任麗萍，邵玉平，王艷，孫靜，楊曉麗，劉楊，趙玲，韓一楠，于艷，方興

1. 遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110005；2. 丹東市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 丹東 118000；3. 大連市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116000；4. 盤錦市疾病預(yù)防控制中心，遼寧 盤錦 124000

甲型肝炎是由甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）感染引起的一種以肝臟炎癥病變?yōu)橹鞯膫魅静。?］。HAV 是小 RNA 病毒科肝病毒屬（Hepatoviruses）的唯一成員，單正鏈RAN，基因組全長約為7 500 bp［1］，包括5′和3′端非翻譯區(qū)和1 個編碼2 227 個氨基酸殘基多聚蛋白的開放閱讀框，多聚蛋白經(jīng)蛋白酶水解可裂解為 P1、P2 和 P3，P1 進(jìn)一步裂解為 VP4、VP3、VP2、VP1，P2 和 P3 分別包括 2A ~ 2C 和 3A~3D 非結(jié)構(gòu)蛋白［2］。根據(jù) VP1 ／ 2A 連接處基因序列，HAV可分為來源于人的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（又可分為A、B 兩種亞型）和來源于猿的Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型［3］。HAV 在環(huán)境中較為穩(wěn)定，以糞-口途徑為主要傳播途徑［3］。甲型肝炎在印度、泰國等發(fā)展中國家或地區(qū)較為流行，在發(fā)達(dá)國家或地區(qū)的流行呈下降趨勢［4］。本文對2019 —2020 年遼寧省沿海城市HAV 基因特征進(jìn)行分析，以期為遼寧省甲型肝炎的防控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 標(biāo)本 2019 年丹東市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者糞便標(biāo)本11 份，盤錦市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者糞便標(biāo)本6 份；2020 年丹東市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者血清標(biāo)本123 份，大連市疾控中心采集的急性期甲型肝炎患者血清標(biāo)本22 份。共162 份標(biāo)本，均于-20 ℃保存，4 ℃條件下運(yùn)輸。

1. 2 主要試劑及儀器 One Step RT-PCR Kit、QIAGEN RNeasy Mini Kit 及 QIAquick Gel Extraction Kit 均購自德國QIAGEN 公司；Big Dye Terminator V 3.0 Cycle Sequecing Ready Reaction Kit 及 ABI3100 測序儀均購自美國ABI 公司。

1. 3 HAV 核酸的提取及擴(kuò)增 用QIAGEN RNeasy Mini Kit 試劑盒提取病毒核酸，以其為模板，通過QIAGEN OneStep RT-PCR Kit 對 HAV VP1 ／2A 序列進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增。第1 輪擴(kuò)增特異性引物為HAV-1F：5′-GACAGATTCTACATTTGGATTGGT-3′，HAV1R：5′-CCATTTCAAGAGTCCACACACT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為512 bp；以第1 輪PCR 產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2 輪PCR擴(kuò)增，第2輪擴(kuò)增特異性引物為HAV2F：5′-CTATTCAGATTGCAAATTACAAT-3′，HAV2R：5′-AACTTCATTATTTCATGCTCCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為392 bp。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火25 s，72 ℃延伸 1 min，共 35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1. 4 序列測定及結(jié)果分析 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick Gel Extraction Kit 膠純化試劑盒純化后，采用ABI3100測序儀進(jìn)行序列測定。通過GenBank（https：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／）對序列進(jìn)行在線比對分析，鑒定基因型。

1. 5 親緣關(guān)系進(jìn)化樹的構(gòu)建 應(yīng)用Mega 6. 0 軟件對獲得PCR 陽性樣本的HAV 基因序列進(jìn)行分析，通過Neighbor-Joining 方法構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹，分析基因序列同源性。選取28 個代表序列，并從GenBank 中下載全球HAV 不同型別的基因序列，通過Neighbor-Joining 方法構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹，進(jìn)行核苷酸同源性分析。

2 結(jié) 果

2. 1 標(biāo)本的鑒定 2019 年丹東市的11 份甲型肝炎糞便標(biāo)本均呈PCR 陽性，陽性率為100%；盤錦市的6 份甲肝糞便標(biāo)本中，4 份為PCR 陽性，陽性率為66. 67%。2020 年丹東市的123 份血清標(biāo)本中，90份為PCR 陽性，陽性率為73. 2%；大連市的22 份血清標(biāo)本均為PCR 陽性，陽性率為100%。

2. 2 序列分析 將測序獲得的HAV VP1 ／ 2A 序列通過GenBank 在線比對分析，判定2019 — 2020 年遼寧省沿海城市流行的HAV 為ⅠA 基因型。

