白登彥，王 冠，張海軍，朱 濤，趙志鵬，呂立桃

(1.甘肅省第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州 730099；2.西北民族大學(xué)附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730015；3.開(kāi)封市人民醫(yī)院骨一科，河南 開(kāi)封475001)

神經(jīng)根型頸椎病(Cervical spondylotic radiculopathy，CSR)是目前最常見(jiàn)頸椎疾病之一，其臨床表現(xiàn)為頸部的神經(jīng)性疼痛，伴隨炎性反應(yīng)，其發(fā)病主要由椎間盤(pán)退行性功能改變引起的分子生物學(xué)反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[1]，炎癥反應(yīng)是引起CSR疼痛的主要原因。炎癥反應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/絲氧酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)是炎性反應(yīng)的主要信號(hào)通路[2]。當(dāng)AKT被PDK2磷酸化為p-AKT后，激活PKB/AKT，進(jìn)而激活A(yù)KT通過(guò)磷酸化含有絲氨酸殘基的底物Bax 和Bcl-2等因子，促進(jìn)產(chǎn)生抗凋亡的分子生物學(xué)效應(yīng)[3-5]。研究認(rèn)為[6]，PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與脊神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)。其中Bax 和Bcl-2的含量變化與CSR發(fā)病存在密切關(guān)系。CSR在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“項(xiàng)痹”，中醫(yī)藥在臨床治療CSR方面優(yōu)勢(shì)明顯，芍藥甘草湯出自張仲景所著的《傷寒雜病論》，研究[7]顯示其治療CSR的效果明顯，但作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)建立CSR模型大鼠，并用芍藥甘草湯濃縮液灌胃干預(yù)的方法，探究CSR模型大鼠在芍藥甘草湯干預(yù)下PI3K/AKT信號(hào)通路的調(diào)控作用，并分析其對(duì)Bax及Bcl-2的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠90只，20周齡，體重(200±20)g，雌雄各半，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2020-0001。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)造模。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 芍藥甘草湯方藥購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，藥物組成：白芍、甘草各15 g。3MA 試劑，購(gòu)自通化茂祥制藥有限公司，批號(hào)H20200112。Bax(批號(hào)：AC2020002)、Bcl-2(批號(hào)：E2020010)試劑盒，均購(gòu)自上海信帆生物。兔抗大鼠PI3K抗體，購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司，批號(hào)A50003)；兔抗大鼠AKT，購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司(批號(hào)：A30008)；山羊抗兔單抗，購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司(批號(hào)：A21021)；BCA蛋白試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司(批號(hào)：23220)。酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動(dòng)物分組與處理 按照隨機(jī)數(shù)字法將90只大鼠分為空白組、模型組、對(duì)照組、芍藥甘草湯治療低、中、高劑量組共六組，每組15只。除空白組外，其余大鼠按照參考文獻(xiàn)[8]制備CSR大鼠模型。俯臥位固定大鼠，頸部剃毛清潔后消毒，暴露脊椎，顯微外科鑷將消毒后的尼龍魚(yú)線放置在C6-7～T1神經(jīng)根下，縫合。各造模組大鼠1周后進(jìn)行步態(tài)障礙評(píng)分評(píng)價(jià)造模情況。本實(shí)驗(yàn)中造模組大鼠均造模成功。造模后開(kāi)始灌胃治療，空白組大鼠及模型組大鼠給予生理鹽水1 ml/只灌胃，對(duì)照組給予1 ml 3MA(15 mg/kg生理鹽水稀釋)灌胃，芍藥甘草湯低、中、高劑量組大鼠分別按照劑量8、12、16 g/kg給予灌胃，1次/d，共持續(xù)14 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 大鼠步態(tài)評(píng)分測(cè)定：參照文獻(xiàn)[9]步態(tài)方法評(píng)估大鼠造模情況。大鼠步態(tài)正常，左前肢無(wú)畸形，為1分；出現(xiàn)行走時(shí)跛行，左前肢足畸形內(nèi)收蜷縮，輕微持重或不持重為2分；出現(xiàn)抬起、走動(dòng)時(shí)不著臺(tái)面，左前肢足顯著內(nèi)收蜷縮畸形，為3分。記錄并評(píng)分。

