徐萬田，董文睿，朱文胤

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院，南京市口腔醫(yī)院第三門診部，江蘇 南京（210008）

頜面部骨缺損修復(fù)與再生是組織工程與再生醫(yī)學(xué)的研究熱點。選擇合適的種子細胞，并通過外源性調(diào)控使其獲得更好的成骨分化功能具有重要意義。

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）為牙源性間充質(zhì)干細胞，具有自我更新能力、多向分化潛能，免疫原性低，可通過拔除的第三磨牙、正畸牙獲得，來源較為充足，且與頜面部骨組織具有同源性，因此被視為頜面部骨缺損修復(fù)與再生的重要種子細胞［1］。

CCDC134（coiled-coil domain containing 134）是新發(fā)現(xiàn)的一種骨調(diào)控分子，其表達缺失可影響成骨細胞的骨向分化和骨基質(zhì)形成，在成骨調(diào)控中發(fā)揮重要作用［2］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）/Smad家 族 成 員1（mothers against decapentaplegic homolog 1，SMAD1）信號通路是骨代謝中的重要通路，具有正向調(diào)控成骨分化的功能［3］。

本實驗擬通過上調(diào)/下調(diào)CCDC134，觀察其對hDPSCs成骨分化的影響，以及CCDC134與BMP-2/SMAD1信號通路的關(guān)系，為hDPSCs在頜面部骨缺損修復(fù)與再生中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（Gibco，美國）；胎牛血清（四季青，中國）；成骨誘導(dǎo)液、細胞聚合體誘導(dǎo)液、ALP染液、茜素紅染液（碧云天，中國）；Trizol reagent（Invitrogen，美 國）；逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（Toyobo，日本）；BMP-2、Dorsomorphin、HA/TCP（Sigma，美國）；慢病毒（銳博，中國）；人Stro-1抗體（ab214086，Abcam，英國）；CD105抗體（ab11414，Abcam，英國）；CD34抗體（ab187282，Abcam，英國）；CD45抗 體（ab25386，Abcam，英 國）；人CCDC134抗體（MAB7784-SP，R&D，美國）；RUNX2抗體（sc-390351，Santa Cruz，美國）；OCN抗體（sc-390877，Santa Cruz，美國）；BMP-2抗體（sc-137087，Santa Cruz，美 國）、SMAD1抗 體（sc-7965，Santa Cruz，美國）；GAPDH抗體（sc-47724，Santa Cruz，美國）；實時定量PCR儀（CFX96，Bio-Rad，美國）；流式細胞儀（FACSCanto II，BD，美國）。

1.2 實驗分組和方法

1.2.1 hDPSCs分離培養(yǎng)與鑒定 選取就診患者中需要拔除的新鮮阻生第三磨牙或正畸減數(shù)牙，分離牙髓，并將牙髓組織切割為小碎塊，采用組織塊-酶消化法，配合有限稀釋法，分離培養(yǎng)hDPSCs。以P3代細胞進行實驗。

本實驗獲得南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（NJSH-2021NL-003）。所有阻生第三磨牙或正畸減數(shù)牙來源的患者，均已簽署知情同意書。

對分離hDPSCs進行鑒定：①流式細胞儀檢測表面標(biāo)志物Stro-1、CD105、CD34和CD45；②hDPSCs克隆形成檢測，將500個細胞接種于5 cm培養(yǎng)皿，14 d后固定細胞，甲苯胺藍染色；③成骨誘導(dǎo)及堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色檢測、茜素紅染色（詳見1.2.4）；④成脂誘導(dǎo)及油紅染色檢測成脂能力（詳見1.2.5）。

1.2.2 慢病毒感染hDPSCs與實驗分組 以5×104個/mL的密度將hDPSCs接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞生長融合至底面積的約80%時加入慢病毒感染。CCDC134低表達慢病毒（shCCDC134）和過表達慢病 毒（CCDC134）的 靶 序 列 分 別 為5′-CTTCCAGAACCCATTTAAA-3′，5′-CAATGCACAGGGCTGCAGTCTAA-3′，病毒滴度＞108PFU/mL。6 h后換液，72 h后收集感染細胞。

