凌悅銘，李寐華，楊 永，楊文莉，范 蓉，伊鴻平，張 紅，張學(xué)軍

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL., 2n= 2x= 24)是國內(nèi)外重要的園藝作物和經(jīng)濟(jì)作物，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)統(tǒng)計(http://www.fao.org/faostat/ zh/#data/QC)，2015～2019年，我國的甜瓜種植面積從35.09×104hm2增加到38.37×104hm2，占全球甜瓜種植面積的36.91 %。甜瓜具有栽培周期短、市場需求量大、經(jīng)濟(jì)效益好、土地利用率和復(fù)種指數(shù)高等優(yōu)點[1]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甜瓜霜霉病是一種由古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.&Curt.)Rostov.]引起的真菌性病害，主要危害甜瓜葉片，發(fā)病初期在葉片上形成水浸狀小斑點，病斑擴(kuò)展后，受葉脈限制呈黃褐色角斑，病斑背面伴有灰黑色霉層產(chǎn)生，最后葉片大面積發(fā)黃甚至枯焦。該病原菌孢子可隨氣流遠(yuǎn)距離傳播，寄主范圍非常廣泛、容易迅速對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性、流行性強(qiáng)、防治難[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界上有17 %殺菌劑用于霜霉病的防治[3]。P.cubensis引起的作物經(jīng)濟(jì)損失在歐洲、中東和亞洲等許多地區(qū)都有報道[4]。甜瓜霜霉病流行年份可使甜瓜減產(chǎn)30 %～50 %，嚴(yán)重70 %～80 %，甚至絕產(chǎn)[5]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，下一代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)為挖掘功能標(biāo)記或目標(biāo)性狀連鎖標(biāo)記及基因快速定位提供了一個新的有效手段。基于全基因組測序的集團(tuán)分離分析法(Bulked segregant analysis, BSA)在不構(gòu)建遺傳圖譜的情況下能高效快速地挖掘目的基因。BSA- Seq技術(shù)已被廣泛應(yīng)用在大田和蔬菜作物研究中，已經(jīng)成功定位出水稻耐鹽[6]、水稻稻瘟病[7]、黃瓜早花[8]、番茄果實重量[9]、大豆疫霉病[10]等基因。【本研究切入點】鑒于BSA- Seq技術(shù)能高效快速地挖掘目的基因，研究擬通過BSA- Seq技術(shù)定位甜瓜抗霜霉病基因，開發(fā)與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記，以期在甜瓜苗期對育種材料進(jìn)行分子輔助選擇，提高篩選效率，加快育種進(jìn)程，解決甜瓜霜霉病危害問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以野生高抗霜霉病資源DM-4和新疆感病自交系DM-2為親本，構(gòu)建F2抗病性分離群體，對抗、感親本和2個極端表型子代混合池進(jìn)行全基因組測序分析，利用SNP(單核苷酸多態(tài)性，Single nucleotide polymorphism)頻率差異分析方法對抗霜霉病性狀標(biāo)記進(jìn)行QTL(數(shù)量性狀基因座，Quantitative trait locus)定位并關(guān)聯(lián)候選區(qū)間，開發(fā)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，應(yīng)用于甜瓜抗病分子育種，也為精細(xì)定位甜瓜抗霜霉病基因及研究甜瓜抗霜霉病的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2019～2021年在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心海南三亞育苗大棚進(jìn)行。抗源DM-4(P1)，引自美國農(nóng)業(yè)部國家植物種質(zhì)資源體系，現(xiàn)新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜中心保存，高抗霜霉病，綠皮帶墨綠斑、圓球型、軟肉、網(wǎng)紋稀不全、品質(zhì)差；感病自交系DM-2(P2)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供，高感霜霉病、黃皮、脆肉、網(wǎng)紋粗密、風(fēng)味好、口感佳。P1×P2雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得1 000個F2單株。從中挑選50個抗病單株和50個感病單株構(gòu)建極端抗、感基因池，用于霜霉病抗性基因定位。

古巴假霜霉菌[Pseudoperonosporacubensis(Berk.&Curt.)Rostov.]采自海南三亞地區(qū)早期自然發(fā)病的甜瓜葉片，單孢子分離后擴(kuò)繁備用。

