尹謝添 趙詩(shī)超 向 楠 陳繼東,5 曾明星 周廣文

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖北武漢 430061；3.向楠名醫(yī)工作室，湖北武漢 430061；4.湖北省中醫(yī)院老年病科，湖北武漢 430061；5.湖北省中醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北武漢 430061；6.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430061；7.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北武漢 430061

甲狀腺相關(guān)性眼?。╰hyroid-associated ophthal mopathy，TAO），又稱為格雷夫斯眼?。℅raves’disease，GD）和甲狀腺眼病是一種以眼球后及眼眶周圍組織浸潤(rùn)性病變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?。TAO 以40～60 歲女性多發(fā)，男女患病比例為1∶5[1]，總發(fā)病率約為0.0422‰[2]。20%～50%的格雷夫斯病患者有眼部受累表現(xiàn)[3]，其中5.0%～8.6%的患者會(huì)發(fā)展成嚴(yán)重階段[4]，如導(dǎo)致甲狀腺功能障礙性視神經(jīng)病變（dysthyroid optic neuropathy，DON）和暴露性角膜潰瘍等[5]。TAO 臨床癥狀輕者以眼睛充血、畏光、流淚、異物感、疼痛為主要表現(xiàn)；臨床癥狀重者以眼瞼閉合不全、復(fù)視、眼球運(yùn)動(dòng)障礙、失明為主要表現(xiàn)[6]。其治療包括基本治療（戒煙、眼睛局部治療），維持甲狀腺功能穩(wěn)定治療，針對(duì)突眼治療（糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、硒劑、利妥昔單抗、妥珠單抗、放射治療、手術(shù)治療）和中草藥治療等[7]。本病對(duì)患者生活質(zhì)量、精神狀況常造成重大影響。TAO 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為其病因病機(jī)主要與環(huán)境因素、遺傳因素和免疫因素有關(guān)，尤其是免疫因素常被認(rèn)為是TAO 發(fā)生和進(jìn)展的核心因素[8]。為了明確其相關(guān)免疫機(jī)制設(shè)計(jì)本研究，以期通過(guò)數(shù)據(jù)挖掘的方式得出相關(guān)結(jié)論，以便未來(lái)能夠更好地為臨床服務(wù)。

1 資料與方法

1.1 TAO 差異表達(dá)基因獲取與熱圖、火山圖繪制

使用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，搜索“Graves disease”，物種限制為人，對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選。選定TAO 前眼眶表達(dá)基因作為試驗(yàn)組，正常人前眼眶表達(dá)基因作為對(duì)照組。使用R 軟件，設(shè)定P ＜0.05，log FC＞0.5，進(jìn)行差異基因分析，正數(shù)代表上調(diào)，負(fù)數(shù)代表下調(diào)，獲取上調(diào)和下調(diào)最顯著的前20 個(gè)基因繪制熱圖，同時(shí)繪制火山圖，并將所得的差異基因?qū)氡砀裰小?/p>

1.2 核心的差異基因獲取

將得到的兩組差異基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中，選定物種為人，設(shè)定作用閾值“highest confidence=0.900”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中離散的點(diǎn)，默認(rèn)其余參數(shù)，得出差異基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，對(duì)該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，計(jì)算degree 值，其值越高提示該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的地位越核心，并以圖形展示結(jié)果。

1.3 差異基因的GO 和KEGG 富集分析

通過(guò)R 軟件，將上述差異基因進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 富集分析。設(shè)置篩選條件為P value Cutoff＜0.05 顯示排名靠前的10 條GO 生物過(guò)程和20 條KEGG通路，繪制柱狀圖及氣泡圖。

1.4 獲取免疫浸潤(rùn)矩陣

CIBERSORT 反卷積算法是基于線性支持向量回歸的機(jī)器學(xué)習(xí)方法，是一種用于評(píng)估組織中22 種免疫細(xì)胞占比的計(jì)算方法。實(shí)驗(yàn)基于R 軟件，鏈接CIBERSORT 反卷積法進(jìn)行B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、T 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等22 種免疫細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征矩陣模擬計(jì)算，計(jì)算次數(shù)設(shè)置在100 次，對(duì)P ＜0.05 的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.5 免疫細(xì)胞間的相關(guān)性分析和組間差異分析

