鄧文振，田徐騰越，李雪微，董偉，梁永強(qiáng)

1.華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 唐山（063000）；2.口腔疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都（610041）；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，河北 保定（071000）

在固定矯治過(guò)程中，釉質(zhì)白斑病損（white spot lesions，WSLs）發(fā)生率較高，其主要原因?yàn)橥胁壑車(chē)呱锬ぐl(fā)生聚集，菌斑生物膜中產(chǎn)酸菌的濃度升高，如變異鏈球菌和乳酸桿菌［1］，主要癥狀為在牙齒釉質(zhì)表層上出現(xiàn)界限不清楚的白堊色、云霧狀斑塊，為齲壞發(fā)生的初始階段［2］。正畸治療過(guò)程中為降低WSLs的發(fā)生，在粘接劑加入多種抗菌材料。

氯己定是牙科領(lǐng)域最常用的消毒劑之一，它具有持久的抗菌活性，有研究表明氯己定漱口液對(duì)牙菌斑的形成具有一定的抑制作用［3］。Vallet-Regi等［4］首次將介孔硅與布洛芬進(jìn)行聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)介孔硅材料可以作為藥物載體，并具有緩釋藥物的能力。大量研究表明介孔二氧化硅作為藥物載體呈現(xiàn)出較好的負(fù)載能力。Zhang等［5］將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、3%、5%、6.4%的醋酸氯己定（chlorhexidine acetate，CHA）包封于二氧化硅納米粒子（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）中形成CHA@MSNs復(fù)合物，以CHA@MSNs替代復(fù)合樹(shù)脂中硅烷化材料，探討含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs對(duì)繼發(fā)齲的抑制效果，發(fā)現(xiàn)CHA@MSNs在保證材料機(jī)械性能及表面完整性的前提下，可抑制口腔生物膜。但CHA@MSNs能否改性正畸3M粘接樹(shù)脂的抗菌性能和粘接強(qiáng)度尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)以介孔二氧化硅負(fù)載0%、3%、5%、6.4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA，比較其對(duì)菌斑的抑制效果及粘接強(qiáng)度的影響，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

介孔二氧化硅（先豐納米，中國(guó)）；CHA（98%氯己定，Aladdin，美國(guó)）；3M Z350XT流體樹(shù)脂、3M Transbond XT粘接劑（3M，美國(guó)）；37%磷酸牙釉質(zhì)酸蝕劑（天津市合成材料工業(yè)研究所，中國(guó)）；上頜第二前磨牙金屬直絲弓托槽（杭州新亞齒科材料有限公司，中國(guó)）；傅里葉紅外光譜儀（Vector-33，Bruker，美國(guó)）；掃描電鏡（S-4800，日立，日本）。

1.2 負(fù)載CHA的介孔二氧化硅納米粒子的制備與檢測(cè)

稱(chēng)取1g SBA-15、0.3M CHA、15 mL無(wú)水乙醇置入30 mL試劑瓶中。在25℃、600 r/min恒溫磁力攪拌機(jī)上攪拌72 h。用PTFE濾膜過(guò)濾后，在15 mL無(wú)水乙醇中分散，重復(fù)3次。設(shè)置電熱真空干燥箱溫度為90℃，時(shí)間為2 h，獲得白色粉末狀樣品。用傅里葉紅外光譜儀和掃描電鏡對(duì)實(shí)驗(yàn)所得樣品進(jìn)行表征分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將3M Z350XT流動(dòng)樹(shù)脂分為4組，分別為3M+CHA@MSNs（0%）（A組），3M+CHA@MSNs（3%）（B組），3M+CHA@MSNs（5%）（C組）以 及3M+CHA@MSNs（6.4%）（D組），分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0%、3%、5%、6.4%的CHA@MSNs，各組樣品總重量為3 g。

1.4 改性正畸粘接劑抗剪切強(qiáng)度測(cè)定與粘接劑殘留指數(shù)計(jì)分

選取華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科18～22歲因正畸治療而拔除的48顆雙尖牙，分為4組，每組12顆。納入標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)釉質(zhì)脫礦、齲壞、氟斑牙、四環(huán)素牙、釉質(zhì)發(fā)育不全。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)華北理工大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，且患者已簽署知情同意書(shū)。

