陳仁山，肖惠珍，劉 寧，王 帥，丘文軍，楊天化，高忠良，陳清輝

(廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510800)

心力衰竭是各種心臟疾病進(jìn)展的終末階段，病情重，預(yù)后差[1]。信號(hào)通路在心肌肥厚、心力衰竭的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用，有絲分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPK)信號(hào)通路是其中重要的一條[2]。研究顯示，手術(shù)誘導(dǎo)心臟后負(fù)荷增加，可以激活MAPK/ERK1/2/GATA4信號(hào)通路，誘發(fā)心肌肥厚和心力衰竭發(fā)生。中醫(yī)認(rèn)為心衰的基本病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜，本虛以氣虛為主[3]，益氣扶正是心衰的重要治法。參芪扶正注射液具有益氣扶正作用，對(duì)心力衰竭有良好的治療效果[4-5]，但其作用機(jī)制尚未明確。本文采用參芪扶正注射液治療心力衰竭小鼠，觀察其作用并探討其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買8～10周齡SPF級(jí)C57BL/6J小鼠50只，體重18～22 g，合格證號(hào)：SYXK(粵)2018-0085。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組、模型組、陽性組、SQ低劑量組、SQ高劑量組，每組各10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑 LED數(shù)顯圓周搖床、混懸儀(購(gòu)自賽洛捷克公司，型號(hào)分別為：SLK-O3000-S、SCI-VS)，迷你垂直電泳槽、迷你轉(zhuǎn)印槽、基礎(chǔ)電泳儀電源(購(gòu)自韋克斯WIX公司，型號(hào)分別為：miniPRO4、miniBLOT、EP300)，凝膠成像儀(購(gòu)自BIO-RAD公司)，VEVO 2100超聲心動(dòng)儀(購(gòu)自加拿大Visual Sonics公司)。ERK1/2抗體、GATA4抗體、Phospho-ERK1/2抗體、HPR二抗(購(gòu)自Affinity公司，批號(hào)分別為：AF0115、AF5245、AF1015、AF7011)，BCA蛋白濃度測(cè)試盒(購(gòu)自貝博公司，批號(hào)：BB20101)，血清BNP-Elisa試劑盒(購(gòu)自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司，批號(hào)：MM-0060M1)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 99.0%鹽酸異丙腎上腺素(Isoprenaline hydrochloride,ISO)(批號(hào)：C10935510)，琥珀酸美托洛爾緩釋片(批號(hào)：2005117)，參芪扶正注射液(批號(hào)：190907)。

1.4 動(dòng)物造模和給藥方法 通過皮下植入滲透壓泵的方式建立小鼠心衰模型。小鼠吸入4.5%異氟烷氣體進(jìn)行麻醉，后頸部剃毛消毒，剪開約1 cm切口，植入灌注ISO溶液或蒸餾水的滲透壓泵，縫合切口，碘伏消毒。除空白對(duì)照組，其余四組通過滲透壓泵連續(xù)14 d皮下給予30 mg/(kg·d)的ISO進(jìn)行心力衰竭模型的建立。正常組通過滲透壓泵皮下給予相同給藥時(shí)間、相同流速的蒸餾水。心力衰竭模型建立成功后，SQ低劑量組腹腔注射20 ml/kg參芪扶正注射液，SQ高劑量組腹腔注射40 ml/kg參芪扶正注射液，陽性組給80 mg/kg琥珀酸美托洛爾緩釋片灌胃，療程14 d。正常組和模型組腹腔注射相應(yīng)的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)室觀察及檢測(cè)方法

1.5.1 小鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：小鼠吸入4.5%異氟烷氣體進(jìn)行麻醉，前胸部剃毛消毒。使用VEVO 2100超聲心動(dòng)儀檢測(cè)小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)及左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5.2 ELISA檢測(cè)血清中BNP濃度：小鼠摘取眼球采血1 ml離心后取上清液，按照ELISA試劑盒方法檢測(cè)血清中BNP濃度。

1.5.3 臟器系數(shù)及病理切片檢測(cè)：采血結(jié)束后，迅速處死小鼠，取出心臟及肺組織，利用預(yù)冷的PBS洗凈，吸水紙吸干后，立即稱重并記錄，計(jì)算臟器系數(shù)(臟器重量/體重×100%)。放入4%多聚甲醛中固定制作病理切片，顯微鏡下觀察各臟器病理變化。

