姚柳，趙芳，秦玉婷，王歡，尼羅帕爾·吐爾遜，陳雙，帕提古麗·阿不力孜，郝建萍

[新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液病中心（新疆維吾爾自治區(qū)血液病研究所），新疆 烏魯木齊830054]

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一組異質(zhì)性髓系克隆性疾病，其特點(diǎn)是髓系細(xì)胞發(fā)育異常，表現(xiàn)為無效造血、難治性血細(xì)胞減少、高風(fēng)險向急性髓系白血病轉(zhuǎn)化[1]。MDS 的發(fā)病機(jī)制仍然不明確，可能與多基因累積突變，癌基因與抑癌基因異常，造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞增殖分化和凋亡行為異常，以及免疫功能紊亂等多種因素有關(guān)[2-3]。造血干細(xì)胞移植是目前唯一有潛力的治療方法，但是，只有很少的患者接受造血干細(xì)胞移植。靶向表觀遺傳途徑逆轉(zhuǎn)抑癌基因的病理性失活是MDS 的另一種治療可能性。該方法具有侵襲性和細(xì)胞毒性，并且隨著治療時間的推移，部分患者的療效會逐漸降低，耐藥現(xiàn)象普遍存在[4-6]。因此，迫切需要替代的低毒療法。研究表明，Hedgehog（HH）是多種人類癌癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵介質(zhì)，HH 信號在白血病干細(xì)胞的自我更新和維持腫瘤干細(xì)胞中發(fā)揮重要作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。HH 基因家族包括 Sonic Hedgehog （SHH）、 Desert Hedgehog（DHH）和Indian Hedgehog（IHH）3 種同源基因，分別編碼相應(yīng)的分泌型蛋白作為HH 信號通路的配體，其中SHH 信號通路與人類關(guān)系最密切，其由SHH、Patched、Smoothened（SMO）和Gli4 種基因組成，分別編碼SHH 配體、Patched 受體、SMO 受體以及下游的轉(zhuǎn)錄因子Gli 家族蛋白[9]?？缒な荏wPatched 包括Patched-1 和Patched-2 兩種亞型[10]。SHH 信號通路受SHH 蛋白調(diào)節(jié)呈雙相性：無SHH 配體時，Patched 與蛋白復(fù)合物結(jié)合，可觸發(fā)Caspase 依賴的細(xì)胞死亡途徑[11]；存在SHH 配體時，Patched 釋放SMO，解除對SMO 的抑制，激活轉(zhuǎn)錄因子Gli-1、Gli-2、Gli-3 和下游靶基因，最終調(diào)節(jié)多種靶基因（Cyclin D1、Bcl-2、C-myc、Cyclin E和BMP 等）的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖與分化[12-13]。SHH 信號通路作為HH 信號的重要分支，在血液腫瘤中發(fā)揮著重要作用，但在MDS 發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少。本研究旨在探討SHH 信號通路相關(guān)基因在MDS 中的表達(dá)，SMO 抑制劑Jervine 對人骨髓增生異常綜合征細(xì)胞MUTZ-1 增殖、凋亡及SHH 通路相關(guān)基因、蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月—2018年3月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心經(jīng)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、染色體R 顯帶分析、熒光原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)檢查確診的53 例MDS 患者。其中，男性30 例，女性23 例；年齡15～88 歲，中位發(fā)病年齡67 歲；根據(jù)WHO 2016 分型標(biāo)準(zhǔn)[14]進(jìn)行分型，MDS 伴單系病態(tài)造血（MDS-SLD）4 例，MDS 伴多系病態(tài)造血（MDS-MLD）12 例，MDS 伴 環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞（MDS·RS）1 例，MDS 伴原始細(xì)胞增多Ⅰ型（MDS-EB-1）7 例，MDS伴原始細(xì)胞增多Ⅱ型（MDS-EB-2）29 例；依據(jù)國際預(yù)后積分系統(tǒng)（IPSS）[15]對患者預(yù)后分組：低危組2 例，中危1 組16 例，中危2 組21 例，高危組14 例。將低危組和中危1 組歸為相對低危組，中危2 組和高危組歸為相對高危組。選取同期該院25 例缺鐵性貧血患者作為正常對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 儀器、試劑與細(xì)胞

