蔣鵬飛 姚 震▲ 歐 晨 楊毅敬 彭 俊 徐 劍 彭清華▲

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病與視功能保護(hù)工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科，湖南長沙 410007；4.上海市東方醫(yī)院眼科，上海 200120

視網(wǎng)膜色素變性（retinitsi pigmentosa，RP）是一種眼科常見的難治性遺傳性視網(wǎng)膜疾病[1-3]，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者在40 歲左右便喪失有用視力。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，具有抗原提呈、吞噬消化和免疫調(diào)節(jié)等作用[4-6]，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞在一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性損傷中具有促進(jìn)神經(jīng)元存活的作用，而在一些慢性損傷中作用卻相反[7-10]。RP 存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡，而這種死亡極有可能由小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)，腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵靶點(diǎn)，本研究通過檢測rd10 小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β 的表達(dá)，以期能明確補(bǔ)虛活血中藥枸杞子丹參對RP 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

枸杞中藥超微配方顆粒規(guī)格為3 g/袋（相當(dāng)于臨床成人中藥配方使用量10 g），許可證號：湘20150006，批號：190247，湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)；丹參中藥超微配方顆粒：規(guī)格為2.8 g/袋（相當(dāng)于臨床成人中藥配方使用量10 g），許可證號：湘20150006，批號：190131，湖南春光九匯現(xiàn)代中藥有限公司生產(chǎn)；維生素A 軟膠囊（批號：140701，青島雙鯨藥業(yè)有限公司生產(chǎn)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57 種系Pde6b 基因突變（Pde6b，-/-）rd10 小鼠40 只，鼠齡4 周，體重18～20 g，購自美國JAX 實(shí)驗(yàn)室，證書編號：NO.1911A11353；C57 野生型（Pde6b，+/+）小鼠8 只，鼠齡4 周，體重20～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，證書編號：NO.43004700062254。實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室倫理審批。

1.3 主要試劑儀器

TNF-α 抗體（abcam 公司，貨號：ab183218）；IL-1β抗體（abcam 公司，貨號：ab254360）；RIPA 裂解液（中國上海碧云天，貨號：P0013B）；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（中國北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，貨號：CW2569）。搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-92）；恒溫箱（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C）；精密pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，型號：E-201-C）。

1.4 分組方法

將40 只rd10 小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為五組，每組8 只，分別為模型組、對照組、枸杞組、丹參組、杞參組。8 只C57 野生型小鼠為空白組。每組雌雄鼠分開飼養(yǎng)。

1.5 給藥方法

所有小鼠在SPF 級動(dòng)物房進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后給予灌胃處理，灌胃28 d，灌胃劑量為20 ml/（kg·d），每天灌胃1 次。模型組和空白組灌胃生理鹽水，對照組灌胃維生素A 溶劑，枸杞組灌胃枸杞子中藥配方顆粒溶液，丹參組灌胃丹參中藥配方顆粒溶液，杞參組灌胃枸杞子加丹參中藥配方顆粒溶液。

1.6 取材方法

灌胃結(jié)束后第1 天取材，取材前禁食12 h。10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉動(dòng)物，75%酒精消毒rd10 小鼠雙眼眼周，用眼科彎組織剪摘除眼球，保存于-80℃冰箱中，供Western blot 及實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）檢測。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.7.1 RT-qPCR 法檢測TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量①提取RNA。將分離好的視網(wǎng)膜約0.02 g 與1 ml Trizol 置于勻漿器充分研磨、混勻，12 000 r/min 離心15 min，離心半徑為95 mm，棄上清，晾干后加入無菌無酶水，待沉淀完全溶解，取2 μl 溶液用于RNA 濃度和純度檢測。②逆轉(zhuǎn)錄RNA，反應(yīng)體系（表1）。③RTqPCR 實(shí)驗(yàn)，從NCBI 獲取目的基因序列（表2），采用primer5 軟件設(shè)計(jì)引物。