1.5.4 Western blot檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞中磷酸化ERK1/2、總ERK1/2、GATA4蛋白的表達(dá)：取小鼠心肌組織，加入含PMSF的裂解液，低溫離心取上清液。BCA法行蛋白定量，計(jì)算出蛋白濃度和上樣量。按照標(biāo)準(zhǔn)Western blot檢測(cè)方法，檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞中磷酸化ERK1/2、總ERK1/2、GATA4蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠心臟彩超顯像比較 見表1(圖1)。與正常組相比，模型組LVEF和LVFS水平均明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，陽性組、SQ低劑量組、SQ高劑量組LVEF和LVFS水平均明顯升高(P<0.05)，且SQ高劑量組優(yōu)于SQ低劑量組(P<0.05)。

圖1 各組小鼠心臟超聲顯像比較

表1 各組小鼠心臟彩超顯像比較(%)

2.2 各組小鼠血清BNP濃度比較 見表2。與正常組相比，模型組血清BNP濃度明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、SQ低劑量組、SQ高劑量組血清BNP濃度均降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，且SQ高劑量組低于SQ低劑量組(P<0.05)。

表2 各組小鼠血清BNP濃度比較(pg/ml)

2.3 各組小鼠臟器系數(shù)比較 見表3。與正常組相比，模型組心臟系數(shù)和肺臟系數(shù)均明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，陽性組、SQ低劑量組、SQ高劑量組心臟系數(shù)和肺臟系數(shù)均明顯降低(P<0.05)。

表3 各組小鼠臟器系數(shù)比較(g/kg)

2.4 各組小鼠心臟病理切片 見圖2。正常組心臟組織內(nèi)心肌細(xì)胞橫紋清晰，細(xì)胞核位于中間，核周圍可見點(diǎn)狀放射狀排列的肌原纖維或排列整齊的心肌纖維，亦無心肌水腫、瘀血、變性及炎細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等浸潤(rùn)。模型組心肌細(xì)胞界限不清晰，體積增大，心肌纖維化，部分發(fā)生鈣化，亦有炎癥、中心粒細(xì)胞浸潤(rùn)。陽性組、SQ低劑量組、SQ高劑量組心肌纖維大部分完整，心肌細(xì)胞界限大部分清晰無炎癥浸潤(rùn)，但SQ低劑量組仍有部分心肌細(xì)胞鈣化。

圖2 各組心力衰竭小鼠心臟病理切片(HE染色，×200)

2.5 各組小鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)比較 見圖3、4。將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，與正常組比較，模型組ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，陽性組、SQ低劑量組及SQ高劑量組ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 各組小鼠心肌組織中ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)

與模型組比較，*P<0.05；與正常組比較，#P<0.05

3 討 論

心力衰竭是心臟疾病的終末階段。據(jù)估計(jì)，我國(guó)心力衰竭患者約890萬[6]。以腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)為代表的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活是引起心室重構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致心衰發(fā)作的重要病理機(jī)制[1]。信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)在心衰的發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。機(jī)體產(chǎn)生的刺激或細(xì)胞因子，最后都需要通過各種信號(hào)通路，進(jìn)行心肌細(xì)胞膜內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終影響蛋白表達(dá)而起作用。研究表明，MAPK信號(hào)通路參與心肌肥厚、心力衰竭的進(jìn)程[7-8]。

MAPK信號(hào)通路是真核細(xì)胞的一個(gè)重要信號(hào)系統(tǒng)，能將多種細(xì)胞外刺激信號(hào)從細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和肥大[9]。胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)是MAPK家族中的一員，分布于胞質(zhì)中，具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化的能力，可以被各種刺激活化，被激活的磷酸化ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入胞核，在細(xì)胞核內(nèi)介導(dǎo)核因子κB(NF-κB)、GATA結(jié)合蛋白4(GATA4)、即刻早期基因(c-fos)等轉(zhuǎn)錄因子活化，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。研究顯示ISO可以激活ERK1/2/GATA4信號(hào)通路，誘發(fā)小鼠心肌肥厚和心肌細(xì)胞肥大[10]，使用專門的靶向抑制劑抑制肌小節(jié)的ERK-GATA4信號(hào)通路，可抑制心肌細(xì)胞肥大[11]。