流式細(xì)胞儀（美國BD Bioscience 公司），磁珠分選儀（德國美天旎生物技術(shù)有限公司）；羊抗人SHH 抗體、兔抗人SMO 抗體、羊抗人Patched-1 抗體、兔抗人Gli-1 抗體（美國Santa Cruz 公司），Trizol 試劑（美國Invitgen 公司），逆轉(zhuǎn)錄酶試劑（日本TaKaRa 公司），Jervine（英國Abcam 公司），兔二抗、鼠二抗（武漢博士德生物工程有限公司），10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），CCK-8 細(xì)胞計數(shù)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin V-FITC/PI 試劑盒（南京凱基生物公司）；MUTZ-1 細(xì)胞（上海通派生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD34+細(xì)胞分離 流式細(xì)胞儀檢測53 例MDS 患者骨髓單個核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞的數(shù)量，磁珠分選儀分離CD34+細(xì)胞，分選的CD34+細(xì)胞純度在95%以上，有效率在90%以上。

1.3.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測SHH、Patched-1、SMO 和Gli-1 mRNA 的相對表達(dá)量 抽取MDS 患者和正常對照組患者空腹肘正中靜脈血3～4 mL，12 000 r/min 離心15 min，取上清液。按照Trizol 試劑盒說明書步驟從血清中提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩U(kuò)增引物根據(jù)GeneBank 序列設(shè)計并由武漢巴菲爾生物技術(shù)公司合成，引物序列見表1。β-actin為內(nèi)參基因。采用20 μL PCR 擴(kuò)增體系，每孔加入SYBR Green Master Mix 10.0 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，高純水4.8 μL，正、反向引物各0.4 μL，cDNA 4.0 μL，每個樣本設(shè)3 個復(fù)孔。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1 min、95℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸30 s，于72℃采集熒光信號，循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 引物序列

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)和Jervine 干預(yù) MUTZ-1 細(xì)胞系在含10% FBS 和1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[16]。將溶解在DMSO溶液中終濃度為1 μ mol/L、5 μ mol/L、10 μmol/L 的Jervine 加入對數(shù)生長期的MUTZ-1 細(xì)胞中，共孵育24 h。

1.3.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 收集MUTZ-1細(xì)胞，按照5×104個/mL 接種于96 孔板，每孔接種100 μL 細(xì)胞懸液，分別加入0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L Jervine，37℃、5%二氧化碳飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8，37℃培養(yǎng)4 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定吸光度值。進(jìn)行3 次獨(dú)立重復(fù)實驗，計算細(xì)胞活力變化情況。不含細(xì)胞只含培養(yǎng)基為空白組，Jervine 0 μmol/L為對照組，Jervine 1 μmol/L、Jervine 5 μmol/L、Jervine 10 μmol/L 為實驗組，計算增殖率，增殖率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 用0 μmol/L、1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L Jervine 處理MUTZ-1細(xì)胞，每孔總體積為3 mL。37℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI 試劑盒說明書操作，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3 次，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.6 qRT-PCR 檢 測MUTZ-1細(xì)胞的SMO 和Gli-1 mRNA的相對表達(dá)量 用Trizol試劑從MUTZ-1細(xì)胞中提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列同表1。反應(yīng)條件和計算方法同1.3.2。

1.3.7 Western blotting 法檢測SMO、Gli-1、Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達(dá)量 用RIPA 裂解液提取MUTZ-1 細(xì)胞總蛋白，每次取20 μL 總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V 40 min，120 V 60 min），將蛋白從SDS-PAGE 膠上轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（100 V 120 min）。5%脫脂奶粉封閉2 h。β-actin 為內(nèi)參。按 照1∶500 稀 釋Gli-1，按 照1∶1 000 稀 釋SMO、Caspase-3， 1∶2 000 稀 釋Bcl-2， 1∶5 000 稀 釋Cyclin D1，1∶200 稀釋β-actin，4℃孵育過夜，按照1∶50 000 稀釋兔二抗和鼠二抗，37℃孵育2 h，隨后顯色底物顯影。

