陳明珠 廖婉婷 黃幼霞

泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，福建泉州 362011

抑郁癥是一類情感精神障礙性疾病，為全球三大疾病負(fù)擔(dān)之一[1]，其發(fā)生與皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）水平相關(guān)[2]。皮質(zhì)酮長期給藥能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抑郁樣行為，該模型可用于抗抑郁藥的篩選評(píng)價(jià)及機(jī)制研究[3-4]。藥物是治療抑郁癥的主要手段，中藥因安全性高、靶點(diǎn)多樣化等受到臨床廣泛關(guān)注。在治療抑郁癥的方劑中，丹參應(yīng)用頻次很高[5]，其可改善利血平誘導(dǎo)的小鼠抑郁癥狀[6]。隱丹參酮是丹參中活性較強(qiáng)的成分，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化、抗腫瘤等作用[7-9]，在抗抑郁方面有一定的潛力。本研究通過慢性皮質(zhì)酮注射誘導(dǎo)小鼠抑郁模型，觀察隱丹參酮的抗抑郁作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

隱丹參酮（上海源葉生物科技有限公司，含量≥97%，批號(hào)：S31670）；氟西汀膠囊（禮來蘇州制藥有限公司，批號(hào)：9833A）；皮質(zhì)酮（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S30265）；CORT、促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，批號(hào)：E202008）。

1.2 動(dòng)物

KM 小鼠60 只，SPF 級(jí)，雄性，體重18～22 g。北京華阜康生物科技股份有限公司供應(yīng)，合格證號(hào)：1103222011005746，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）：2019-0008。本研究經(jīng)泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，恒溫，恒濕，自由攝食飲水。

1.3 研究方法

60 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、氟西汀組（20 mg/kg）、隱丹參酮低劑量組（10 mg/kg）、隱丹參酮中劑量組（20 mg/kg）、隱丹參酮高劑量組（40 mg/kg），每組10 只。正常對(duì)照組每天皮下注射生理鹽水10 ml/kg，其余五組每天給予皮質(zhì)酮20 mg/kg。皮質(zhì)酮給藥0.5 h 后，氟西汀組和隱丹參酮各劑量組灌胃給藥1 次，正常對(duì)照組和模型組給予等量的生理鹽水，連續(xù)給藥21 d。小鼠出現(xiàn)體重增長緩慢、糖水消耗比降低及行為絕望現(xiàn)象即建模成功[10-11]。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 糖水偏好測(cè)試及體重增加值 小鼠禁食禁水24 h，給予預(yù)先稱重的2 %蔗糖水和純水各1 瓶，飲用2 h。測(cè)定液體消耗量，并計(jì)算糖水消耗比。糖水消耗比=蔗糖水溶液消耗量/（蔗糖水溶液消耗量+純水溶液消耗量）×100%。實(shí)驗(yàn)第22 天測(cè)定小鼠體重增加值。

1.4.2 行為學(xué)測(cè)試 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：小鼠放入水溫（25±2）℃，長20 cm，寬20 cm，水深15 cm 的水桶中強(qiáng)迫游泳6 min。適應(yīng)2 min 后，記錄后4 min 內(nèi)累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：小鼠置于250 mm×250 mm 的曠場(chǎng)箱內(nèi)正中央方格，視頻分析系統(tǒng)記錄5 min 內(nèi)的中央格停留時(shí)間、直立次數(shù)、水平穿越格數(shù)、修飾次數(shù)。水迷宮實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行定向航行試驗(yàn)，記錄第5 天小鼠逃避潛伏期。第6 天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間及站臺(tái)周圍活動(dòng)路程。

1.4.3 CORT、ACTH、BNDF 檢測(cè) 采用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，眼球取血，分離血清，然后將小鼠斷頭取腦，分離海馬組織和前額葉皮質(zhì)，制備勻漿，取上清液。使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定CORT、ACTH 和BDNF 含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組體重情況及行為學(xué)測(cè)評(píng)結(jié)果比較

2.1.1 各組體重增加值、糖水消耗比和不動(dòng)時(shí)間比較 模型組體重增加值、糖水消耗比低于正常對(duì)照組，不動(dòng)時(shí)間長于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。隱丹參酮各劑量組體重增加值高于模型組，隱丹參酮中、高劑量組糖水消耗比高于模型組，不動(dòng)時(shí)間短于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。見表1。

表1 各組體重增加值、糖水消耗比和不動(dòng)時(shí)間比較（）

表1 各組體重增加值、糖水消耗比和不動(dòng)時(shí)間比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01

2.1.2 各組中央格停留時(shí)間、水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù)比較 模型組中央格停留時(shí)間長于正常對(duì)照組，水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)少于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。隱丹參酮各劑量組中央格停留時(shí)間短于模型組，水平穿越格數(shù)、修飾次數(shù)多于模型組，隱丹參酮中、高劑量組直立次數(shù)多于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。隱丹參酮中、高劑量組中央格停留時(shí)間短于隱丹參酮低劑量組，水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)、修飾次數(shù)多于隱丹參酮低劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 各組中央格停留時(shí)間、水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù)比較（）