將離體牙置于去離子水中，用超聲波清洗機(jī)清洗30 min。用氣槍將離體牙牙面吹干，35%磷酸酸蝕劑酸蝕牙面，酸蝕時(shí)間為20 s，用氣槍吹干牙面，直至呈白堊色，用小毛刷將預(yù)處理劑涂布到酸蝕處，光固化5 s，在離體牙頰面臨床冠中心放置上頜第二前磨牙金屬直絲弓托槽，加壓后去除托槽周?chē)辰觿?，在托槽齦方、方、近中和遠(yuǎn)中固化10 s［6］。將離體牙依次置于生理鹽水、37℃恒溫水浴箱中各24 h，對(duì)離體牙用冷熱循環(huán)儀進(jìn)行冷熱循環(huán)1 000次，每次在55℃、5℃循環(huán)各30 s，轉(zhuǎn)移時(shí)間為5 s，后用超硬石膏將其根部包埋。將其固定于萬(wàn)能電子材料試驗(yàn)機(jī)上，調(diào)節(jié)剪切刀刃，使刀刃切緣平行于托槽方兩個(gè)金屬翼與底板間的區(qū)域，且垂直正對(duì)于托槽底板與方托槽翼距離的中央，移速為0.5 mm/min，記錄托槽被剪切下瞬間的最大值和斷裂值，計(jì)算出抗剪切強(qiáng)度。計(jì)算公式如下：剪切強(qiáng)度（MPa）＝最大載荷（N）/托槽底網(wǎng)面積（mm2）［7］。

10倍放大鏡觀察托槽上粘接劑的殘留量，用托槽粘接劑殘留指數(shù)（adhesive remnant index，ARI）計(jì)分［8］。換算方法如下：0分：牙釉質(zhì)上無(wú)殘留粘接劑；1分：牙釉質(zhì)上有粘接劑殘留，面積小于粘接總面積的50%；2分：牙釉質(zhì)上有殘留粘接劑且大于總粘接面積的50%；3分：牙釉質(zhì)上粘接面全部殘留有粘接劑。

1.5 抗菌性能的檢測(cè)

將4組改性粘接樹(shù)脂鋪于96孔板封蓋上凹槽底部，光固化20 s，形成厚0.5 mm、直徑8 mm的樹(shù)脂片，用紫外線將樹(shù)脂片雙面各照90 min，滅菌備用。

本實(shí)驗(yàn)所使用的變異鏈球菌由華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。-80℃冰柜中取出變異鏈球菌菌種，置入4℃冰柜解凍30 min，在BHI培養(yǎng)基中放入菌種（比例為1 000∶1），在恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min，至菌懸液在600 nm處OD值為0.8時(shí)，保留部分菌種，-80℃冰箱中保存。

取4個(gè)24孔板，實(shí)驗(yàn)組各取3個(gè)滅菌后樹(shù)脂片，當(dāng)菌懸液在600 nm處OD值為1時(shí)，各孔隙分別加入1.5 mL菌懸液，放入恒溫箱中培養(yǎng)，溫度為37℃，時(shí)間為48 h，形成變異鏈球菌生物膜，將其轉(zhuǎn)移到新24孔板中，標(biāo)本用2.5%戊二醛固定，4℃冰箱過(guò)夜，分別依次置入25%，50%，75%，90%和100%乙醇中，進(jìn)行梯度脫水，自然晾干，隨機(jī)夾取少量變異鏈球菌生物膜，放置在載物臺(tái)的導(dǎo)電膠上，離子濺射儀噴金后用掃描電鏡掃描。

實(shí)驗(yàn)組每孔加1.5 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液，37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，形成變異鏈球菌生物膜。將變異鏈球菌生物膜連同樹(shù)脂片轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，然后每孔中加入將1 mL MTT染料。37℃恒溫箱培養(yǎng)1 h，變異鏈球菌將黃色的MTT還原為紫色的甲臜，再將其轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，每孔加DMSO的量為1 mL，以溶解甲臜晶體。在智能脫色搖床避光搖20 min后每孔取200μL液體于24孔板中，測(cè)量540 nm處的OD值，生物膜活性越高，OD值越大［9］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。剪切強(qiáng)度和菌液OD540值結(jié)果用表示，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。ARI計(jì)分結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal WallisH多組秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

MSNs為典型的二氧化硅結(jié)構(gòu)，在1 082 cm-1出現(xiàn)Si-O-Si基團(tuán)的特征峰，在CHA與MSNs攪拌混合之后，在3 326.5 cm-1處出現(xiàn)-C＝N-的特征吸收峰；在2 927.7 cm-1和2 854.7 cm-1處出現(xiàn)-CH2-的特征吸收峰，且在CHA@MSNs紅外光譜中也出現(xiàn)了MSNs的特征峰，表明CHA已成功負(fù)載于MSNs之上。見(jiàn)圖1。

Figure 1 Infrared spectroscopic analysis of CHA@MSNs圖1 CHA@MSNs的紅外光譜分析圖

2.2 CHA@MSNs掃描電鏡結(jié)果

MSNs掃描電鏡結(jié)構(gòu)特征為MSNs成簇聚集形成長(zhǎng)桿狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)桿之間界限較為分明。當(dāng)CHA與MSNs結(jié)合后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，界限較為模糊且聚集為層狀結(jié)構(gòu)，可能是由于CHA吸附于MSNs微孔結(jié)構(gòu)之中。見(jiàn)圖2。