將上述在CIBERSORT 反卷積法中得到的P ＜0.05的可信樣本數(shù)據(jù)通過(guò)R 軟件進(jìn)行不同免疫細(xì)胞間的相關(guān)系數(shù)計(jì)算，以分析試驗(yàn)組和對(duì)照組組間的差異性及各免疫細(xì)胞間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 TAO 差異表達(dá)基因獲取結(jié)果

從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載GSE58331 芯片數(shù)據(jù)與GPL570 平臺(tái)數(shù)據(jù)，共175 個(gè)樣本。經(jīng)過(guò)篩選，獲得試驗(yàn)組TAO 前眼眶表達(dá)基因22 個(gè)樣本，對(duì)照組正常人前眼眶表達(dá)基因20 個(gè)樣本。通過(guò)R 軟件進(jìn)行相關(guān)分析，獲取兩者間差異基因315 個(gè)，其中下調(diào)基因220 個(gè)，上調(diào)基因95 個(gè)，并選取差異最明顯的前20 個(gè)基因繪制熱圖（圖1），同時(shí)繪制火山圖（圖2）。

圖1 正常組與試驗(yàn)組差異基因熱圖（見(jiàn)內(nèi)文第34 頁(yè)）

圖2 正常組與試驗(yàn)組差異基因火山圖（見(jiàn)內(nèi)文第34 頁(yè)）

2.2 核心差異基因獲取結(jié)果

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因進(jìn)行PPI 分析。在PPI 網(wǎng)絡(luò)中，有節(jié)點(diǎn)289 個(gè)，邊197 條，平均節(jié)點(diǎn)degree 值為1.36。該網(wǎng)絡(luò)中大于2 倍平均節(jié)點(diǎn)degree值的核心基因有56 個(gè)，其中degree 值最高的核心差異基因前5 位分別是FOS、JUN、CXCL8、ITGAM 和CXCL12。見(jiàn)圖3～4。

圖3 核心差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)中核心差異基因degree 值排序

2.3 差異基因的GO 和KEGG 富集分析結(jié)果

使用R 軟件，根據(jù)TAO 差異表達(dá)基因，進(jìn)行生物學(xué)功能和通路富集分析。其中生物過(guò)程有460 條，細(xì)胞成分有6 條，分子功能有36 條，KEGG 通路有20 條。根據(jù)基因富集數(shù)目與顯著程度，選取排名靠前的前10 條BP、CC、MF 和20 條KEGG 通路分別繪制柱狀圖和氣泡圖，見(jiàn)圖5～6。其中涉及的生物過(guò)程和KEGG 信號(hào)通路均與免疫炎癥關(guān)系密切，如圖中所示，主要包括細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞趨化性、單核細(xì)胞遷移等GO 生物過(guò)程和破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（interleukin-IL）-17信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路等KEGG 通路。

圖5 甲狀腺相關(guān)性眼病差異基因GO 富集分析（見(jiàn)內(nèi)文第35 頁(yè)）

圖6 甲狀腺相關(guān)性眼病差異基因KEGG 富集分析（見(jiàn)內(nèi)文第35 頁(yè)）

2.4 免疫浸潤(rùn)矩陣獲取結(jié)果

在CIBERSORT 反卷積法中以P ＜0.05 對(duì)TAO與正常人群的前眼眶基因樣本進(jìn)行篩選，最終獲得27 個(gè)可信樣本，其中試驗(yàn)組13 個(gè)，對(duì)照組14 個(gè)，試驗(yàn)組用橙色表示，對(duì)照組用藍(lán)色表示。結(jié)果顯示，M2巨噬細(xì)胞、未活化的靜息肥大細(xì)胞在TAO 試驗(yàn)組中顯著減少，而單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等在TAO試驗(yàn)組中顯著增加，見(jiàn)圖7。同時(shí)予以免疫細(xì)胞比例箱圖進(jìn)一步顯示22 種免疫細(xì)胞在各樣本中的浸潤(rùn)比例，見(jiàn)圖8。

2.5 免疫細(xì)胞相關(guān)性分析

如圖9 所示，漿細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（r=0.64），單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（r=0.61），未活化的自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（r=0.62），調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞呈顯著正相關(guān)（r=0.60）。并且，未活化的靜息肥大細(xì)胞和漿細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.72），未活化的靜息肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.68），單核細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.71），單核細(xì)胞和未活化的靜息肥大細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.66），未活化的自然殺傷細(xì)胞和活化的自然殺傷細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.71）。見(jiàn)圖9。

