的抑制趨勢Fig.2 The inhibitory trend of microbial growth at different influent concentrations

2.2 生物反應(yīng)墻總體效果和運(yùn)行參數(shù)分析

2.2.1 COD去除效果

原液COD為8500 mg·L-1，如圖3所示，COD去除率基本穩(wěn)定（除運(yùn)行初期水樣3存在小幅度波動），去除率均大于92%，整個裝置在處理期5天內(nèi)運(yùn)行狀況良好且COD去除效果良好。裝置運(yùn)行初期進(jìn)水流速略大（泵轉(zhuǎn)速1 r/min），造成水量波動，導(dǎo)致出水水質(zhì)波動。

圖3 COD去除率Fig.3 COD removal rate

2.2.2 出水生物毒性測定

如圖4所示：0號為進(jìn)水樣，其發(fā)光抑制率為92%，出水發(fā)光細(xì)菌抑制率基本都在30%以下（除12號樣抑制率為32.3%），毒性下降60%以上。

圖4 發(fā)光菌抑制率Fig.4 Inhibition rate of luminescent bacteria

2.2.3 總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)

如圖5所示：總抗氧化能力總體呈上升趨勢，說明水質(zhì)毒性降低對微生物的抗氧化活性影響小。6 h時總抗氧化能力是0 h的22倍，是微生物對外界環(huán)境變化的應(yīng)激反應(yīng)，且前端營養(yǎng)富集，故微生物總抗氧化力高，微生物逐漸適應(yīng)該環(huán)境，總抗氧化力降至正常水平，隨著時間推移逐漸升高。后期營養(yǎng)物質(zhì)減少，代謝降低，總抗氧化力下降。

圖5 出水總抗氧化能力變化趨勢Fig.5 Variation trend of total antioxidant capacity of effluent（對應(yīng)的樣品依次為進(jìn)水，出水1，2，3，4，7，9，10，12）

2.3 微生物群落代謝活性

如圖6所示，反應(yīng)墻內(nèi)微生物墻體各部位AWCD變化曲線的斜率相差甚微,說明反應(yīng)墻中微生物對Biolog生態(tài)板中單一碳源的利用能力和代謝活性相似。從前端到后端，生物代謝活性逐漸降低，因反應(yīng)墻墻體前端微生物抗沖擊力最強(qiáng)，隨著橫向位移逐漸降低；根據(jù)前、中、后段AWCD曲線知，反應(yīng)墻墻體前端中層和中端中層生物活性最好，后端略差，因中層環(huán)境較上層的好氧和下層的缺氧為微含氧，利于馴化菌種生長代謝，后端因寡營養(yǎng)態(tài)達(dá)不到功能微生物生長要求，故偏低，72 h時后端比前端降低了23.6%。

圖6 微生物代謝活性隨時間變化情況Fig.6 Changes in microbial metabolic activities with time

2.4 微生物群落對不同碳源的代謝能力分析

如圖7所示，微生物對各類碳源代謝能力前段＞中段＞后段，AWCD值顯示脂類降低17.6%、糖類降低14.3%、醇類降低34.5%、胺類降低13.7%、酸類降低27.1%、氨基酸類降低35.8%，因?yàn)樯锓磻?yīng)區(qū)前段進(jìn)水濃度較高，生物數(shù)量較其他段多，且生物反應(yīng)墻對這些碳源有消耗作用，故生物反應(yīng)區(qū)前段碳源利用情況整體最好，后段代謝能力下降；對于前段而言，碳源利用程度由高到低為：糖類，氨基酸類，酸類，酯類，醇類，胺類；對于中段和后段而言，碳源利用程度由高到低為：糖類，氨基酸類，酸類，酯類，胺類，醇類。對糖類和氨基酸類利用較高，因?yàn)檫M(jìn)水中含較多小分子多糖和氨基酸類物質(zhì)，被優(yōu)先利用。前段與中、后段的碳源利用差異僅表現(xiàn)在胺類和醇類的利用趨向程度方面，前者偏好于利用醇類，后者則偏好于胺類的利用[26]，可在后端添加胺類碳源，提升反應(yīng)墻生物活性和處理效果。

圖7 培養(yǎng)72 h的6種碳源利用情況Fig.7 Utilization of six carbon sources during 72h cultivation

2.5 位點(diǎn)下代謝類型相似度分析

如圖8所示：不同碳源對不同采樣點(diǎn)微生物代謝相似度分布的貢獻(xiàn)度差異，其中酸類、氨基酸類與不同采樣點(diǎn)微生物代謝相似度分布關(guān)系最為密切，其次是、胺類、醇類、脂類、糖類。所有碳源均與第一排序軸的相關(guān)性較高。從左至右表示碳源量的增加，反應(yīng)不同位點(diǎn)微生物對不同碳源的利用情況。中段上層、中段下層、后段中層三點(diǎn)距離相近，說明碳源利用情況相似，均對氨基酸、酸類、糖類的利用情況較差，因?yàn)榉磻?yīng)墻對該類碳源消耗較大，使中后段這三類碳源量減少，可在中后段補(bǔ)充氨基酸、酸類、糖類，提高微生物代謝活性。

圖8 培養(yǎng)72 h不同位點(diǎn)相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis of different sites in 72 h cultivation

2.6 微生物群落功能多樣性

如表1所示，反應(yīng)墻前端至后端，功能微生物群落Simpson指數(shù)上升113.4%，即微生物多樣性和均一性降低；Shannon指數(shù)下降4.9%，即微生物豐富度降低；McIntosh指數(shù)下降25.2%，即微生物均勻度降低。原因是前端營養(yǎng)高，后端營養(yǎng)貧瘠，環(huán)境單一。

表1 反應(yīng)墻中微生物群落代謝功能多樣性評價Tab.1 Evaluation of the Metabolic Function Diversity of Microbial Communities in the Reaction Wall

2.7 經(jīng)濟(jì)核算

近年來海藻酸鈣固定化零價鐵應(yīng)用于零價鐵滲透式反應(yīng)墻[27]，以構(gòu)建長、寬、高為21、1.5、1.8 m的滲透反應(yīng)墻為例，對比本實(shí)驗(yàn)與該零價鐵滲透反應(yīng)墻，進(jìn)行經(jīng)濟(jì)核算。

如表2所示，構(gòu)建同等規(guī)模反應(yīng)墻，本實(shí)驗(yàn)費(fèi)用總計(jì)31 819元，海藻酸鈣固定化零價鐵滲透式反應(yīng)墻107 512元?？梢姌?gòu)建生物滲透反應(yīng)墻成本遠(yuǎn)低于零價鐵滲透反應(yīng)墻，具有較大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。

表2 經(jīng)濟(jì)核算Tab.2 Economic accounting

3 結(jié)論

（1）模擬生物反應(yīng)墻處理垃圾滲濾液的效果較理想，COD去除率均在92%以上，生物毒性試驗(yàn)中發(fā)光細(xì)菌抑制率基本都在30%以下，總抗氧化能力整體隨著時間推移而逐漸增高；

（2）生物反應(yīng)區(qū)內(nèi)微生物群落代謝活性隨著水流方向逐漸降低，主要由于前端微生物受沖擊較大，可通過減緩進(jìn)水流速提高前端微生物活性。

（3）反應(yīng)墻中后段微生物碳代謝指紋圖譜類似，均對氨基酸、酸類、糖類的利用情況較差，因?yàn)榉磻?yīng)墻對該類消耗較大，使中后段這三類碳源量減少，可在中后段補(bǔ)充氨基酸、酸類、糖類，提高微生物代謝活性。