李國秋 張嘉雪 陳子錚 陳林耿 吳曉怡 張 韌

1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，廣東 廣州 510006

胃癌(Gastric cancer, GC)是中國常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)2018年2月國家癌癥中心發(fā)布的最新一期全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，GC的發(fā)病率和死亡率分列所有腫瘤類型的第2位與第3位[1]。近年來，GC的發(fā)病率呈下降趨勢，新型生物制劑的研發(fā)和綜合治療策略的不斷發(fā)展，降低了GC的致死率，但GC的預后仍然不甚樂觀。中醫(yī)在控制癌癥病灶發(fā)展，延長患者生存期和改善生存質量等方面表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，尤其是中藥可提高人體免疫，調節(jié)腫瘤微環(huán)境的各組分，在腫瘤防治方面具有重要作用[2]。

白術，味苦、甘、微辛，性溫，其用在中，主嘔逆泄利、去濕強脾、開胃進食、和中益氣。《本草通玄》曰：“白術，補脾胃之藥，得中宮沖和之氣，更無出其右者。土旺則能健運，故不能食者，食停滯者，有痞積者，皆用之也?！爆F(xiàn)代藥理研究[3]發(fā)現(xiàn)，白術揮發(fā)油具有抗腫瘤、促進胃腸運動、調節(jié)胃腸功能、促進營養(yǎng)質吸收的功能。茯苓，味甘，性平，主利水實脾，《神農本草經(jīng)疏》記載：“中焦者，脾土之所治也。中焦不治故見膈中瘀水，腹脹大也，利水實脾，則其證自退矣?！爆F(xiàn)代藥理研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，茯苓中的多糖和三萜類成分可保護機體的免疫器官，增強機體免疫功能，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制胃癌細胞生長，抑制癌細胞轉移，清除氧自由基。據(jù)目前相關文獻報道[6]，“白術-茯苓”藥對抗GC的臨床療效顯著，但其具體作用機制尚未見系統(tǒng)闡明。

網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，采用復雜的生物網(wǎng)絡模型，從藥物、化學成分、靶點、疾病間相互作用的整體性與系統(tǒng)性出發(fā)，預測藥物治療疾病的藥理學機制的一種方法，其與中醫(yī)治病的“整體觀”理論及中藥多成分、多靶點、多途徑、多作用的特點具有一致性[7- 8]。故本研究將運用網(wǎng)絡藥理學方法探討“白術-茯苓”藥對抗GC的作用機制。

1 材料與方法

1.1 “茯苓-白術”藥對藥物成分獲取 中醫(yī)藥百科全書(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM)是由中國中醫(yī)科學院中藥研究所、中藥資源中心、北京大學中藥學院等大型單位打造的中醫(yī)藥數(shù)據(jù)平臺，該平臺收錄了403味中藥，7274個中藥成分等數(shù)據(jù)信息，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究提供了強有力的數(shù)據(jù)基礎和分析平臺[9]。

運用ETCM(ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)檢索“白術”和“茯苓”兩者的藥物成分，同時記錄各成分對應的“Pubchem ID”和“Canonical SMILES”。

1.2 “茯苓-白術”藥對藥物成分對應靶點獲取 通過Swiss Target Prediction平臺(http: //www.swisstargetprediction.ch /) 輸入1.1獲得化合物成分的的“Canonical SMILES”格式，預測“茯苓-白術”藥對藥物成分對應的作用靶點。

1.3 “茯苓-白術”藥對抗GC的相關靶點收集 在Genecard數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca/)輸入“gastric carcinoma”檢索GC相關的靶點，刪除其中重復的基因。將獲得的疾病靶點與1.2獲得的成分作用靶點進行比對，最后獲得“茯苓-白術”藥對抗GC的潛在作用靶點。

1.4 “茯苓-白術”藥對抗GC的潛在作用靶點相互作用網(wǎng)絡(Protein Protein interaction，PPI)構建 在string數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，輸入“茯苓-白術”藥對抗GC的潛在作用靶點，設置物種為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認，獲取靶蛋白相互作用數(shù)據(jù)，通過Cytoscape 3.2.1軟件構建PPI網(wǎng)絡，篩選degree值排名前10的靶點。