1.4.2 樣品取材：灌胃結(jié)束24 h后，按照7.5 μl/g烏拉坦麻醉處死大鼠，取頸部脊髓及神經(jīng)根組織樣品2份，1份置多聚甲醛固定，另1份-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.4.3 ELISA法檢測(cè)組織中Bax和Bcl-2含量變化：按照ELISA試劑說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)各組大鼠組織中Bax和Bcl-2含量變化。

1.4.4 HE法檢測(cè)組織病理學(xué)變化：將提取的組織固定后分別石蠟包埋和組織切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀測(cè)各組大鼠組織病理學(xué)變化。

1.4.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)PI3K、AKT蛋白表達(dá)：各組大鼠組織中分別加入RIPA裂解緩沖液，分別提取組織中的總蛋白，參照BCA蛋白試劑盒說(shuō)明檢測(cè)不同組大鼠脊髓組織中蛋白的含量。SDS-PAGE等量分離蛋白質(zhì)，并于PDVF膜上4 ℃條件添加一抗孵育過(guò)夜。洗滌后添加二抗(1∶200)常溫下進(jìn)行2 h孵育。ECL試劑顯影后應(yīng)用軟件Quantity One測(cè)定蛋白含量的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠治療前后步態(tài)積分比較 見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組和各給藥組大鼠在造模后步態(tài)積分均出現(xiàn)升高(P<0.05)，說(shuō)明CSR模型造模成功。治療14 d后，各給藥組與同期模型組比較，步態(tài)積分均出現(xiàn)不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著芍藥甘草湯劑量增加治療效果更佳(P<0.01)。

表1 各組大鼠治療前后步態(tài)積分比較(分)

2.2 各組大鼠組織病理學(xué)比較 空白組大鼠的組織細(xì)胞排列整齊，界限清晰，無(wú)炎癥浸潤(rùn)；模型組大鼠組織細(xì)胞間隙錯(cuò)亂，出現(xiàn)炎性浸潤(rùn)；各藥物組大鼠組織炎性變化逐漸改善(圖1)。

2.3 各組大鼠組織中Bax及Bcl-2含量比較 見(jiàn)表2。與空白組大鼠比較，模型組大鼠的Bax升高，Bcl-2含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組Bax含量降低，Bcl-2含量升高(P<0.05)，且芍藥甘草湯隨劑量增加治療效果更加明顯(P<0.01)。

2.4 各組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表3。與空白組大鼠比較，模型組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各給藥組PI3K、p-AKT蛋白含量表達(dá)升高(P<0.05)，且芍藥甘草湯的治療效果隨劑量增加更加明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

表3 各組大鼠組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)比較

A：空白組；B：模型組；C：對(duì)照組；D：芍藥甘草湯低劑量組；E：芍藥甘草湯中劑量組；F：芍藥甘草湯高劑量組

3 討 論

CSR發(fā)病與體內(nèi)炎性反應(yīng)、代謝異常、細(xì)胞過(guò)度自噬凋亡相關(guān)[10]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)并無(wú)CSR病名的記載，可將CSR歸屬為“ 痿病”“痹證” “項(xiàng)強(qiáng)”等范疇，發(fā)病多與頸項(xiàng)部氣血運(yùn)行不利，而產(chǎn)生的頸部疼痛等表現(xiàn)，根本病因是血虛寒凝，治療原則當(dāng)溫經(jīng)活血、溫陽(yáng)通脈、散寒化濕[11]。芍藥甘草湯始見(jiàn)于《傷寒雜病論》，方含白芍、甘草，是治療疼痛的代表方。白芍味苦、酸，性微寒，既能養(yǎng)血和營(yíng)，柔肝鎮(zhèn)痛，平抑肝陽(yáng)，又可養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗。甘草補(bǔ)中益氣，緩急止痛?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果顯示[12]，白芍的主要成分為白芍總苷、山柰酚及β谷甾醇，能夠調(diào)節(jié)免疫、改善線粒體功能，有修復(fù)受損的纖維環(huán)，減輕組織水腫壓迫，發(fā)揮抗炎止痛的效果。甘草的主要活性成分為槲皮素、芒柄花素和甘草多糖等，能夠清除活性氧自由基、激活白細(xì)胞介素、抑制神經(jīng)炎性反應(yīng)、提高免疫功能[13]。實(shí)驗(yàn)表明[14]，甘草的消炎療效優(yōu)于白芍，白芍的鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于甘草，兩藥物按比例進(jìn)行搭配，效果大于單一藥物的功效，并且藥物濃度越高，抗炎鎮(zhèn)痛的療效越好。