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜霜霉病抗性的苗期人工接種鑒定

甜瓜霜霉病抗性鑒定材料包括F2群體單株及其雙親，其中雙親P1和P2各30株，F(xiàn)2群體單株1000株，于2019年10月鑒定。鑒定前將種子于68 ℃高溫殺菌后再播入裝有基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，基質(zhì)由椰糠、有機(jī)肥和黃沙按體積8：1：1比例混合均勻而成，基質(zhì)和營養(yǎng)缽都經(jīng)熏蒸滅菌殺毒。

接種方法采用噴霧法[11]進(jìn)行接種，接種濃度為5×103/mL個孢子，接種時期在甜瓜苗期第2片真葉完全展開時，16：00以后進(jìn)行噴霧接種，用微型噴霧器將配制好的孢子懸浮液均勻噴于植株葉片正反面上，直到流水為止，接種后黑暗保濕24 h(相對濕度為80%～90 %)，之后正常管理，夜間保濕，溫度控制在25～30 ℃。接種后15 d調(diào)查發(fā)病情況。參照Criswell(2008)[12]和Epinat C[13，14]的抗性分級標(biāo)準(zhǔn)，并適當(dāng)修正，將病情分為6個級別：0級：無任何癥狀；1級：病斑面積占整個葉片面積的1/10以下；2級：病斑面積占整個葉片面積的1/10～1/4；3級：病斑面積占整個葉片面積的1/4～2/4；4級：病斑面積占整個葉片面積的2/4～3/4；5級：病斑面積占整個葉片面積的3/4以上或者葉片干枯。病情指數(shù)(DI)計算方法：DI=∑(每個病級的植株數(shù)×級別數(shù))/(總植株數(shù)×最高級別數(shù))×100。抗性分級標(biāo)準(zhǔn)：高抗(HR)：0<病情指數(shù)≤10；抗病(R)：10<病情指數(shù)≤20；中抗(MR)：20<病情指數(shù)≤40；感病(S)：40<病情指數(shù)≤60；中感(MS)：60<病情指數(shù)≤80；高感(HS)：病情指數(shù)>80。

1.2.2 基因組DNA提取及測序分析

在F2群體中隨機(jī)選取50株高抗單株和50株高感單株，分別取其幼嫩葉片0.5～1.0 g于液氮中研磨成粉末狀，裝入2.0 mL的離心管。用PlantZol試劑(北京全式金)提取2個親本和F2群體單株葉片基因組DNA，并用核酸檢測儀進(jìn)行檢測，統(tǒng)一稀釋至15 ng/L后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將高抗單株和高感單株幼嫩葉各50份DNA分別等量混合，構(gòu)建極端抗、感池。使用 Illumina HiSeq測序平臺，對2個親本和2個子代池分別進(jìn)行全基因組重測序(委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司)。參考基因組為甜瓜基因組(http://cucurbitgenomics.org/organism/18)。采用GATK3.3軟件進(jìn)行SNP及InDel的檢測。

1.2.3 SNP檢測及關(guān)聯(lián)分析

使用bwa軟件[15]將2個親本重測序獲得的有效測序數(shù)據(jù)reads與參考基因組比對。采用GATK3.3軟件的Unified Genotyper模塊進(jìn)行多個樣本SNP的檢測，使用Variant Filtration進(jìn)行過濾，過濾參數(shù)為-cluster Window Size 4，-filter Expression "QD < 4.0 || FS > 60.0 || MQ < 40.0 " ，-G_filter "GQ<20"?；诨蚍中偷慕Y(jié)果，篩選親本中純和的SNP位點，以親本DM-2為參考親本，分析計算2個子代池在親本間標(biāo)記位點的SNP的頻率(SNP-index)。其中，完全與其相同的SNP-index為0；完全與其不同的SNP-index為1。為減少測序錯誤和比對錯誤造成的影響，對計算出SNP-index后的親本多態(tài)性位點進(jìn)行過濾，過濾標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)過濾掉兩個子代中SNP-index 都小于0.3并且SNP深度都小于7的位點；(2)過濾掉一個子代SNP-index缺失的位點。計算(SNP-index)，即兩個子代SNP-index作差：(SNP- index)= SNP-index(極端性狀B)- SNP-index(極端性狀A(yù))。進(jìn)行1000次置換檢驗，選取95 %和99 %置信水平作為篩選的閾值。結(jié)合抗、感池SNP-indexes的信息，針對基因組位置繪制(SNP-index)圖，分析獲得候選區(qū)間。