1.5 KEGG通路富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1) 對“茯苓-白術”藥對抗GC相關靶點進行KEGG通路富集分析，結合P值，從小到大排序，篩選出前10條通路，導出csv文件，對數(shù)據(jù)進行可視化處理。

2 結果

2.1 “茯苓-白術”藥對藥物成分收集 通過ETCM數(shù)據(jù)庫，一共獲得38個化學成分，其中白術14個、茯苓24個，見表1。

表1 “茯苓-白術”藥對藥物成分信息

2.2 “茯苓-白術”藥對抗GC相關靶點 通過Swiss Target Prediction平臺，刪除重復靶點后得到69個“茯苓-白術”藥對藥物成分的作用靶點，接著將這 69個靶點與Genecard、OMIM、Pharmgkb、TTD，和Drug Bank 5個疾病數(shù)據(jù)庫收集到的GC相關基因靶點進行比對，最終得到62個“茯苓-白術”藥對抗GC的相關靶蛋白，見表2。

表2 茯苓-白術”藥對抗GC的62個靶蛋白

2.3 “茯苓-白術”藥對抗GC的潛在作用靶點PPI分析 基于Sring數(shù)據(jù)庫的62個靶蛋白的蛋白質相互作用關系數(shù)據(jù)，采用Cytoscape 3.2.1軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡圖，如圖1所示。此網(wǎng)絡共包括57個節(jié)點，143條邊(若兩個靶蛋白之間存在相互作用關系，則用邊連接兩個靶蛋白)，靶蛋白degree值越大則節(jié)點越大。

圖1 “茯苓-白術”藥對抗GC靶蛋白PPI網(wǎng)絡

同時利用Cytoscape 3.2.1軟件的篩選工具，篩選出該網(wǎng)絡中degree值排名前10 的靶蛋白，分別為TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1。

2.4 KEGG通路富集分析 采用Metascape平臺對“茯苓-白術”藥對抗GC的62 個作用靶點進行KEGG通路富集分析，篩選前10條目(P值從小到大進行排序)，并且通過Excel對結果進行可視化處理。結果如圖2所示。主要通路有Steroid hormone biosynthesis、PPAR signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、Arachidonic acid metabolism、Nitrogen metabolism、Chemical carcinogenesis、Pathways in cancer insulin resistance、Regulation of lipolysis in adipocytes、Leishmaniasis。

圖2 “茯苓-白術”藥對抗GC的KEGG通路富集分析

3 討論

3.1 “白術-茯苓”藥對抗GC相關的重要藥物成分 本研究最終預測得到“白術-茯苓”藥對抗GC的38個活性化合物、62個潛在作用靶點及10條通路，其化合物多樣性、作用靶點多樣性及通路多樣性，從藥理層面及分子層面論證了中藥“同病異治，異病同治”原則。

現(xiàn)代藥理研究[10]證實，白術化學成分主要為揮發(fā)油、白術多糖、氨基酸等成分，這些化學成分有抗炎、抗腫瘤、提高機體免疫力、抗衰老、調節(jié)胃腸等藥理作用，茯苓中具有生物活性的化合物主要為三萜類和多糖類化合物，具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、抗衰老、增強記憶力、調節(jié)泌尿系統(tǒng)、降血糖等[11]。本研究中，白術-茯苓藥對篩選出的化合物含多種抗癌成分，如白術內脂I、白術內脂III、茯苓酸等，白術內酯Ⅰ能夠抑制MGC-803細胞的生長及繁殖，下調GC細胞表面標志物Hey1、CD44的表達，同時也包括抑制Notch信號通路，及降低Notch1、Hes1、Hey1和Jagged1蛋白的活性，從而有效地抑制GCMGC-803細胞的增殖[12]。茯苓酸能抑制GC細胞的生長和克隆形成能力，顯著誘導細胞G2/M期停滯及細胞凋亡，同時調節(jié)一些凋亡相關蛋白如caspase-3,PARP, Bcl-2和Bax的蛋白表達，還能擾亂體外GC線粒體能力和抑制體內GC移植瘤生長。

