劉星宇 王 杰 石 菲

1.解放軍總醫(yī)院京中醫(yī)療區(qū)綜合內(nèi)科，北京 100011；2.陜西省西安大興醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，陜西西安 710000；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032

我國(guó)是世界上老年人口絕對(duì)數(shù)量最多的國(guó)家，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國(guó)社會(huì)的沉重負(fù)擔(dān)。因此研究其發(fā)病機(jī)制及新型藥物具有重要意義[1-3]。近年來(lái)，微RNA（microRNA，miRNA）成為研究熱點(diǎn)，其通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種機(jī)制參與到骨質(zhì)疏松等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中[4-6]。研究表明miR-189 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、電離輻射后內(nèi)皮細(xì)胞損傷和肺癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用[7-9]，而miR-189 對(duì)骨質(zhì)疏松的調(diào)控作用不明確。本研究旨在探究miR-189 對(duì)骨形成的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

澳洲胎牛血清（10100147）、DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基（31330095）和Lipofectamine 2000（11668030）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；RNA 抽提盒（639505）、反轉(zhuǎn)錄盒（639549）和擴(kuò)增盒（639503）購(gòu)自日本TaKaRa 公司；miR-189序列和引物購(gòu)自生工生物公司；鈣黃綠素（德國(guó)Merck 公司，C0875）；RUNX2 抗體（ab32147）、OSX 抗體（ab128873）和抗GAPDH 抗體（ab135745）購(gòu)自美國(guó)abcam 公司。

1.2 研究方法

1.2.1 模型建立 利用隨機(jī)數(shù)字表法將32 只雌性C57BL/6J 小鼠（動(dòng)物合格證號(hào)SYDWZX 京20200211）分為4組：假手術(shù)組、去勢(shì)組、對(duì)照組和抑制劑組，每組8只。動(dòng)物飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，房?jī)?nèi)溫度18～22℃，濕度50%～60%。在小鼠6 個(gè)月齡時(shí)，切除卵巢（去勢(shì)組）或假手術(shù)（假手術(shù)組）。將miR-189 陰性對(duì)照序列（對(duì)照組）和抑制劑（抑制劑組）注入去勢(shì)小鼠體內(nèi)。本研究經(jīng)解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)（編號(hào)20191001006）[10]。

1.2.2 micro CT 掃描參數(shù)設(shè)置為80 kV 和500 mA。分辨率為10 μm，曝光時(shí)間800 ms。取邊長(zhǎng)3 mm 的立方體作為感興趣區(qū)域檢測(cè)。三維重建，計(jì)算參數(shù)：骨密度（bone mineral density，BMD）、骨體積與總體積比（bone volume-to-total volume ratio，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）、骨小梁連接密度（connectivity density，Conn.D）和骨小梁分離指數(shù)（trabecular separation，Tb.Sp）[11]。

1.2.3 RT-qPCR 檢測(cè)miRNA 表達(dá)量 利用RNAiso 進(jìn)行骨組織裂解。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)：2.0 μl 5×PrimeScript?Buffer、0.5 μl PrimeScript?RT Enzyme Mix Ⅰ、0.5 μl Bulge-loop RT Primer 和RNA，加水補(bǔ)齊10 μl。反轉(zhuǎn)錄：37℃預(yù)熱15 min；42℃加熱15 min；85℃加熱5 s，得到cDNA。擴(kuò)增反應(yīng)系統(tǒng)：10 μl SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、1.6 μl 引物、0.4 μl ROX Reference DyeⅡ和2 μl cDNA，加水補(bǔ)齊20 μl。擴(kuò)增：95℃預(yù)變性30 s；95℃維持5 s，60℃維持34 s，40 個(gè)循環(huán)[12]。miR-189 引物序列：正向5’-ACACTCCAGCTGGGTTGCAGCTGCCTGGGAGTGA-3’，反向5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6 引物序列：正向5’-CTTCGGCAGCACATATAC-3’，反向5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.2.4 尾靜脈注射 按照1.5 mg/kg 濃度分別將miR-189 陰性對(duì)照序列：5’-GUCAUGAAAACACAUCAUGUUU-3’和miR-189 抑制劑：5’-UCGUCGUAACAUGUCCCGAUACU-3’從尾靜脈注入去勢(shì)小鼠體內(nèi)[11]。

1.2.5 鈣黃綠素染色 小鼠在處死前10 d 和3 d 腹腔注射5 mg/kg 鈣黃綠素。取出股骨，固定，脫水，包埋，切片（避光）。利用熒光顯微鏡計(jì)算礦物質(zhì)沉積率（mineral apposition rate，MAR）和成骨率（bone formation rate，BFR）等參數(shù)[13]。