表1 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（30 μl）

表2 目的基因序列

1.7.2 Western blot 法檢測TNF-α、IL-1β 蛋白灰度值 ①蛋白樣本提?。簩⒁暰W(wǎng)膜組織與RIPA 裂解液一同充分研磨，離心后取上清。②制膠。③電泳。④轉(zhuǎn)膜：打開轉(zhuǎn)膜夾，按順序鋪好濾紙、NC 膜和膠，清除氣泡。啟動(dòng)儀器，恒流300 mA。⑤封閉：將轉(zhuǎn)好的膜取出漂洗，浸入配置好的封閉液中靜置90 min。⑥孵育一抗（表3）。⑦孵育二抗（表4）。每次孵育結(jié)束后，1×PBST 洗滌10 min，重復(fù)3 次。⑧顯影：將膜轉(zhuǎn)入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑中孵育1 min，然后吸盡發(fā)光液，塑封膜包裹雜交膜，暗盒中X 膠片曝光、顯影。⑨掃描底片，用quantity one 軟件分析灰度。

表3 一抗信息

表4 二抗信息

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t 分析。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量

與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)量升高（P ＜0.05），與模型組比較，枸杞組、丹參組、杞參組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量降低（P ＜0.05），與枸杞組比較，杞參組IL-1β mRNA相對表達(dá)量降低（P ＜0.05），與丹參組比較，杞參組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量降低（P ＜0.05）。見表5。

表5 各組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量比較（）

表5 各組TNF-α、IL-1β mRNA 相對表達(dá)量比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與枸杞組比較，cP ＜0.05；與丹參組比較，dP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β

2.2 各組小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量

與空白組比較，模型組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量升高（P ＜0.05），與模型組比較，枸杞組、丹參組、杞參組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量降低（P ＜0.05），與枸杞組比較，杞參組TNF-α、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量降低，與丹參組比較，杞參組TNF-α、IL-1β蛋白相對表達(dá)量降低（P ＜0.05）。見圖1、表6。

圖1 各組小鼠視網(wǎng)膜目的蛋白表達(dá)條帶圖

表6 各組TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比較（）

表6 各組TNF-α、IL-1β 蛋白平均灰度值比較（）

注：與空白組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與枸杞組比較，cP ＜0.05；與丹參組比較，dP ＜0.05。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1β：白細(xì)胞介素-1β

3 討論

古今醫(yī)家對RP“虛”的病機(jī)認(rèn)識較為一致[11]，均認(rèn)為在RP 病程中始終伴隨著“虛損”，彭清華教授率先在國內(nèi)論證了RP 患者存在虛中夾瘀之證。針對RP 虛中夾瘀的病機(jī)，彭清華教授提出以補(bǔ)虛活血法治療RP，前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)虛活血中藥能誘導(dǎo)RP 動(dòng)物模型視網(wǎng)膜αB 多肽mRNA 的表達(dá)，抑制凋亡相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)，進(jìn)而減少RP 動(dòng)物模型視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡，保護(hù)視網(wǎng)膜超微結(jié)構(gòu)[12-17]。

實(shí)驗(yàn)研究表明[18-22]，枸杞子能夠通過抗氧化、抗衰老、抗凋亡作用機(jī)制起到保護(hù)視細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的作用。丹參大量應(yīng)用在與眼底血管相關(guān)性疾病的治療中，有研究表明其在減輕視網(wǎng)膜色素上皮光損傷、抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞炎癥增殖等方面也有一定的作用[23]。

大量研究表明小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移活化與視細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[24-25]，而TNF-α 和IL-1β 是小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也是促凋亡因子。本研究顯示，與空白組野生型小鼠比較，rd10 小鼠視網(wǎng)膜TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表達(dá)明顯增高，TNF-α、IL-1β 可能是RP 病變中的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)。本研究以補(bǔ)虛活血代表性藥物枸杞子丹參干預(yù)rd10 小鼠，發(fā)現(xiàn)枸杞子丹參能明顯抑制rd10 小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β蛋白及mRNA 的表達(dá)，雖然枸杞子與丹參也能抑制rd10 小鼠視網(wǎng)膜中TNF-α、IL-1β 蛋白及mRNA 的表達(dá)，但其效果低于枸杞子與丹參聯(lián)用，這提示補(bǔ)虛活血法治療RP 優(yōu)于單純補(bǔ)虛法或單純活血法。

綜上所述，補(bǔ)虛活血中藥枸杞子丹參治療RP 的機(jī)制可能是通過抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵靶點(diǎn)TNF-α、IL-1β，但其具體作用的上下游基因及通路仍然不明確，今后在對補(bǔ)虛活血中藥枸杞子丹參治療RP的機(jī)制研究中，可著重觀察其對小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，以了解其機(jī)制。