PI3K是細(xì)胞內(nèi)特殊的磷脂酰肌醇激酶，具有脂類(lèi)激酶活性和蛋白激酶活性，G2可被受體酪氨酸激酶或蛋白耦聯(lián)受體激活，再通過(guò)第二信使Bax和Bcl-2，在細(xì)胞的增殖、凋亡等過(guò)程中起重要的作用[15]。Bax和Bcl-2是 PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的2個(gè)關(guān)鍵因子，他們同屬Bcl-2家族，參與細(xì)胞凋亡的重要生物學(xué)因子。其中Bax是促細(xì)胞凋亡的因子，而B(niǎo)cl-2屬于抗細(xì)胞凋亡的因子。研究指出[16]，在線粒體的作用下，Bcl-2家族通過(guò)對(duì)線粒體的介導(dǎo)而對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程起調(diào)控作用。Bax對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控可能通過(guò)誘發(fā)線粒體膜上供凋亡蛋白通過(guò)的離子通道開(kāi)放和精確改變線粒體膜的通透性而釋放CytC；而B(niǎo)cl-2通過(guò)抑制Bax的表達(dá)，抑制細(xì)胞色素C與半胱氨酸蛋白酶激活而起到的抗凋亡作用。研究表明[17-19]，在免疫因子誘導(dǎo)的CSR發(fā)病過(guò)程中，固有免疫發(fā)揮著重要的作用。CSR發(fā)病時(shí)，組織內(nèi)發(fā)生多種特異性免疫反應(yīng)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[17]，Bcl-2在CSR模型大鼠組織中的表達(dá)要高于未造模組。Bcl-2過(guò)度表達(dá)會(huì)影響細(xì)胞正常狀態(tài)下基質(zhì)的分解和合成動(dòng)態(tài)代謝平衡，加速細(xì)胞分解代謝以及自噬凋亡過(guò)程，加速關(guān)節(jié)退變和炎癥病變。

臨床上芍藥甘草湯對(duì)CSR治療效果良好，但該方的具體作用機(jī)制并不清楚[20]。本次研究表明，在造模后大鼠步態(tài)障礙積分升高，組織病理學(xué)顯示，造模后大鼠組織內(nèi)炎性病變明顯，提示CSR大鼠造模成功。經(jīng)治療，各治療組CSR大鼠血清中Bax及Bcl-2含量出現(xiàn)變化，而空白組及模型組無(wú)明顯變化；組織病理學(xué)結(jié)果也顯示各治療組脊髓神經(jīng)根組織炎性病變減輕，這說(shuō)明芍藥甘草湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bax及Bcl-2，抑制CSR大鼠機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)。

PI3K/AKT信號(hào)通路在正常關(guān)節(jié)組織和神經(jīng)組織中活性較低，當(dāng)組織出現(xiàn)特異性免疫反應(yīng)時(shí)，信號(hào)通路中多種蛋白表達(dá)含量出現(xiàn)明顯變化[21-22]。本文結(jié)果也顯示，CSR造模成功后，大鼠出現(xiàn)頸椎關(guān)節(jié)組織炎性反應(yīng)，PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)減少，這說(shuō)明PI3K、AKT蛋白參與CSR的免疫反應(yīng)，也進(jìn)一步說(shuō)明PI3K受體調(diào)控的免疫反應(yīng)機(jī)制與CSR發(fā)病的相關(guān)性。本研究還發(fā)現(xiàn)，給藥組CSR大鼠在芍藥甘草湯治療后PI3K、AKT、Bax表達(dá)出現(xiàn)降低，Bcl-2含量增高，這說(shuō)明芍藥甘草湯可有效降低CSR模型大鼠脊髓組織中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控了Bax和Bcl-2等細(xì)胞因子，影響細(xì)胞凋亡，進(jìn)而控制CSR的疾病進(jìn)展。

綜上所述，PI3K/AKT信號(hào)通路可能通過(guò)靶向調(diào)控Bax和Bcl-2等細(xì)胞因子影響CSR發(fā)病過(guò)程，這也為我們以后治療CSR提供了一個(gè)新方向。