2.6 TAO 試驗(yàn)組與對(duì)照組免疫浸潤(rùn)差異分析

通過(guò)小提琴圖對(duì)試驗(yàn)組與對(duì)照組組間的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞行差異分析，以P ＜0.05 為差異有顯著性，試驗(yàn)組用紅色表示，對(duì)照組用藍(lán)色表示，得出在試驗(yàn)組中單核細(xì)胞（P=0.014）和中性粒細(xì)胞（P=0.006）顯著增高，而M2 巨噬細(xì)胞（P=0.019）和未活化的靜息肥大細(xì)胞（P=0.039）顯著減少的結(jié)論，見(jiàn)圖10。

3 討論

TAO 是一種病因病機(jī)復(fù)雜且治療效果欠佳的自身免疫性疾病。隨著目前對(duì)其越來(lái)越深入的研究，其遺傳及免疫因素和抗免疫治療越來(lái)越受到臨床重視。本研究通過(guò)將TAO 和正常人的前眼眶表達(dá)基因進(jìn)行差異分析，并將得到的差異基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行PPI 分析，共篩選得到與TAO 相關(guān)的以FOS、JUN、CXCL8、ITGAM 和CXCL12 為首的56 個(gè)核心基因。FOS 與JUN 可能都與細(xì)胞凋亡有關(guān)。FOS 家族由c-FOS、FOSB、Fra-1、Fra-2 等成員組成，這些基因編碼亮氨酸拉鏈蛋白，JUN 家族由c-Jun、JunB、JunD 等成員組成，c-Jun 是Fas 的轉(zhuǎn)錄激活因子，F(xiàn)OS 家族與JUN 家族的蛋白質(zhì)二聚，從而形成轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物激活蛋白-1[9]。FOS 蛋白常被認(rèn)為是細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)因子。某些情況下，F(xiàn)OS 基因的表達(dá)與凋亡細(xì)胞死亡有關(guān)。有研究證實(shí)，甲狀腺癌增殖轉(zhuǎn)化過(guò)程與c-FOS 及Fra-1 激活密不可分[10-13]。JUN 家族在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)方面具有雙向作用[14]。有研究證實(shí)硼替佐米可磷酸化并激活c-Jun，同時(shí)激活Fas 凋亡途徑，促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡[15]。趨化因子是一類由細(xì)胞分泌的具有化學(xué)趨化作用的信號(hào)蛋白或小細(xì)胞因子，其具有誘導(dǎo)附近反應(yīng)細(xì)胞定向趨化的能力[16]。CXCL8 屬于促炎趨化因子，主要是中性粒細(xì)胞的趨化劑，其在病理?xiàng)l件下形成，并積極參與炎癥反應(yīng)，吸引免疫細(xì)胞到炎癥部位，同時(shí)也有證據(jù)表明CXCL8 具有抑制肥大細(xì)胞的作用[17-18]。有研究證實(shí)CXCL8 的表達(dá)水平檢測(cè)，可作為TAO 活動(dòng)性、病情嚴(yán)重程度和眼表功能評(píng)估的輔助診斷依據(jù)[19]。ITGAM 編碼白細(xì)胞黏附分子β2，是白細(xì)胞黏附分子整合素β2 亞家族成員，主要介導(dǎo)細(xì)胞向炎癥部位的黏附與遷移，和腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。有研究證實(shí)ITGAM 與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，與其免疫過(guò)程亦相關(guān)[21-22]。CXCL12屬于體內(nèi)平衡趨化因子，在某些組織中產(chǎn)生，負(fù)責(zé)基礎(chǔ)白細(xì)胞遷移，同時(shí)骨髓中生成的CXCL12 能促進(jìn)骨髓微環(huán)境中B 祖細(xì)胞增殖。而CXCL12 可能在甲狀腺乳頭癌侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[23-24]。本研究所篩選的PPI 主要核心基因均與TAO 免疫細(xì)胞炎性浸潤(rùn)和遷移黏附有關(guān)，并與細(xì)胞凋亡相關(guān)，這和TAO 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程相符，進(jìn)一步說(shuō)明預(yù)測(cè)的可靠性。

