王瑛瑩，朱向蕾，周立晨

(上海動物園, 上海 長寧 200335)

白臀長尾猴(Cercopithecusneglectus)屬靈長目(Primates)、猴科(Cercopithecidae)、長尾猴屬(Cercopithecus)，是20多種舊大陸猴中的一種，屬野生珍稀物種。國內(nèi)外資料文獻關于白臀長尾猴的研究主要集中于飼養(yǎng)、繁殖和行為學等方面[1-2]，相關的血液學方面的研究較少，尚無血常規(guī)檢測指標的相關資料。為進一步了解人工圈養(yǎng)條件下這一野生珍稀物種的生理學特點及生物學特性，本試驗以圈養(yǎng)的9只成年白臀長尾猴為研究對象，用兩種方法測定其血常規(guī)指標并進行對比分析 ； 同時，以人工顯微鏡檢法測得數(shù)據(jù)為參照標準，對全自動血液分析儀和人工顯微鏡檢法檢測白臀長尾猴血細胞數(shù)據(jù)進行分析，探討兩者之間的差異性，為拓展白臀長尾猴血液生理指標的測定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 血液樣本 采自上海動物園圈養(yǎng)白臀長尾猴的血液樣本共9份，全部為成年健康個體，其中雌猴3只，雄猴6只。收集到血樣置于 EDTA-K2真空抗凝管中輕輕顛倒混勻，室溫條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢驗方法

1.2.1 儀器與人工計數(shù)穩(wěn)定性 本實驗室的儀器檢測和人工計數(shù)檢測兩種方法穩(wěn)定可靠，筆者之前采用較為成熟的金絲猴(Rhinopithecus)血液樣本為對象對兩種方法做過驗證，經(jīng)驗證，儀器法和手工計數(shù)穩(wěn)定可靠[3]。

1.2.2 人工鏡檢計數(shù) 取血液樣品20 μL，加入2%冰醋酸380 μL，稀釋樣品并破壞紅細胞，混勻，持續(xù)振蕩5 min，取適量混勻液滴入血細胞計數(shù)板中，顯微鏡下計數(shù)4個大方格內(nèi)白細胞總數(shù)n，則白細胞數(shù)量為(n/20)× 109個/L；取血液樣品20 μL，加入0.9%NaCl溶液3 980 μL，稀釋血細胞，充分混勻后取適量滴入血細胞計數(shù)板中，顯微鏡下計數(shù)5個中方格內(nèi)紅細胞總數(shù)m，則紅細胞數(shù)量為(m/100)×1012個/L。取3 μL血液制成6 cm×2.5 cm血涂片，用瑞氏-吉姆薩染液染色后用低倍鏡觀察血涂片的細胞分布情況，選擇血涂片體尾交界染色良好處，用油鏡計數(shù)100個白細胞進行白細胞分類[4]。檢測環(huán)境溫度為25 ℃左右。

1.2.3 儀器檢驗 采用邁瑞B(yǎng)C-5000Vet 獸用全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)進行白臀長尾猴血常規(guī)儀器檢測。嚴格按照血細胞分析儀的要求定期對血液分析儀進行校準，操作步驟嚴格按照儀器的標準操作規(guī)程進行，并記錄好分析結果是否異常。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)值以平均值±標準差(Mean±SD)表示，對測定的數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗(樣本量不足50，采用Shapiro-Wilk檢驗)。對應的人工計數(shù)和儀器計數(shù)兩組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應用配對樣本t檢驗比較差異性，兩組中只要有一組不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應用非參數(shù)檢驗(兩個相關樣本：Wilcoxon帶符號秩檢驗)比較差異性。采用Spass和Excel做相關性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人工法和儀器法檢測白臀長尾猴血常規(guī) 白臀長尾猴的血液樣本分別用人工鏡檢和全自動血液細胞分析儀進行檢測，每次檢測前都要輕輕顛倒搖勻血液樣本。檢測結果見表1、表2。

表1 白臀長尾猴血常規(guī)人工檢測結果Table 1 Complete blood count of Cercopithecus neglectus by manual method

表2 白臀長尾猴血常規(guī)儀器檢測結果Table 2 Complete blood count of Cercopithecus neglectus detected by instrument method

2.2 儀器法與人工鏡檢法檢測白臀長尾猴血細胞計數(shù)比較 兩種方法檢測白細胞、紅細胞密度差異均不顯著(配對t檢驗，P>0.05)(表3)。表明儀器法與人工鏡檢法應用于白臀長尾猴白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量分析結果基本一致。白細胞分類計數(shù)中中性粒細胞比率差異不顯著(配對t檢驗，P>0.05)，淋巴細胞比率(配對t檢驗)、嗜堿性粒細胞比率(配對t檢驗)、單核細胞比率(Wilcoxon符號秩檢驗)、嗜酸性粒細胞比率(Wilcoxon符號秩檢驗)組間結果具有顯著性差異。表明應用儀器快速檢測白臀長尾猴外周血白細胞分類計數(shù)結果不理想。

表3 人工鏡檢和儀器檢測血常規(guī)指標統(tǒng)計結果Table 3 Statistical results of complete blood count detected by manual and instrument detection