表2 各組中央格停留時(shí)間、水平穿越格數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù)比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與隱丹參酮低劑量組比較，cP ＜0.05，ccP ＜0.01

2.1.3 各組逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和站臺(tái)周圍活動(dòng)路程比較 模型組逃避潛伏期長于正常對(duì)照組，目標(biāo)象限停留時(shí)間、站臺(tái)周圍活動(dòng)路程短于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。隱丹參酮中、高劑量組逃避潛伏期短于模型組，目標(biāo)象限停留時(shí)間、站臺(tái)周圍活動(dòng)路程長于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。隱丹參酮高劑量組逃避潛伏期短于隱丹參酮低、中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和站臺(tái)周圍活動(dòng)路程比較（）

表3 各組逃避潛伏期、目標(biāo)象限停留時(shí)間和站臺(tái)周圍活動(dòng)路程比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aP ＜0.05，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與隱丹參酮低劑量組比較，cP ＜0.05；與隱丹參酮中劑量組比較，dP ＜0.05

2.2 各組血清CORT、ACTH 含量比較

模型組CORT 和ACTH 含量高于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。隱丹參酮各劑量組CORT 水平低于模型組，隱丹參酮中、高劑量組CORT、ACTH 水平低于隱丹參酮低劑量組，隱丹參酮高劑量組CORT 水平低于隱丹參酮中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。見表4。

表4 各組血清CORT、ACTH 含量比較（）

表4 各組血清CORT、ACTH 含量比較（）

注：與正常對(duì)照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bP ＜0.05，bbP ＜0.01；與隱丹參酮低劑量組比較，ccP ＜0.01；與隱丹參酮中劑量組比較，dP ＜0.05。CORT：皮質(zhì)酮；ACTH：促腎上腺皮質(zhì)激素

2.3 各組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 含量比較

模型組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 含量低于正常對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。隱丹參酮中、高劑量組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 含量高于模型組和隱丹參酮低劑量組，隱丹參酮高劑量組海馬BDNF 含量高于隱丹參酮中劑量組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表5。

表5 各組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 含量比較（pg/g，）

表5 各組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 含量比較（pg/g，）

注：與正常對(duì)照組比較，aaP ＜0.01；與模型組比較，bbP ＜0.01；與隱丹參酮低劑量組比較，ccP ＜0.01；與隱丹參酮中劑量組比較，ddP ＜0.01。BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

3 討論

長期大量糖皮質(zhì)激素給藥會(huì)導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）功能紊亂，誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抑郁樣行為[13-14]。與經(jīng)典的CUMS 模型比較，皮質(zhì)酮抑郁模型的造模周期短，且對(duì)動(dòng)物的傷害較小[4]。抑郁的行為學(xué)檢測(cè)方法中，糖水偏好測(cè)試可以反映快感消失，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊从澈闷婧妥晕姨剿餍袨?，?qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)則能評(píng)價(jià)行為絕望程度[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮給藥后可明顯改善皮質(zhì)酮抑郁模型小鼠的行為學(xué)測(cè)評(píng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示隱丹參酮具有一定治療作用。HPA 亢進(jìn)是抑郁癥發(fā)病的重要原因，慢性應(yīng)激促使HPA 過度激活，血清ACTH和CORT 大量分泌，高濃度的CORT 選擇性損傷大腦海馬神經(jīng)元，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[17-19]，而小鼠的記憶力減退與抑郁樣表型之間存在關(guān)聯(lián)[20]。水迷宮測(cè)試可以評(píng)價(jià)小鼠的長期空間記憶能力[21]。本研究中，通過長期給予小鼠CORT，模擬HPA 亢進(jìn)，結(jié)果顯示小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力障礙、血清ACTH 和CORT 含量增加，而隱丹參酮能夠?qū)惯@種現(xiàn)象，提示其能改善抑郁小鼠的空間記憶能力和認(rèn)知障礙，該作用可能與調(diào)節(jié)HPA 有關(guān)。

BDNF 在海馬、大腦皮層、下丘腦等部位均有高表達(dá)量[22]，其對(duì)神經(jīng)元的存活、增殖分化及再生促進(jìn)起重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者海馬及前額葉皮質(zhì)BDNF 表達(dá)水平減少[24]，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與腦內(nèi)BDNF 表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致神經(jīng)元萎縮，進(jìn)而引起神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞缺失有關(guān)[25]。而抗抑郁藥物通過上調(diào)BDNF 水平，能改善抑郁相關(guān)癥狀[26-27]。本研究中，隱丹參酮可提高小鼠海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF 表達(dá)水平，提示其抗抑郁作用與改善腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子有關(guān)。

綜上所述，隱丹參酮能改善皮質(zhì)酮誘導(dǎo)抑郁小鼠的抑郁樣行為，中、高劑量組效果較為明顯，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPA 和腦內(nèi)BDNF 表達(dá)水平有關(guān)。