GATA4是調(diào)控心肌基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，是多種刺激和信號(hào)通路的下游效應(yīng)因子，在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[11]。ERK1/2可直接磷酸化GATA4分子結(jié)構(gòu)上的Ser105位點(diǎn)，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性[12]。GATA4在胞核內(nèi)既可以直接調(diào)控，也可以利用自身結(jié)構(gòu)和其他轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)同，調(diào)控心肌特異性基因的表達(dá)，例如：肌鈣蛋白Ⅰ、腦鈉尿肽、肌球蛋白重鏈等基因，增加蛋白合成，增大心肌細(xì)胞體積[13-14]。研究證實(shí)，在小鼠心臟和心肌細(xì)胞，GATA4的過度表達(dá)可引起心肌肥厚產(chǎn)生。用帶有GATA4的腺病毒感染心肌細(xì)胞，24 h或48 h后可見顯著的肥大反應(yīng)，細(xì)胞體積明顯增大，肌小節(jié)組織顯著增生[15]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，采用ISO刺激小鼠，與對(duì)照組相比較，模型組小鼠心臟、肺臟系數(shù)增大，反映心臟、肺臟重量增加，心臟彩超檢查提示LVEF、LVFS降低，BNP升高，反映小鼠心臟收縮功能下降，病理檢查提示心肌細(xì)胞體積增大，心肌纖維化，ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)明顯升高。以上結(jié)果均提示，經(jīng)ISO處理可以使小鼠心臟增大，心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維化，心臟收縮功能下降，甚至肺水腫產(chǎn)生，這些可能與激活心臟MAPK/ERK1/2/GATA4信號(hào)通路相關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為心氣充沛、血液充盈、脈管通利是血液在全身正常運(yùn)行的基礎(chǔ)，其中充沛的心氣是重要的推動(dòng)力，心氣推動(dòng)氣血津液經(jīng)過脈管運(yùn)行全身，以維持機(jī)體基本生理功能。心氣具有推動(dòng)和溫煦作用，若心氣不足或虧虛，則推動(dòng)和溫煦作用減弱，不能有效推動(dòng)氣血津液流動(dòng)，會(huì)產(chǎn)生瘀血、痰濁、水飲等實(shí)邪，阻滯氣機(jī)，影響氣血運(yùn)行，使心失濡養(yǎng)，產(chǎn)生胸悶、氣短乏力、動(dòng)則加重等心衰癥狀?！堵孕牧λソ咧嗅t(yī)診療專家共識(shí)》認(rèn)為心衰屬本虛標(biāo)實(shí)之證，心氣虧虛為發(fā)病之本，因此，益氣扶正是辨治心衰的重要治法。參芪扶正注射液由黨參、黃芪提取而成，具有益氣扶正功效。其中，黃芪具有提高心室收縮功能，減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[16]，抑制心肌肥厚[17]，激活自噬、抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]等作用。黨參具有增強(qiáng)心肌收縮力、增加心輸出量，改善機(jī)體血液流變學(xué)和微循環(huán)等作用[19]。參芪扶正注射液治療心衰患者，可以增強(qiáng)心肌收縮力，減輕心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載、抑制細(xì)胞凋亡，降低血漿中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素-1濃度，抑制心室重構(gòu)[20]。

在慢性心衰的治療中，β受體阻滯劑是一類重要的治療藥物，本實(shí)驗(yàn)選取琥珀酸美托洛爾緩釋片作為陽性對(duì)照，一是考慮心衰的治療，二是作為ISO的拮抗劑。實(shí)驗(yàn)顯示，與模型組比較，陽性組、SQ低劑量組和SQ高劑量組小鼠心臟、肺臟系數(shù)減小，LVEF、LVFS升高，BNP下降，心肌纖維化減輕，ERK1/2、p-ERK1/2、GATA4蛋白表達(dá)下降，提示琥珀酸美托洛爾緩釋片和參芪扶正注射液可改善心衰小鼠的心臟收縮功能，減輕心肌纖維化，抑制MAPK/ERK1/2/GATA4信號(hào)通路。其中，SQ高劑量組效果優(yōu)于SQ低劑量組，在某些方面，高劑量的參芪扶正注射液甚至與美托洛爾緩釋片具有同等效果。

綜上所述，本研究從心臟彩超、病理、血清、免疫印跡蛋白等方面證實(shí)參芪扶正注射液可以改善心力衰竭小鼠的心臟收縮功能、減輕心肌纖維化，這種作用可能與抑制MAPK/ERK1/2/GATA4信號(hào)通路有關(guān)。