Figure 2 SEM images of MSNs and CHA@MSNs圖2 MSNs與CHA@MSNs掃描電鏡圖

2.3 各組抗剪切強(qiáng)度比較

3M樹(shù)脂中所含CHA@MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，其抗剪切強(qiáng)度不斷下降，且與A組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（B組：P＜0.001；C組：P＜0.001；D組：P＜0.001）；其中以D組抗剪切強(qiáng)度最低，與B、C兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（B組：P＝0.011；C組：P＝0.008）；B、C兩組其抗剪切強(qiáng)度無(wú)顯著性差異（P＝0.896）。見(jiàn)表1。

表1 各組正畸粘接劑托槽抗剪切強(qiáng)度比較Table 1 Comparison of the shear strength of the orthodonticadhesive brackets ±s

表1 各組正畸粘接劑托槽抗剪切強(qiáng)度比較Table 1 Comparison of the shear strength of the orthodonticadhesive brackets ±s

CHA@MSNs:CHA was encapsulated in MSNs;MSNs:mesoporous silica nanoparticles;CHA:chlorhexidine acetate;Group A:3M+CHA@MSNs(0%);group B:3M+CHA@MSNs(3%);group C:3M+CHA@MSNs(5%);group D:3M+CHA@MSNs(6.4%);a:compared with group A,P＜0.05;b:compared with group B,P＜0.05;c:compared with group C,P＜0.05

Group（n＝12）Group A Group B Group C Group D FP Shear strength/MPa 12.339±1.570 7.542±1.397a 7.626±1.243a 5.847±1.950abc 38.254＜0.001

2.4 各組ARI計(jì)分比較

在添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs后，牙釉質(zhì)表面其粘接劑的殘留量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但A組其粘接劑殘留指數(shù)主要分布于3分之間，在加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs后，其粘接劑殘留量明顯下降。見(jiàn)表2。

表2 各組正畸粘接劑的粘接劑殘留指比較Table 2 Comparison of ARIof orthodontic adhesives in each group n（%）

2.5 變異鏈球菌生物掃描電鏡結(jié)果

A組變異鏈球菌菌落較為致密，且形態(tài)較為規(guī)則，細(xì)胞膜較為圓滑，在加入CHA@MSNs后，可見(jiàn)B、C、D組菌落稀疏，形態(tài)較不規(guī)則，出現(xiàn)失去細(xì)胞內(nèi)容物的細(xì)胞膜，細(xì)胞膜較為干癟，出現(xiàn)褶皺。見(jiàn)圖3。

Figure 3 Electron microscopy images of each group of Streptococcusmutans biofilms(×2 000)圖3 各組變異鏈球菌生物膜的電鏡圖（×2 000）

2.6 各組菌液OD540值比較

添加的CHA@MSNs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，變異鏈球菌的OD540值越小，B、C、D三組菌液OD540值與A組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（B組：P＝0.037；C組：P＜0.001；D組：P＜0.001）。與B組相比，在C、D兩組的菌液OD540值顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（C組：P＝0.018；D組：P＝0.010），而B(niǎo)、C兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.934）。見(jiàn)表3。

表3 各組變異鏈球菌菌液OD540值的比較Table 3 Comparison of OD540 value of Streptococcus mutans in each group ±s

表3 各組變異鏈球菌菌液OD540值的比較Table 3 Comparison of OD540 value of Streptococcus mutans in each group ±s

Group A:3M+CHA@MSNs(0%);group B:3M+CHA@MSNs(3%);group C:3M+CHA@MSNs(5%);group D:3M+CHA@MSNs(6.4%);a:compared with group A,P＜0.05;b:compared with group B,P＜0.05;CHA@MSNs:CHA was encapsulated in MSNs;MSNs:mesoporous silica nanoparticles;CHA:chlorhexidine acetate

Group(n＝12)Group A Group B Group C Group D FP OD540 value 1.106±0.299 0.905±0.157a 0.676±0.197ab 0.653±0.235ab 10.483＜0.001

3 討 論

固定矯治常導(dǎo)致食物殘?jiān)鼫艏霸黾尤粘？谇恍l(wèi)生保健難度，從而使口腔固有環(huán)境發(fā)生改變，有研究表明正畸治療會(huì)使與牙齦炎相關(guān)的口腔微生物群發(fā)生顯著變化［10］。因此，對(duì)正畸粘接劑改性應(yīng)在保證其粘接強(qiáng)度的前提下，使細(xì)菌在托槽周?chē)掣搅可偌耙种瓶谇晃⑸锷L(zhǎng)。