1.2.4 InDel標(biāo)記開發(fā)及有效性檢測

采用GATK3.3軟件的Unified Genotyper模塊進(jìn)行InDel的檢測，使用Variant Filtration進(jìn)行過濾，過濾參數(shù)為-filter Expression "QD < 4.0 || FS > 200.0"。在上述獲得的候選區(qū)間內(nèi)篩選插入或缺失片段大于4 bp的InDel位點，根據(jù)親本的InDel信息，截取包含InDel位點上下游各100 bp的序列，并根據(jù)上下游序列設(shè)計引物，Tm為(58±3)℃，引物長度為(20±5)bp，PCR產(chǎn)物大小為200～350 bp，引物由上海生工生物科技有限責(zé)任公司合成。設(shè)計好的InDel引物在 2個親本基因組DNA中進(jìn)行多態(tài)性篩選，用具有多態(tài)性擴(kuò)增的InDel引物在 F2群體上進(jìn)行檢測。

PCR反應(yīng)總體系為：1 μL上下游引物(10 μmol/L)、1 μL DNA模板、5 μL 2×TaqMaster Mix，ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR反應(yīng)程序為：PCR 程序為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)8 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法檢測電泳結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜霜霉病的苗期抗性鑒定

研究表明，2019年10月，抗源DM-4病情指數(shù)為0，近似免疫；DM-2表現(xiàn)為高感，病情指數(shù)為90.00；對 F2群體病情級別繪制頻數(shù)分布圖，群體的病情級別分布圖呈現(xiàn)正態(tài)分布。圖1

圖1 病情級別在F2群體的頻率分布Fig.1 Frequency distnbution of diseaseseverity in F2 population

2.2 測序數(shù)據(jù)

研究表明，對從F2選擇50株高抗單株和50株高感單株分別構(gòu)建高抗池和高感池，與2個親本通過Illumina HiSeq重測序，過濾后得到的堿基數(shù)目為30.276 G，測序質(zhì)量高(Q20≥97.74 %、Q30≥94.94 %)，GC含量在37.12%～37.39 %，樣本與參考基因組比對效率在92.28 %～93.4 %之間，平均覆蓋深度為11.57～21.29X，1X覆蓋度(至少有1個堿基的覆蓋)為96.37%。所有樣本的數(shù)據(jù)量足夠，測序質(zhì)量合格，GC分布正常，建庫測序成功，與甜瓜參考基因組比對效率較高，可用于后續(xù)變異檢測及目標(biāo)性狀的基因定位。表1，2

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量情況匯總Table 1 The quality of sequencing data

表2 測序深度及覆蓋度統(tǒng)計Table 2 Sequencing depth and coverage

2.3 關(guān)聯(lián)分析

研究表明，抗、感池之間存在117×104個不同SNPs。進(jìn)一步過濾SNP，得到高質(zhì)量可信SNP位點95 886個。采用SNP-index算法對這些高質(zhì)量SNP進(jìn)行關(guān)聯(lián)，繪制2個子代池的( SNP-Index)的分布如圖，甜瓜9號染色體21～24 Mb、10號染色體5～6 Mb、7～11 Mb、12～13 Mb和12號染色體21～23 Mb基因組位置的區(qū)域(SNP-Index)超過0.95和0.99置信度，是抗霜霉病基因的候選區(qū)間。其中，在9號染色體上關(guān)聯(lián)到的區(qū)域(SNP-Index)值置信度達(dá)0.99，是甜瓜抗霜霉病主效QTL。圖2

注：橙色曲線代表置信度為0.95的閾值線，綠色曲線代表置信度為0.99的閾值線

2.4 與甜瓜抗霜霉病基因連鎖InDel標(biāo)記的開發(fā)及篩選

研究表明，在9號染色體候選區(qū)域內(nèi)共檢測到2 882個InDel位點。以50 kb為步移區(qū)段，尋找附近堿基缺失4 bp以上的InDel位點，合成37對InDel引物。以高抗霜霉病資源DM-4和感病自交系DM-2的基因組DNA為模板，對37對引物的多態(tài)性進(jìn)行PCR篩選。37對引物均能擴(kuò)增出與預(yù)測大小一致的目標(biāo)條帶，其中9對引物具有多態(tài)性，多態(tài)率為32.14 %。圖2，表3

注：M：Marker I；P1：以高抗霜霉病資源DM-4的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；P2：以感病自交系DM-2的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增