3.2 “白術-茯苓”藥對抗GC相關的重要作用靶點 在“白術-茯苓”藥對抗GC的PPI網(wǎng)絡中，TNF、CYP19A1、AR、PPARG、AKR1C3、NR3C1、CYP17A1、HSD17B3、PTGS1、SRD5A1在網(wǎng)絡中處于degree值前10名，是“白術-茯苓”藥對抗GC的重要潛在靶點。腫瘤壞死因子(TNF)分為兩種，分別為TNF-α和TNF-β，國外研究報道，GC患者血清中TNF-α水平明顯高于正常人群，手術切除GC組織后患者體內血清中TNF-α水平明顯下降，但轉移或復發(fā)者血清TNF-α水平再度顯著升高，該現(xiàn)象提示TNF-α與GC的發(fā)生發(fā)展密切相關且起到促進作用[13]。毛躍鋒等[14]的研究表明參芪扶正湯能明顯降低Ⅲ～Ⅳ期GC患者血清中TNF-α、IL-6以及SIL-2R水平，與此同時亦能明顯提高患者的免疫功能，提高其生活質量。有研究表明，雄激素受體(AR)在GC組織中高表達，且AR與年齡、性別、腫瘤大小、組織類型等均無明顯相關性。調節(jié)細胞周期諸多因素的關鍵角色是cyclinD1，而性激素可通過與其受體結合，介導某些直接或間接機制促進cyclinD1過度表達，從而促進腫瘤細胞增殖，此外性激素經(jīng)過胃腸道分解和肝內代謝可轉變成低濃度的致癌物，與受體結合時可增強其與細胞核內DNA的親和力，解除對DNA合成的抑制，恢復DNA聚合酶活性，促進細胞增殖，導致細胞惡性增殖的發(fā)生。

3.3 “白術-茯苓”藥對抗GC相關的重要生物通路 根據(jù)KEGG分析結果可知，“白術-茯苓”藥對抗GC的信號通路與“癌癥途徑(pathway in cancer)”最為相關，此外還涉及通路有“類固醇激素合成(Steroid hormone biosynthesis)”“過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路(PPAR signaling pathway)”“神經(jīng)活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)”“花生四烯酸代謝(Arachidonic acid metabolism)”“氮代謝(Nitrogen metabolism)”“化學致癌作用(Chemical carcinogenesis)”“胰島素抵抗(Insulin resistance)”“脂肪細胞中脂肪分解的調節(jié)(Regulation of lipolysis in adipocytes)”。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類由配體激活的核轉錄因子，在激活狀態(tài)下參與調節(jié)許多與消化道腫瘤形成有關的基因，具有抑制增殖、促進凋亡、抑制細胞周期的進程等抗腫瘤作用，被認為是開發(fā)預防治療GC的重要靶點[15]。張順榮等[16]研究發(fā)現(xiàn)，胃復方含藥血漿可通過上調PPARγ基因表達的途徑來抑制 SGC-7901 細胞的增殖，促進其凋亡。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗與GC的患病相關，而GC患者普遍存在糖耐量異常和胰島素抵抗，這有可能是由于GC本身癌組織通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生一些生長因子，從而產(chǎn)生和加重一胰島素抵抗。另有研究[18]認為，高胰島素血癥可加強胰島素樣生長因子(IGF-1)的合成，而IGF-1能夠促進細胞有絲分裂，抑制細胞凋亡，促進上皮細胞轉化，此外還可促進血管內皮生長，因此增加了細胞惡性增殖的概率，減少腫瘤細胞的凋亡。

4 結論與展望

60%的GC患者手術或化療后會在2～3年內復發(fā)轉移，原因在于脫落和逃逸的腫瘤細胞會再次增殖并轉移，而化療藥物藥物對大多數(shù)腺癌缺乏敏感性，常因多藥耐藥導致治療失敗，或患者因無法耐受化療藥物的毒副反應而中斷治療[19-20]。研究[21]證實，中藥治療GC具有多成分、多靶點、毒副作用小、防止術后復發(fā)轉移等優(yōu)點。本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法，篩選出“白術-茯苓”藥對潛在活性化合物，獲取其治療GC的潛在作用靶點， 從“成分-靶點-通路”研究藥物與疾病之間的相互作用規(guī)律，推測“白術-茯苓”藥對的藥效機理，初步闡釋了其治療GC的作用機制。但由于數(shù)據(jù)庫信息的不全面、化合物的濃度及化合物間的相互作用不明確等因素，使得預測結果有一定的局限性和片面性，需要更多的臨床試驗與動物實驗進一步去驗證。