將hDPSCs分為4組，分別為空白對照組、陰性對照組、CCDC134下調(diào)組（shCCDC134）、CCDC134過表達組（CCDC134）?？瞻讓φ战M細胞不感染任何慢病毒；陰性對照組細胞感染空白質(zhì)粒慢病毒；shCCDC134組細胞感染CCDC134低表達慢病毒；CCDC134組細胞感染CCDC134過表達慢病毒。

1.2.3 BMP-2信號激活及抑制 hDPSCs感染了CCDC134低表達慢病毒或CCDC134過表達慢病毒后，誘導(dǎo)細胞聚合體形成，在細胞貼壁時將細胞分為4組，分別為：①shCCDC134組，加入等量溶劑；②shCCDC134+BMP-2組，加入BMP-2信號通路激活劑BMP-2（100μM）；③CCDC134組，加入等量溶劑；④CCDC134+Dorsomorphin組，加入BMP-2信號通路抑制劑Dorsomorphin（200μM）。

1.2.4 成骨誘導(dǎo)及ALP染色檢測、茜素紅染色 將1×105個細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后更換成骨誘導(dǎo)液，每2 d換液1次，14 d后固定細胞，ALP染液染色15 min，觀察染色情況，28 d后固定細胞，茜素紅染液染色10 min，PBS緩沖液洗滌染液，顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成。

1.2.5 成脂誘導(dǎo)及油紅染色檢測成脂能力 將1×105個細胞接種于12孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后更換成脂誘導(dǎo)液，每2 d換液1次，7 d后，固定細胞，油紅染液染色10 min，PBS緩沖液洗滌染液，顯微鏡下觀察脂肪滴形成。

1.2.6 qPCR檢測相關(guān)基因mRNA水平 Trizol法提取hDPSCs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（反應(yīng)條件：37℃，5 min×3；50℃，5 min×3；98℃，5 min），實時定量擴增（反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，15 s；60℃，30 s；39個循環(huán)）。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western blot檢測相關(guān)蛋白水平 超聲震蕩聯(lián)合反復(fù)凍融法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白于SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃孵育CCDC134、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor 2，RUNX2）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、BMP-2、SMAD1一抗工作液（1∶500）8 h，PBS洗滌，室溫孵育二抗1 h，PBS洗滌，PVDF膜顯影。

1.2.8 裸鼠皮下成骨實驗 將BMP-2信號激活劑（BMP-2）和抑制劑（Dorsomorphin）分別干預(yù)后的CCDC134下調(diào)及上調(diào)hDPSCs以1×105個/孔接種于12孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后更換細胞聚合體誘導(dǎo)液，每2 d換液1次，待細胞聚合體形成后，將羥基磷灰石/磷酸三鈣顆粒包裹于細胞聚合體中，移植于裸鼠皮下。2個月后，取材脫鈣，行HE染色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS19.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs的細胞鑒定

hDPSCs高表達間充質(zhì)來源的表面標(biāo)志物Stro-1（98.67%）和CD105（98.51%），低表達造血系來源的表面標(biāo)志物CD34（0.34%）和CD45（0.27%）。hDPSCs可形成細胞克隆，在成骨或成脂誘導(dǎo)條件下，可產(chǎn)生礦化結(jié)節(jié)或脂肪滴。以上結(jié)果說明hDPSCs分離培養(yǎng)成功，可進行后續(xù)實驗。見圖1。

Figure 1 Identification of hDPSCs圖1 hDPSCs的鑒定

2.2 成骨誘導(dǎo)條件下hDPSCs中CCDC134的mRNA和蛋白表達水平

成骨誘導(dǎo)條件下，hDPSCs中CCDC134的mRNA水 平（P＜0.001）和 蛋 白 表 達 水 平（P＝0.021）的表達均上升。見圖2。

Figure 2 Expression of CCDC134 in hDPSCs after osteogenic induction圖2 成骨誘導(dǎo)條件下hDPSCs中CCDC134的表達水平