名稱Name正向引物序列5’- 3’Forward primers sequence 5’ - 3’反向引物5’- 3’Reverse primers sequence 5’ - 3’是否具有多態(tài)性Polymorphism or notInDel 1AGGTAAAGCCCCAGAGAGGACCTCCCGTGAAGTTTGGAGT否InDel 2AGTGAATGTGGTCATTGTGCTCCTCCCGTGAAGTTTGGAGT是InDel 3ACACAGCACAACCCAGACAACTACGACCAACCCCCACATG是InDel 4GCACTCTCCAGCCTTGAACTGAGCAAAGGTACCGCTGTCT是InDel 5TTTTCATTCGGATTCCTTGTTGTAAGCTATGAGACCTACGCGC否InDel 6TCAAAGTGACCCCATCCAGTGTGTTTTGAGTTCAACGGGGGA否InDel 7GTGACCCACGATAGGTACACCTCAAGTTTGGGAGATTGGATCA否InDel 8AGCATTCTCCCAGTTTCCCCTGGGAACAAGAAAGTCAGGCA否InDel 9ACACAATGAACCAAGATATTTGCCATGTTTGTAAGCCACTCGACT是InDel 10ACGACACTAAATGACAGTCCGTCCAAAATGGAAACCCATGCCC否InDel 11GCAAAGTTGACCCTCTGTTCGCAGCGTTCTAGGGGTTGGTT否InDel 12TGTGAGAATGACAGCCCACACACATCTCTCAAGAGGCGGA否InDel 13CCTCGCTCTATTTGCATTCACATTTATACGCGTACTAGTTCTCTCA否InDel 14AAAGTCAGGATGGCCGAGTGTCTCTTTCATCAGCGGCGTT是InDel 15TCACAGCTCACAATCACAGGTAGGGGAAGCTGGAGAAGACA是InDel 16ACCTGCCGTCTATCGTGTTTTGAGGTCGGTCCAAACAAGT否InDel 17GCTGCCGTTTCGTTTTCAGTACGACCAAGAAACCCAGGAA否InDel 18CCGTTGATTGCGCTAACACATGCCGCACGAGTATTCACTT是InDel 19AGGAGTTTGGGTATGACACGACTTCTCCCTTTACCCGTTGCC是InDel 20TGGGGTTGCTTGTGGATAGTAGGCGAACACCTTTTGATTCA是InDel 21GGAAGAGGAAGAGGCAGAGGACGAATCATTTCCTCCTCCGA否InDel 22TGCTCTTGAGGCTAGGGCTATAGAGAGGTCCGAGCCCATC否InDel 23TCATTGGCTAGAACTTCGACCACGAAAGTGATGGCCATGGGA否InDel 24AGTGGTTGGTGGTGCATAGGGCAACACTTTGATCCCCACA否InDel 25ACCTCCAAGAAATGAATTCAGGATGAACGACGACGACCAATCT否InDel 26CTTGCAAGGGCTAATGGTGCACGAATCAAAGGTGTAGCCA否InDel 27ACAGTTTAGCTTCCATCCCTACATCGTTTAGGTCATTGTCCTCCA否

續(xù)表3 InDel引物序列信息Table 3 The information of InDel primers

2.5 InDel標(biāo)記在F2分離群體中的鑒定

研究表明，利用抗病親本DM-4、感病親本DM-2以及F2群體中隨機(jī)選取的5株極端抗病和5株極端感病單株DNA作為模板，聚丙烯酰胺電泳反復(fù)試驗驗證這9對引物的多態(tài)性。引物InDel 15和InDel 20在F2群體中隨機(jī)選擇的5個極端抗病單株和5個極端感病單株之間多態(tài)性高、條帶清晰、擴(kuò)增條帶重演性好。進(jìn)一步利用引物InDel 15和InDel 20在F2分離群體的100個單株中進(jìn)行PCR鑒定，引物InDel 15在50個極端抗病單株中，有46個單株的基因型檢測結(jié)果為抗病親本帶型，條帶大小為251 bp；在50個極端感病單株中，有49個單株基因型鑒定結(jié)果為感病親本帶型，條帶大小為349 bp。引物InDel 20在50個極端抗病單株中，49個單株的基因型檢測結(jié)果為抗病親本帶型，條帶大小為231 bp；在50個極端感病單株中，有49個單株基因型鑒定結(jié)果為感病親本帶型，條帶大小為324 bp。該兩個InDel標(biāo)記條帶能區(qū)分出F2群體中極端抗、感單株，并且和親本帶型高度一致，其中引物InDel 15準(zhǔn)確率為95 %，InDel 20準(zhǔn)確率為98 %。圖4