1.4 治療方案

相對低危組以沙利度胺、環(huán)孢素、雄激素治療為主，聯(lián)合間斷輸血。相對高危組根據(jù)患者意愿分別輸血、給予地西他濱或預(yù)激化療。

1.5 隨訪

所有患者隨訪到死亡或2018年3月30日?？偵嫫冢∣S）為從確診到死亡的時間或2018年3月30日。隨訪數(shù)據(jù)從醫(yī)院記錄中獲得，或者通過電話采訪患者或其家人獲得。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。2-ΔΔCt法分析基因的相對表達(dá)量，結(jié)果不服從正態(tài)分布，做對數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布后進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。方差齊時，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊時，計量資料用中位數(shù)（上四分位數(shù)，下四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示。用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log rank χ2檢驗。采用Pearson 法做相關(guān)性分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者SHH、Patched-1、SMO 和Gli-1 mRNA相對表達(dá)量的比較

3 組患者SHH 和Patched-1 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3 組患者SMO 和Gli-1 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，相對高危組SMO 和Gli-1 mRNA 相對表達(dá)量高于正常對照組和相對低危組（P＜0.05）；相對低危組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 3組患者SHH、Patched-1、SMO和Gli-1 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

表2 3組患者SHH、Patched-1、SMO和Gli-1 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

注：①與正常對照組比較，P ＜0.05；②與相對低危組比較，P ＜0.05。

組別正常對照組相對低危組相對高危組F 值P 值n Gli-1 mRNA 0.07±0.49 0.14±0.92 1.03±1.32①②7.928 0.001 25 18 35 SHH mRNA 0.22±1.71 1.20±2.17 1.32±2.03 2.458 0.089 Patched-1 mRNA 0.05±1.84 1.01±2.25 1.01±2.07 1.845 0.170 SMO mRNA-0.38±2.09 1.17±3.05 3.89±2.51①②21.601 0.000

2.2 SHH信號通路相關(guān)基因與患者預(yù)后生存分析

53 例患者中位生存時間為12.0（7.5，16.5）個月；平均SMO mRNA 相對表達(dá)量為（2.95±2.97），平均Gli-1 mRNA 相對表達(dá)量為（0.73±1.26）。高于平均水平的患者為高表達(dá)組，低于平均水平的患者為低表達(dá)組。SMO基因高、低表達(dá)組患者中位生存時間分別為8.0（6.7，9.3）個月和20.0（14.2，25.8）個月，Gli-1基因高、低表達(dá)組患者中位生存時間分別為7.0（4.6，9.4）個月和20.0（7.2，32.8）個月。用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，結(jié)果顯示，SMO基因高、低表達(dá)組患者3年累積生存率分別為8.4% 和36.9%，兩組比較，采用Log rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.840，P=0.001）（見圖1）；Gli-1基因高、低表達(dá)組患者3年累積生存率分別為11.6%和31.5%，兩組比較，采用Log rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.180，P=0.001）（見圖2）。

圖1 MDS患者SMO基因高、低表達(dá)組的生存曲線

圖2 MDS患者Gli-1基因高、低表達(dá)組的生存曲線

2.3 Jervine對MUTZ-1細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，Jervine 0 μmol/L 組、Jervine 1 μ mol/L 組、Jervine 5 μ mol/L 組、Jervine 10 μmol/L 組MUTZ-1 細(xì)胞的增殖率分別為（99.88±0.12）%、（93.39±0.93）%、（87.88±1.72）%和（78.76±0.75）%，4 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=217.752，P=0.000）；進(jìn)一步兩兩比較，Jervine 5 μmol/L 組和Jervine 10 μmol/L 組細(xì)胞增殖率低于Jervine 0 μmol/L 組（P＜0.05）（見圖3）。MUTZ-1 細(xì)胞增殖率與Jervine 濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.977，P=0.000），隨著Jervine 濃度升高，對MUTZ-1 細(xì)胞增殖作用越小，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖3 不同濃度Jervine作用MUTZ-1細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖率的比較 （±s）

2.4 Jervine對MUTZ-1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，Jervine 0 μmol/L 組、Jervine 1 μ mol/L 組、Jervine 5 μ mol/L 組、Jervine 10 μmol/L 組細(xì)胞凋亡率分別為（3.53±0.21）%、（5.69±0.23）%、（10.90±0.13）%和（18.23±0.72）%，4 組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=806.727，P=0.000）（見圖4）。MUTZ-1 細(xì)胞凋亡率與Jervine 濃度呈正相關(guān)（r=0.997，P=0.000），隨著Jervine 濃度升高，對MUTZ-1 細(xì)胞凋亡作用越明顯，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖4 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的凋亡率