2.3 慢病毒感染后hDPSCs中CCDC134的表達水平

與空白對照組相比，陰性對照組的CCDC134的mRNA和蛋白表達水平無明顯變化（P＝0.364）。與陰性對照組相比，shCCDC134組CCDC134的mRNA水平（P＜0.001）和蛋白（P＝0.015）水平表達顯著降低，而CCDC134組的mRNA（P＜0.001）和蛋白（P＝0.008）表達量顯著升高，見圖3。

Figure 3 Expression of CCDC134 in human dental pulp stem cells after lentivirus transfection圖3 慢病毒感染后人牙髓干細胞的CCDC134表達水平

2.4 CCDC134對hDPSCs成骨分化功能的影響

與空白對照組相比，陰性對照組的ALP染色和礦化結(jié)節(jié)形成無明顯差異（P＞0.05）；與陰性對照組相比，shCCDC134組的ALP染色（P＜0.001）和礦化結(jié)節(jié)形成（P＝0.001）顯著降低；而CCDC134組的ALP染色（P＜0.001）和礦化結(jié)節(jié)形成（P＝0.018）顯著增加。

與空白對照組相比，陰性對照組的成骨分子RUNX2和OCN的mRNA水平和蛋白表達水平也無明顯變化（P＞0.05）；與陰性對照組相比，shCCDC134組的RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）和蛋白表達水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＝0.001）均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而CCDC134組的RUNX2和OCN的 的mRNA水 平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）和蛋白表達水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖4。

Figure 4 Effect of CCDC134 on osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells圖4 CCDC134對人牙髓干細胞成骨分化功能的影響

2.5 CCDC134通過BMP-2/SMAD1信號通路調(diào)控hDPSCs成骨分化功能

與空白對照組相比，陰性對照組的BMP-2和SMAD1的蛋白表達水平的表達無顯著差異（P＞0.05）；與陰性對照組相比，shCCDC134組的BMP-2和SMAD1的蛋白表達水平（BMP-2：P＝0.036，SMAD1：P＝0.039）均降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義；而CCDC134組的BMP-2和SMAD1蛋白表達水平（BMP-2：P＜0.001，SMAD1：P＝0.002）均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖5。

Figure 5 Expression level of BMP-2/SMAD1 signal pathway protein in human dental pulp stem cells after lentivirus infection圖5 慢病毒感染人牙髓干細胞后BMP-2/SMAD1信號通路蛋白表達水平

與shCCDC134組相比，shCCDC134+BMP-2組成骨分子RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）與 蛋 白 表 達 水 平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）升高，裸鼠皮下異位成骨增加（P＝0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；與CCDC134組相比，CCDC134+Dorsomorphin組RUNX2和OCN的mRNA水平（RUNX2：P＜0.001，OCN：P＜0.001）與蛋白表達水平（RUNX2：P＝0.001，OCN：P＜0.001）均降低，裸鼠皮下異位成骨減少（P＝0.012），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見圖6。

Figure 6 CCDC134 regulates the osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells through BMP-2 signaling pathway圖6 CCDC134通過BMP-2信號通路調(diào)控人牙髓干細胞的成骨分化能力

3 討 論

hDPSCs是一類重要的牙源性種子細胞，研究表明hDPSCs具有成骨分化潛能［4-5］，在骨組織修復(fù)與再生中發(fā)揮作用［6-10］，因此，明確其成骨分化的分子機制對于精準(zhǔn)調(diào)控種子細胞功能，促進骨組織修復(fù)與再生具有重要意義。