注：圖2A為InDel 15引物擴(kuò)增結(jié)果，其中11：抗霜霉病親本DM-4，12：感霜霉病親本DM-2，1～5：抗病單株，6～10：感病單株；圖2B為InDel 20引物擴(kuò)增結(jié)果，其中2：抗霜霉病親本DM-4，1：感霜霉病親本DM-2，3～7：抗病單株，8～12：感病單株；M均為：DL2000 DNA Marker

3 討 論

世界上對甜瓜霜霉病抗性研究較早，與其他葫蘆科作物相比，已經(jīng)在甜瓜上報道了抗霜霉病材料[16]。Ivanoff[17]報道了4個高抗霜霉病的栽培品種。隨后相繼發(fā)現(xiàn)許多對霜霉病有較好抗性的甜瓜材料。研究選用的母本材料DM-4為野生高抗霜霉病資源，當(dāng)受到霜霉病病原菌侵染時，侵染點附近會產(chǎn)生胼胝質(zhì)，阻止菌絲的延伸，抑制病原菌的生長，這與文獻(xiàn)[18]選用的高抗品種抗病表現(xiàn)一致。

目前已有學(xué)者進(jìn)行了霜霉病抗性基因染色體定位，并開發(fā)出多個與霜霉病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。楊柳燕等[19]以高抗品種DM3和高感品種DF4為材料，獲得了與抗霜霉病基因連鎖的SRAP標(biāo)記me8em11，連鎖距離為9.8 cM；賀玉花等[20]以抗病品種PI 414723為研究材料，發(fā)現(xiàn)了3個與抗霜霉病基因Pc-3連鎖的SSR標(biāo)記DE1887、DE1320和DE0854，遺傳距離分別為26、26和13.69 cM。張學(xué)軍等[21]結(jié)合SSR技術(shù)和QTL分析，檢測到3個霜霉病抗性基因的QTL位點：qR1-1-1、qR2-2-1、qR1-3-1，分別位于chr-5、chr-9和chr-10染色體上。研究利用BSA- seq方法，檢測到高抗野生資源DM-4的抗霜霉病位點定位在9號染色體上，這與張學(xué)軍等[22]研究結(jié)果一致。同時，在10號染色體和12號染色體上也關(guān)聯(lián)到候選區(qū)間，該區(qū)域(SNP-Index)值置信度為0.95。

InDel分子標(biāo)記是不同個體間基因組同一位點的序列發(fā)生堿基的插入或缺失現(xiàn)象，具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強(qiáng)、檢測容易等優(yōu)點[23]，在甜瓜果斑病[24]、蔓枯病[25]和白粉病[26]抗性鑒定中已有研究，但是利用InDel標(biāo)記鑒定甜瓜霜霉病抗性的研究還沒有相關(guān)報道。因此，開發(fā)甜瓜InDel標(biāo)記對于準(zhǔn)確鑒定甜瓜霜霉病抗性、快速培育抗病種質(zhì)和品種具有重要意義。研究利用BSA-seq技術(shù)，在抗霜霉病候選區(qū)間內(nèi)InDel位點設(shè)計37對InDel引物，9對引物具有多態(tài)性，其中引物InDel 15和InDel 20特異性好且條帶清晰，檢測F2群體單株時，擴(kuò)增產(chǎn)物帶型在抗病單株和感病單株之間的差異效果明顯、穩(wěn)定且準(zhǔn)確率高，分別為95 %和98 %，可以用于甜瓜霜霉病抗性鑒定及分子標(biāo)記輔助選擇。同時，研究開發(fā)的與抗霜霉病基因連鎖的InDel分子標(biāo)記，縮小了抗霜霉病基因候選區(qū)間。今后將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步結(jié)合F2:3家系的基因型和表型進(jìn)行精細(xì)定位，克隆抗霜霉病基因并探索在抗霜霉病功能基因上直接開發(fā)分子標(biāo)記，這些共分離的功能標(biāo)記可直接在苗期進(jìn)行霜霉病抗性鑒定。

4 結(jié) 論

將甜瓜抗霜霉病QTL定位在9號染色體21～24 Mb，10號染色體5～6 Mb、7～11 Mb、12～13 Mb和12號染色體21～23 Mb候選區(qū)間。在9號染色體上關(guān)聯(lián)到的區(qū)域(SNP-Index)值置信度達(dá)0.99，為主效QTL，并在此區(qū)域開發(fā)了InDel 15和InDel 20連鎖標(biāo)記，準(zhǔn)確率分別為95%和98%。