2.5 Jervine 對MUTZ-1 細(xì) 胞SMO 和Gli-1 基 因表達(dá)的影響

Jervine 0 μmol/L 組、 Jervine 1 μ mol/L 組、Jervine 5 μ mol/L 組、Jervine 10 μmol/L 組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1 mRNA 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，Jervine 5 μmol/L 組和Jervine 10 μmol/L 組SMO、Gli-1 mRNA相對表達(dá)量低于Jervine 0 μmol/L 組（P＜0.05）。見表3。

表3 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

表3 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1 mRNA相對表達(dá)量的比較 （±s）

注：?與Jervine 0 μmol/L組比較，P ＜0.05

組別Jervine 0 μmol/L組Jervine 1 μmol/L組Jervine 5 μmol/L組Jervine 10 μmol/L組F 值P 值Gli-1 mRNA 1.09±0.08 0.76±0.13 0.49±0.08?0.27±0.07?44.822 0.000 SMO mRNA 0.99±0.07 0.81±0.07 0.61±0.04?0.39±0.07?50.623 0.000

2.6 Jervine 對MUTZ-1 細(xì) 胞SMO 和Gli-1 蛋 白表達(dá)的影響

Jervine 0 μmol/L 組、 Jervine 1 μ mol/L 組、Jervine 5 μ mol/L 組、Jervine 10 μmol/L 組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，Jervine 5 μmol/L 組和Jervine 10 μmol/L 組SMO、Gli-1 蛋白相對表達(dá)量低于Jervine 0 μmol/L 組（P＜0.05）。見圖5 和表4。

表4 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

表4 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1蛋白相對表達(dá)量的比較 （±s）

注：?與Jervine 0 μmol/L組比較，P ＜0.05。

組別Jervine 0 μmol/L組Jervine 1 μmol/L組Jervine 5 μmol/L組Gli 0.8 0.7 0.5 SMO 蛋白0.78±0.04 0.64±0.04 0.47±0.03?Jervine 10 μmol/L組F 值P 值-1 蛋白5±0.081±0.090±0.06?0.28±0.05?38.685 0.000 0.30±0.04?85.542 0.000

圖5 不同濃度Jervine組MUTZ-1細(xì)胞的SMO、Gli-1蛋白的表達(dá)

2.7 Jervine對Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響

Jervine 0 μmol/L 組、 Jervine 1 μ mol/L 組、Jervine 5 μmol/L 組、Jervine 10 μmol/L 組MUTZ-1細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1 蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，Jervine 1 μmol/L 組、Jervine 5 μmol/L 組、Jervine 10 μmol/L組與Jervine 0 μmol/L組比較，Bcl-2、Cyclin D1 蛋白相對表達(dá)量降低，Caspase-3 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）。見圖6 和表5。

表5 不同濃度Jervine 組MUTZ-1 細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表5 不同濃度Jervine 組MUTZ-1 細(xì)胞的Bcl-2、Caspase-3、Cyclin D1蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：?與Jervine 0 μmol/L組比較，P ＜0.05。

組別Cyclin D1蛋白0.72±0.04 0.59±0.06?0.41±0.02?0.29±0.03?68.334 0.000 Bcl-2 蛋白Jervine 0 μmol/L組Jervine 1 μmol/L組Jervine 5 μmol/L組Jervine 10 μmol/L組F 值P 值0.78±0.04 0.64±0.10?0.49±0.04?0.31±0.04?31.871 0.000 Caspase-3蛋白0.23±0.07 0.35±0.07?0.48±0.05?0.61±0.06?19.762 0.000

圖6 不同濃度Jervine作用MUTZ-1細(xì)胞后Bcl-2、Caspase-3和Cyclin D1蛋白的表達(dá)