CCDC134是新發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的分子，在胚胎發(fā)育過程中參與心臟、腦、肝臟等多種重要組織器官的代謝，其表達缺失可導(dǎo)致這些重要臟器的發(fā)育和功能障礙［11］。CCDC134的高度保守性保證了其可以從動物實驗延伸至人源性樣本的研究。研究表明，過表達CCDC134可以顯著改善小鼠關(guān)節(jié)炎的癥狀［12］。不僅如此，CCDC134表達缺失可導(dǎo)致多種成骨相關(guān)基因的表達異常，進而導(dǎo)致嚴重的骨發(fā)育不全［2］。此外，CCDC134基因突變可造成患Ehlers-Danlos綜合征母親所懷胎兒的骨折，甚至是致死性骨折［3］。以上研究均提示CCDC134在骨發(fā)育與代謝中具有關(guān)鍵作用。

本實驗首先對進行了hDPSCs鑒定，顯示其間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物高表達，造血干細胞表面標(biāo)志物低表達，同時具有自我更新和多向分化潛能，以確保后續(xù)實驗的可靠性。其次，發(fā)現(xiàn)hDPSCs成骨過程中的CCDC134表達增高，提示其在成骨中起重要作用；并通過慢病毒調(diào)控hDPSCs中CCDC134的水平，發(fā)現(xiàn)過表達CCDC134可以顯著增強hDPSCs的成骨分化能力，為精準(zhǔn)調(diào)控hDPSCs在骨組織工程中的作用，提供了新的靶點。

研究顯示，CCDC134可調(diào)控細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在其他骨組織細胞中發(fā)揮作用［13-14］。例如，CCDC134突變可以引發(fā)ERK1/2磷酸化，抑制成骨相關(guān)分子骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、Ⅰ型膠原α鏈（collagen type I alpha 1 chain，COL1A1）的表達，進而導(dǎo)致成骨細胞分化異常［2］。也有研究報道CCDC134不直接調(diào)控MAPK信號通路［13］，這可能與兩項研究選用的疾病模型和細胞種類不同有關(guān)。除以上信號通路外，BMP-2/SMAD1信號通路也是參與細胞骨代謝的重要信號通路，可以促進成骨細胞［15-16］、間充質(zhì)干細胞［17-20］的成骨分化，其與CCDC134的相關(guān)研究尚未見報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達CCDC134可上調(diào)BMP-2/SMAD1信號的表達，而抑制CCDC134則下調(diào)該信號的表達，提示BMP-2/SMAD1是CCDC134的下游信號通路。此外，通過BMP-2信號的激活和抑制，可以有效逆轉(zhuǎn)CCDC134低表達慢病毒或過表達慢病毒對hDPSCs的作用，從而明確了CCDC134可通過BMP-2/SMAD1信號通路調(diào)控hDPSCs的成骨分化。

輔助性T細胞1（helper T cell 1，Th1）和輔助性T細胞17（helper T cell 17，Th17）是兩類重要的免疫細胞，在骨代謝的負向調(diào)控中起重要作用，二者的活化直接或間接影響成骨和破骨過程［21-22］。研究顯示，CCDC134可以抑制Th1和Th17細胞的功能，并能有效控制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［12］，這也提示CCDC134調(diào)控骨代謝的另一潛在機制。此外，CCDC134還能通過與轉(zhuǎn)錄激活因子hADA2a（human alteration/deficiency in activation 2a）相互作用，抑制其誘導(dǎo)的細胞凋亡和細胞周期抑制，發(fā)揮保護細胞的作用［23］。另有研究發(fā)現(xiàn)，CCDC134通過調(diào)控Wnt信號通路，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及運動神經(jīng)的協(xié)調(diào)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而hDPSCs為神經(jīng)嵴來源的細胞，與神經(jīng)系統(tǒng)具有同源性，可能具有類似的信號調(diào)控途徑［24］。

本實驗明確了CCDC134在hDPSCs成骨分化中的作用及相關(guān)分子機制，進一步完善了CCDC134調(diào)控成骨分化的信號網(wǎng)絡(luò)，為多方位調(diào)控hDPSCs的成骨分化功能，促進其在頜面部骨缺損修復(fù)與再生中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。