氯己定為陽(yáng)離子表面活性劑，是一種廣譜抗微生物劑，其作用機(jī)制為破壞微生物細(xì)胞膜。氯己定可與皮膚、黏膜結(jié)合，在與口腔內(nèi)黏膜結(jié)合后可在唾液中停留5 h，口腔黏膜上停留12 h。在低濃度下，氯己定會(huì)導(dǎo)致Ca2+和Mg2+的置換以及細(xì)胞壁中K+的損失，從而產(chǎn)生抑菌效果［11］。氯己定漱口液已被廣泛應(yīng)用于口腔感染輔助治療［12-13］。

研究表明，在粘接樹(shù)脂中直接加入氯己定會(huì)導(dǎo)致樹(shù)脂粘接強(qiáng)度下降、對(duì)水的吸附性增加和CHA釋放后形成多孔表面，且氯己定呈現(xiàn)爆發(fā)式釋放［14-15］。研究發(fā)現(xiàn)，介孔二氧化硅材料具有孔徑大小均勻（介于2～50 nm）、高孔隙率、孔徑可調(diào)的以及高負(fù)載腔的特點(diǎn)，可提供有效的封裝，然后控制釋放，以上特點(diǎn)決定其具有作為無(wú)機(jī)藥物載體的條件［16-17］。

本實(shí)驗(yàn)選擇將CHA負(fù)載于MSNs中，而不選擇氯己定或葡萄糖酸氯己定，原因是三者中氯己定分子量最小，其最易負(fù)載于MSNs中，但氯己定微溶于醇，用物理方法將其包封在MSNs中的量微乎其微，而葡萄糖酸氯己定分子量較大，MSNs介孔直徑約為1 mm，不利于大量負(fù)載，CHA完全溶于醇，水溶性較氯己定好，在MSNs負(fù)載CHA之后容易析出，由于致齲菌在糖酵解過(guò)程產(chǎn)酸，可更好地發(fā)揮抗菌作用。

本實(shí)驗(yàn)中，隨著改性樹(shù)脂中CHA@MSNs比例的增加，其抗剪切強(qiáng)度下降。在CHA@MSNs添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.4%時(shí)，其剪切強(qiáng)度為（5.847±1.950）MPa，而7～9 MPa為正畸托槽粘接所需具備的剪切強(qiáng)度［18］，其已不滿足臨床粘接要求，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的CHA@MSNs的剪切強(qiáng)度為（7.626±1.243）MPa，可以滿足臨床需要。

ARI評(píng)分能夠量化釉質(zhì)表面上殘留的粘接劑，添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的ARI計(jì)分主要集中在2分與3分之間，且不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs不會(huì)影響托槽脫落后牙面的ARI計(jì)分，所以在去除托槽時(shí)，不會(huì)增加損傷牙釉質(zhì)的風(fēng)險(xiǎn)。

在掃描電鏡下將變異鏈球菌放大2 000倍，可以觀察到在加入CHA后，變異鏈球菌形態(tài)發(fā)生改變，說(shuō)明CHA的加入有一定的抗菌作用。牙菌斑生物膜的結(jié)構(gòu)被假設(shè)是由特定的類(lèi)群間物理和化學(xué)相互作用驅(qū)動(dòng)的。環(huán)境壓力包括氧氣張力與宿主因子，宿主因子主要包括促生長(zhǎng)因子、抑制生長(zhǎng)的因子以及其他免疫介質(zhì)［19］。變異鏈球菌分泌的葡糖基轉(zhuǎn)移酶外酶與白色念珠菌細(xì)胞表面結(jié)合并合成葡聚糖［20］。

變異鏈球菌在葡聚糖的介導(dǎo)下聚集于牙面形成菌斑生物膜，細(xì)菌產(chǎn)酸使牙面脫礦破壞，CHA的加入可以破壞其菌斑生物膜。通過(guò)測(cè)量不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs組菌液OD540值可以間接地反映各組粘接劑的抗菌性能。OD540值表示樣本的抗菌性，兩者之間的關(guān)系為反比例。OD540值下降說(shuō)明隨著CHA@MSNs的加入，其抗菌性能明顯增強(qiáng)。當(dāng)加入CHA@MSNs質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%、5%時(shí)的抗菌性能較好，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，3%CHA@MSNs與5%CHA@MSNs均能滿足臨床粘接強(qiáng)度，但5%CHA@MSNs抗菌效果優(yōu)于3%CHA@MSNs。而5%、6.4%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CHA@MSNs抗菌效能較好，但6.4%CHA@MSNs不能滿足臨床粘接強(qiáng)度要求。5%CHA@MSNs在滿足粘接強(qiáng)度的情況下，其抗菌性能良好，且去除托槽時(shí)，牙釉質(zhì)損傷的風(fēng)險(xiǎn)不會(huì)增加。本實(shí)驗(yàn)為CHA@MSNs改性粘接劑用于托槽的粘接提供可能性，但其控釋效能還有待研究。