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 小鼠成骨細(xì)胞系ME3T3-E1購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。分組：轉(zhuǎn)染miR-189 陰性對(duì)照序列的對(duì)照組、轉(zhuǎn)染抑制劑的抑制劑組和轉(zhuǎn)染模擬序列（5’-AGCAGCCUUGUACAGGGCUAUGA-3’）的模擬物組[11]。轉(zhuǎn)染時(shí)miRNA 序列濃度為80 nmol/L。

1.2.7 Western blot 技術(shù) 利用蛋白酶裂解液制備MC3T3-E1 細(xì)胞的蛋白樣本。電泳：95 V 維持30 min；轉(zhuǎn)膜：250 mA 維持2 h；室溫孵育一抗4 h 后沖洗，室溫孵育二抗1 h 后發(fā)光[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，三樣本組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建

與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組出現(xiàn)骨微結(jié)構(gòu)退化，去勢(shì)組骨小梁骨量顯著降低（BMD 和BV/TV 均下降），骨小梁結(jié)構(gòu)明顯受損（Tb.Th、Tb.N 和Conn.D 降低，而Tb.Sp 升高）（P ＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 micro CT 檢測(cè)骨量變化（n=8）

2.2 去勢(shì)小鼠股骨miR-189 表達(dá)情況

與假手術(shù)組比較，去勢(shì)組股骨中miR-189 高表達(dá)（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 RT-qPCR 檢測(cè)小鼠股骨中miR-189 的含量（n=8）

2.3 miR-189 抑制劑對(duì)股骨中miR-189 含量的影響

與對(duì)照組比較，抑制劑組股骨中miR-189 低表達(dá)（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 RT-qPCR 檢測(cè)各組小鼠股骨組織中miR-189 的含量（n=8）

2.4 miR-189 抑制劑對(duì)去勢(shì)小鼠骨丟失的影響

與對(duì)照組比較，抑制劑組骨微結(jié)構(gòu)退化得到部分恢復(fù)，抑制劑組小鼠骨小梁骨量增加，骨小梁結(jié)構(gòu)改善（P ＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 microCT 檢測(cè)骨量變化（n=8）

2.5 miR-189 抑制劑對(duì)去勢(shì)小鼠骨形成的影響

與對(duì)照組比較，抑制劑組MAR 和BFR 增加（P ＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖5 鈣黃綠素染色檢測(cè)骨形成（n=8）

2.6 寡核苷酸效率檢測(cè)

與對(duì)照組比較，模擬組miR-189 增加（P ＜0.05），而抑制劑組降低（P ＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 q-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中miR-189 含量（n=4）

2.7 miR-189 抑制劑對(duì)成骨指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模擬物組RUNX2 和OSX 含量降低（P ＜0.05），抑制劑組RUNX2 和OSX 含量增加（P ＜0.05）。見(jiàn)圖7。

圖7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中成骨指標(biāo)（n=4）

3 討論

本研究利用卵巢去除構(gòu)建小鼠骨質(zhì)疏松模型，micro CT 檢測(cè)建模情況，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組比較，去勢(shì)小鼠骨量減低、骨微結(jié)構(gòu)退化，這和目前研究報(bào)道一致[14-16]，隨后又發(fā)現(xiàn)去勢(shì)組股骨中miR-189 高表達(dá)，這暗示miR-189 可能在骨形成中發(fā)揮調(diào)控作用。為驗(yàn)證猜想，本研究將miR-189 抑制劑注射入小鼠體內(nèi)，RT-qPCR 檢測(cè)抑制劑效果，證實(shí)在體注射抑制劑后，小鼠股骨miR-189 降低，提示在體內(nèi)應(yīng)用miR-189 有效。

利用micro CT 檢測(cè)miR-189 抑制劑對(duì)去勢(shì)小鼠骨形成的影響，發(fā)現(xiàn)抑制劑能夠?qū)谷?shì)造成的骨丟失，而成骨細(xì)胞發(fā)揮了成骨作用的功能細(xì)胞[17-18]，為了探究miR-189 的靶點(diǎn)，利用鈣黃綠素染色動(dòng)態(tài)觀測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-189 抑制劑能夠促進(jìn)骨形成。

RUNX2 是RUNT 基因家族的轉(zhuǎn)錄因子。RUNX2是成骨細(xì)胞分化過(guò)程中最重要的特異性轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞分化的起始誘導(dǎo)和后續(xù)功能基因的序貫表達(dá)中具有重要調(diào)控作用[19-22]。而OSX 是一類(lèi)含有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，OSX 是不可缺少的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子[23-25]。為驗(yàn)證miR-189 對(duì)成骨細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)miR-189 過(guò)表達(dá)降低RUNX2 和OSX 含量，而敲低miR-189 增加RUNX2 和OSX 含量。結(jié)果顯示，miR-189 抑制成骨細(xì)胞的成骨功能。

綜上所述，骨質(zhì)疏松小鼠股骨高表達(dá)miR-189，而miR-189 可通過(guò)抑制成骨細(xì)胞功能抑制骨形成。