本研究利用GEO 基因芯片對(duì)TAO 和正常人的前眼眶組織進(jìn)行差異基因的GO 和KEGG 富集分析，提示本病的生物學(xué)過(guò)程與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。其中BP 富集主要涉及細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞遷移、粒細(xì)胞趨化性、單核細(xì)胞遷移等，進(jìn)一步顯示TAO 是由多種炎癥細(xì)胞因子共同參與的免疫過(guò)程。炎癥細(xì)胞因子是指由免疫細(xì)胞（T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等）和非免疫細(xì)胞（纖維母細(xì)胞、表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）經(jīng)刺激而合成分泌的一類具有生物學(xué)活性的小分子物質(zhì)，其可通過(guò)結(jié)合相應(yīng)受體來(lái)調(diào)控免疫應(yīng)答與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化[25]。近年來(lái)一系列研究證實(shí)[26-28]炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子與TAO 有一定的關(guān)系。KEGG 分析顯示，差異基因的相關(guān)通路與破骨細(xì)胞分化、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路等密切相關(guān)。破骨細(xì)胞分化與甲狀腺疾病導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松有關(guān)[29-31]，可能與TAO 的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用與TAO 的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[32-33]，貫穿在TAO 發(fā)生發(fā)展之中。PI3K-Akt 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)合成等方面發(fā)揮重要作用，該通路活性不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，而且與細(xì)胞的遷移、黏附、血管增生以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等密切相關(guān)[34-35]，這均與TAO 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。IL-17 信號(hào)通路與TAO 的病情嚴(yán)重性相關(guān)，有研究證實(shí)IL-17有望作為TAO 病情活動(dòng)性的評(píng)價(jià)新指標(biāo)[36-39]。NF-κB信號(hào)通路在調(diào)節(jié)對(duì)感染的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，其不正確調(diào)節(jié)與癌癥、自身免疫病和炎癥有關(guān)，有研究[40]證實(shí)NF-κB1 基因啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性可能與TAO的發(fā)病具有相關(guān)性。Toll 樣受體屬于固有免疫病原模式識(shí)別受體，可以識(shí)別入侵人體的多種物質(zhì)，最終導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子、抗炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，在炎癥、免疫細(xì)胞調(diào)控、存活和增殖等方面發(fā)揮著重要作用，有研究[41]證實(shí)TLR9 激活后，可誘導(dǎo)活動(dòng)期TAO 眼眶成纖維細(xì)胞合成和分泌炎癥因子，表明TLR9 可能參與了TAO 活動(dòng)期眼眶炎癥反應(yīng)過(guò)程。以上多種通路提示TAO 病情的發(fā)生發(fā)展均與炎癥和免疫相關(guān)。

為進(jìn)一步探討免疫細(xì)胞在TAO 中的作用，利用CIBERSORT 反卷積法對(duì)兩組前眼眶表達(dá)基因樣本進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，在TAO 組中單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞顯著增高，而M2 巨噬細(xì)胞和未活化的靜息肥大細(xì)胞顯著減少。在免疫細(xì)胞相關(guān)性分析中，將22 種免疫細(xì)胞兩兩比較，結(jié)果顯示，單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，單核細(xì)胞和M2 巨噬細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，單核細(xì)胞和未活化的靜息肥大細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，未活化的靜息肥大細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)，以上關(guān)系從側(cè)面反應(yīng)了不同的免疫細(xì)胞之間在TAO 病程進(jìn)展過(guò)程中存在協(xié)同或拮抗作用。本研究預(yù)測(cè)的結(jié)果得到了相關(guān)研究的證實(shí)，Van 等[42]認(rèn)為眼眶浸潤(rùn)的肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞在TAO 中參與了眼眶成纖維細(xì)胞的活化，張靈麗等[43]認(rèn)為TAO 患者外周血中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞較對(duì)照組升高，且升高程度與病情活動(dòng)性有關(guān)，駱立夫等[44]認(rèn)為TAO 眼眶脂肪結(jié)締組織中存在大量炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（以淋巴細(xì)胞為主）與成纖維細(xì)胞增生。

綜上所述，TAO 是一種甲狀腺器官特異的自身免疫性疾病，免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中占據(jù)最重要地位，同時(shí)炎癥反應(yīng)也是其重要的發(fā)病機(jī)制，目前其藥物治療的主要方向即抗免疫和抗炎治療，故對(duì)免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制深入研究有助于指導(dǎo)TAO 患者的診斷、治療和預(yù)后評(píng)價(jià)。本研究利用生物信息學(xué)對(duì)TAO前眼眶表達(dá)基因芯片進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程和免疫浸潤(rùn)分析，對(duì)后續(xù)相關(guān)科研工作具有一定參考意義。