3 討論

HH 信號通路在調(diào)節(jié)正常細(xì)胞分化和胚胎發(fā)育以及驅(qū)動腫瘤形成和發(fā)展的病理過程中起至關(guān)重要作用，其中SHH 信號通路與人類關(guān)系最為密切[17-18]。MDS 發(fā)生、發(fā)展有多個因素參與，涉及多個信號通路，本研究分析SHH 信號通路在MDS 中的地位，結(jié)果顯示MDS 患者骨髓中CD34+細(xì)胞SHH信號通路異常激活，參與MDS 的發(fā)生、發(fā)展，SMO 或Gli-1 高表達(dá)的MDS 患者中位生存時間短，預(yù)后較差。目前國內(nèi)外關(guān)于SHH 信號通路在MDS中的作用機(jī)制報道極少，ZOU 等[19]對23 例MDS 患者和9 例MDS 轉(zhuǎn)急性髓系白血病患者進(jìn)行SHH、SMO和Gli-1基因檢測，結(jié)果顯示在MDS 患者中存在SHH 信號通路的活化，而且高危MDS 及轉(zhuǎn)白血病患者中SHH、SMO和Gli-1基因表達(dá)水平明顯高于低?；颊?，SHH、SMO 和Gli-1 表達(dá)水平與IPSS預(yù)后分組相關(guān)。XAVIER-FERRUCIO 等[20]對63 例低危和高危MDS 患者骨髓CD34+細(xì)胞進(jìn)行Patched、SMO、Gli-1和Gli-2基因檢測，結(jié)果顯示SMO 在MDS 患者中高表達(dá)，SMO 表達(dá)與WHO 分型有關(guān)，SMO 高表達(dá)患者無事件生存率和OS 明顯縮短。本研究也證實了上述觀點(diǎn)。因此阻斷該通路可以影響腫瘤干細(xì)胞的發(fā)育和存活，為MDS 治療提供一個新的選擇。因相關(guān)研究較少，不同的研究結(jié)果略有差異，結(jié)果的一致性還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行觀察。

為進(jìn)一步探討SHH 信號通路在MDS 中的作用機(jī)制，本研究選用SMO 抑制劑Jervine 對存在SHH信號通路高表達(dá)的MDS 細(xì)胞株MUTZ-1 進(jìn)行抑制效應(yīng)及其可能機(jī)制的研究。Jervine 是從Veratrum calfornicum 中分離得到的一種天然甾體生物堿，通過與SMO 的跨膜結(jié)構(gòu)域結(jié)合而抑制HH 信號通路[21]。MUTZ-1 是從難治性貧血伴原始細(xì)胞增多MDS 患者中分離建株的細(xì)胞。本研究采用不同濃度Jervine 作用MUTZ-1 細(xì)胞，檢測細(xì)胞的增殖率和凋亡率發(fā)現(xiàn)，MUTZ-1 細(xì)胞增殖率隨Jervine 濃度增加而降低，凋亡率隨Jervine 濃度增加而升高，表明Jervine 具有抑制MUTZ-1 細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。本研究對不同濃度Jervine 組MUTZ-1 細(xì)胞的SMO、Gli-1 mRNA 相對表達(dá)量和蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，Jervine 可下調(diào)MUTZ-1 細(xì)胞SMO 和Gli-1 基因、蛋白的表達(dá)，且隨著Jervine濃度增加，SMO 和Gli-1 基因和蛋白表達(dá)明顯下降。此外，Bcl-2、Caspase-3 和Cyclin D1 是SHH 信號通路的下游靶基因，本研究結(jié)果顯示，加入不同濃度Jervine 作用于MUTZ-1 細(xì)胞后，Bcl-2 和Cyclin D1 蛋白表達(dá)明顯下降，Caspase-3 則相反，表明SHH 通路對MUTZ-1 細(xì)胞增殖和凋亡的作用可能是通過對Bcl-2、Caspase-3 和Cyclin D1 的調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的。KOBUNE 等[22]研究結(jié)果顯示，在初診急性粒細(xì)胞白血病患者中CD34+細(xì)胞上存在HH 信號通路激活，并介導(dǎo)白血病細(xì)胞耐藥，使用SMO 抑制劑Cyclopamine 作用于急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株（Kasumi-1、Kasumi-3 及TF-1）與原代急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞48 h 后，上述所有細(xì)胞凋亡率明顯增加。這與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，MDS 患者中存在SHH 信號通路異常激活；作為SHH 信號通路的阻斷劑，Jervine 可抑制MDS 細(xì)胞的發(fā)展，為MDS 提供了一種潛在的新的治療策略。