2.3 儀器法與人工鏡檢法檢測白臀長尾猴血細胞結果相關性分析 為了驗證儀器法是否可以代替人工計數(shù)法用于白臀長尾猴血細胞快速準確分析，對兩種計數(shù)方法進行相關性分析。兩種檢測方法的主要線性回歸參數(shù)見圖1。白細胞、紅細胞、淋巴細胞比率、中性粒細胞比率人工鏡檢法和自動分析儀檢測法兩種方法具有極強相關性。兩種方法檢測血紅蛋白結果呈現(xiàn)強相關性。單核細胞比率兩種檢測方法結果呈中等程度相關。

圖1 儀器法與人工鏡檢法檢測結果線性相關分析Fig.1 Linear correlation analysis between the results of instrument and manual detectionA:白細胞計數(shù)； B: 紅細胞計數(shù)； C: 血紅蛋白含量； D: 紅細胞壓積； E: 淋巴細胞比率； F: 單核細胞比率； G: 中性粒細胞比率A: Leukocyte count; B: Red blood cell count; C: Hemoglobin content; D: Hematocrit; E: Lymphocyte ratio; F: Monocyte ratio; G: Neutrophil ratio

3 討論

血液生理常值是反映機體狀況的主要指標,也是疾病診斷和監(jiān)測的重要指標之一[5]。目前，尚未有針對白臀長尾猴血液生理特性方面的研究，展開其血液生理指標方面的基礎研究和探索，將對其飼養(yǎng)繁殖、健康狀況監(jiān)控、血液學特性研究、生長代謝等方面具有重要的意義。同時為動物園野生動物血液生理生化參考值數(shù)據(jù)庫的建立提供補充，進而全面提升動物園在珍稀瀕危物種保護工作中的作用。

本試驗利用儀器法和人工鏡檢法兩種方法測定的雄性白臀長尾猴的白細胞、紅細胞、血紅蛋白等血液生理指標均略高于雌性，這與同為舊大陸猴的食蟹猴[6]、獼猴[7]血液生理三項指標結果一致。代解杰等、周建華等測定的獼猴三項指標則雌性略高于雄性[8-9]，出現(xiàn)這些差異的原因,可能在于動物血液生理生化指標雖反映了機體狀況,但指標的測定不僅受到動物年齡、性別、生理狀態(tài)、生活環(huán)境、營養(yǎng)水平的影響,還受到測定方法以及動物的采食、捕捉時劇烈運動、應激等多種因素的影響[10]。本試驗中兩種方法測定白臀長尾猴雌雄生理指標紅細胞分布寬度-CV有顯著差異，其他值均無顯著差異。本試驗對圈養(yǎng)白臀長尾猴的血液生理指標進行了初步探索,但鑒于動物個體數(shù)量有限，關于白臀長尾猴的血液生理指標參考值尚需進一步完善，盡管如此，本試驗提供的相關血液生理指標為進一步制定和完善白臀長尾猴的血液生理指標提供重要參考。

血細胞分析儀在野生動物疾病的診斷中有重要的應用價值，對提高診斷效率以及準確率，為病患爭取治療時間有積極意義，同時，儀器法較人工鏡檢具有更好的穩(wěn)定性和重復性[11]，因此，探索全自動血細胞分析儀檢測白臀長尾猴血常規(guī)的可行性具有十分重要的意義。邁瑞B(yǎng)C-5000Vet全自動血細胞分析儀目前有犬、貓、猴、羊、牛等檢測通道，猴的檢測通道是以獼猴為模型設置儀器參數(shù)及參考值，依據(jù)白臀長尾猴的種屬，本試驗白臀長尾猴血液檢測通道選擇猴(Primates)。把人工計數(shù)作為檢驗標準，分析兩種方法計數(shù)結果的差異和相關性，來判定全自動血液細胞分析儀檢測白臀長尾猴血常規(guī)的可行性。兩種檢測方法測定的白細胞、紅細胞、血紅蛋白含量結果無顯著差異，且表現(xiàn)出較強的相關性，表明儀器法與人工法應用于白臀長尾猴白細胞計數(shù)、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白含量分析結果基本一致。進一步對白細胞分類計數(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)只有中性粒細胞比率兩者差異不顯著且具有極強相關性，而淋巴細胞比率、單核細胞比率、嗜酸性粒細胞比率、嗜堿性粒細胞比率兩種方法表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，表明以當前實驗條件和參數(shù)設置條件下，全自動血液細胞分析儀不能很好反應白細胞中淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的占比。

臨床上，血細胞分析儀在進行全血細胞分析以及白細胞分類時，會存在一定的假陽性，容易導致臨床誤診，在準確、詳細識別白細胞的形態(tài)，特別是的重要組成部分。我院編寫了《馬場實習手冊》，用以規(guī)范教學目標、培養(yǎng)計劃和考核方式。專門指定有核紅細胞、單核細胞、異形淋巴細胞、原始細胞以及幼稚細胞的形態(tài)方面仍存在缺陷[12]。此外，很多幼齡動物造血功能相當?shù)幕钴S，造成外周血中常見多種幼稚細胞，如有核紅細胞、中、晚幼粒細胞等，這些幼稚細胞往往儀器分析結果造成較大干擾，以使儀器不能對它們進行正確的分類。如果過度依賴儀器檢測的結果從此忽略了白細胞人工顯微鏡檢查，可能會造成疾病的誤診和漏診，導致不合理的治療[13]。本試驗發(fā)現(xiàn)，全自動血細胞分析儀在白臀長尾猴的紅細胞、白細胞、血紅蛋白檢測中效果較為理想，針對白細胞分類計數(shù)需聯(lián)合血涂片進行鏡檢，以保證檢查結果的準確性。