2. 3 親緣關(guān)系進(jìn)化樹分析 2019—2020 年遼寧省沿海城市流行的HAV VP1 ／ 2A 區(qū)核苷酸序列同源性達(dá)97%以上。PCR 擴(kuò)增呈陽性的127 份樣本HAV 基因序列構(gòu)建親緣關(guān)系進(jìn)化樹，可分為2 個進(jìn)化分支（分支1 和分支2），見圖1。分支1 及分支2 與日本、韓國流行HAV 的核苷酸序列同源性分別達(dá)98. 8% ~100%和98. 4% ~ 100%，見圖2。表明2019 — 2020年遼寧省沿海城市流行的HAV 與日本、韓國等國家或地區(qū)的HAV 同源性較高，屬于同一進(jìn)化分支。

圖1 2019 — 2020 年遼寧省沿海城市流行的HAV 親緣關(guān)系進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of HAV epidemic in coastal cities of Liaoning Province from 2019 to 2020

圖2 2019 — 2020 年遼寧省沿海城市流行的HAV 與其他國家或地區(qū)HAV 的親緣關(guān)系進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of HAV in coastal cities of Liaoning Province and in other countries or regions from 2019 to 2020

3 討 論

Ⅰ型HAV 廣泛流行于美洲、歐洲、亞洲等全球各地［5-9］；Ⅲ型 HAV 主要流行于伊朗、印度、尼泊爾、阿富汗、土耳其、韓國等亞洲國家或地區(qū)［10］；Ⅱ型HAV 僅在法國、美國等少數(shù)國家或地區(qū)有報道［11］，有研究表明，在中非等地區(qū)，Ⅱ型HAV 長期流行，法國的Ⅱ型HAV 流行病學(xué)調(diào)查顯示，多數(shù)患者均具有非洲旅行史［12］。俄羅斯流行的HAV 以ⅠA 型為主，并伴有ⅢA 基因型［13］；土耳其流行的 HAV 有ⅠA、ⅢA 兩種基因型［10］；委內(nèi)瑞拉等南美國家或地區(qū)流行的 HAV 以ⅠA 型為主［14］；韓國則以ⅠA、ⅠB、ⅢA 3 種基因型為主［9］。中國流行的HAV 基因型為Ⅰ型，未見Ⅱ、Ⅲ型相關(guān)報道，多數(shù)省份流行的基因型為ⅠA 型，河南新鄉(xiāng)等少數(shù)地區(qū)有ⅠB 基因型流行［15-17］。本實(shí)驗(yàn)對2019 — 2020 年遼寧省甲型肝炎發(fā)病率較高的盤錦、丹東和大連市急性期甲型肝炎患者血清或糞便標(biāo)本進(jìn)行了PCR 擴(kuò)增和測序分析，結(jié)果表明，遼寧省沿海地區(qū)流行的HAV 均為ⅠA 型，分為 2 個進(jìn)化分支，其 VP1 ／ 2A 序列與日本、韓國等國家或地區(qū)流行的HAV 高度同源，屬于同一個大進(jìn)化分支；與浙江、石家莊等地的HAV 進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。WANG 等［17］研究也表明，新疆、寧夏、河北、河南等地流行的HAV 與日本、韓國等地區(qū)流行的HAV 屬于不同的進(jìn)化分支。

2008 年，甲型肝炎疫苗納入兒童免疫規(guī)劃，遼寧省甲型肝炎發(fā)病整體下降，2014 — 2016 年出現(xiàn)一次流行，主要發(fā)生在丹東、大連地區(qū)，冬春季節(jié)為高發(fā)期，季節(jié)分布性明顯［18-19］。大連市對2020 年1 —2 月報告的病例流行病學(xué)調(diào)查表明，80%以上病例有生食或半生食海鮮的習(xí)慣［19］；泰國對貝類海產(chǎn)品的一項(xiàng)研究表明，3. 8%的貝類海產(chǎn)品中檢測到ⅠA型HAV［20］；意大利西西里地區(qū)在貝類研究中發(fā)現(xiàn)，13%的貝類海產(chǎn)品中檢測到Ⅰ型HAV，并檢測到腸道病毒、諾如病毒、腺病毒等病毒［21］。海產(chǎn)品的污染和當(dāng)?shù)厣澈ｕr的習(xí)慣可能是大連和丹東市HAV 冬春季節(jié)高發(fā)的重要原因。本研究為遼寧省甲型肝炎的防控提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。遼寧省非沿海地區(qū)流行HAV 的流行基因型監(jiān)測，及其與沿海地區(qū)間的關(guān)聯(lián)性有待進(jìn)一步深入研究。