桂厚山，葉路芬，陳昕，馬浩

糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）是糖尿病長(zhǎng)期微血管病變常見(jiàn)的合并癥之一，是由糖尿病導(dǎo)致的慢性腎臟病，DN已經(jīng)成為很多國(guó)家終末期腎臟病的首要病因［1］.由于我國(guó)人口老齡化嚴(yán)重，糖尿病發(fā)病率居高不下，DN患者數(shù)量呈上升趨勢(shì)［2］.現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，DN的發(fā)生機(jī)制與炎癥反應(yīng)、Toll樣受體等有關(guān)，受TGF-beta、Wnt、PI3K/Akt等多種信號(hào)通路的調(diào)控［3-4］.

目前，臨床上對(duì)于DN患者使用中醫(yī)治療能達(dá)到顯著的治療效果.“消渴”“腎消”“尿濁”等中醫(yī)學(xué)描述與DN患者的臨床表現(xiàn)極為相似.水陸二仙丹（SLEP）出自《洪氏集驗(yàn)方》，由芡實(shí)末（Euryale ferox Salisb.ex Konig et Sims）、金櫻子（Rosa Laevigata Michx）制為小丸，并用鹽湯送服，有益腎滋陰、收斂固攝之功.有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)163例DN早期患者使用SLEP治療4周后患者的臨床癥狀和尿白蛋白、腎功能等指標(biāo)均有改善［5］.本研究通過(guò)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探究SLEP治療DN的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、信號(hào)通路以及分子對(duì)接驗(yàn)證，以期為SLEP治療DN具體分子機(jī)制探究，以及臨床合理用藥提供理論依據(jù).

1 方法

1.1 資料與流程

本研究的具體操作流程如圖1所示.

圖1 流程圖

1.2 SLEP有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

根據(jù)2020版《中國(guó)藥典》的藥物規(guī)范名稱(chēng)，當(dāng)SLEP由金櫻子、芡實(shí)兩味中藥組成，通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索金櫻子和芡實(shí)，設(shè)置“OB≥30%，DL≥0.18”，獲取并整理活性成分及靶點(diǎn).結(jié)合PubMed文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)相關(guān)文獻(xiàn)，最終得到SLEP有效成分?jǐn)?shù)據(jù).將上述靶點(diǎn)利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理.文章使用數(shù)據(jù)庫(kù)如表1所示.

表1 本研究使用的數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)

1.3 DN疾病靶點(diǎn)的獲取以及SLEP潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

以“diabetic kidney disease”“diabetic nephropathy”為檢索詞，篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)得到DN疾病靶點(diǎn).利用微生信云平臺(tái)繪制SLEP靶點(diǎn)與DN基因靶點(diǎn)之間的Venn圖，得到交集靶點(diǎn).

1.4 SLEP的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控和核心靶點(diǎn)的獲取

在獲得SLEP的有效成分靶點(diǎn)與DN疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，利用Cytoscape 3.7.1構(gòu)建SLEP的網(wǎng)絡(luò)模型，在String數(shù)據(jù)庫(kù)中將交集靶點(diǎn)帶入，構(gòu)建“SLEP-DN”治療靶點(diǎn)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，以“種屬人、互作分?jǐn)?shù)值為0.4”為篩選標(biāo)準(zhǔn).計(jì)算各靶點(diǎn)間Degree值，Betweenness centrality值、Closeness centrality值，取三者平均值之上的靶點(diǎn)作為核心治療靶點(diǎn).

1.5 GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”，進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析.本研究中GO富集分析以“FDR＜0.01”為篩選條件，使用python的seaborn包進(jìn)行繪制并以氣泡圖形式輸出.KEGG信號(hào)通路分析的結(jié)果將在微生信在線(xiàn)作圖軟件中以氣泡圖形式輸出.

1.6 分子對(duì)接分析

將得到的關(guān)鍵化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，在PyMOL軟件中去除靶蛋白中的配體和非蛋白分子.從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載篩選出的關(guān)鍵成分3D結(jié)構(gòu)，利用PyMOL軟件對(duì)其進(jìn)行處理，最后運(yùn)用AutoDock vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，將對(duì)接良好的分子帶入ProteinsPlus平臺(tái)導(dǎo)出2D結(jié)構(gòu)圖.

2 結(jié)果

2.1 SLEP有效成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選得到SLEP兩味藥物有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等9種活性化合物成分（表2），其主要對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)193個(gè).通過(guò)檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)，檢出與DN相關(guān)的靶點(diǎn)分別為3 379個(gè)、1 189個(gè)、19 264個(gè)，通過(guò)Venn圖獲得SLEP與DN疾病共有85個(gè)交集靶點(diǎn)（圖2），由此可篩選得到SLEP治療DN的交集靶點(diǎn)85個(gè)，隨后通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件繪制“化合物-靶點(diǎn)-疾病”中藥網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖，詳見(jiàn)圖3.

表2 SLEP有效成分

圖2 藥物與疾病的Venn圖

圖3 化合物-靶點(diǎn)-疾病調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 核心靶點(diǎn)篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

在String數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的85個(gè)交集靶點(diǎn)，限定參數(shù)（BC≥0.007 367，CC≥0.635，Degree≥34）拓?fù)浜Y選后獲得27個(gè)核心靶點(diǎn)，使用Cytoscape 3.7.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖4.最終篩選得到SLEP治療DN的核心靶點(diǎn)27個(gè)，分別為

圖4 SLEP治療DN的核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

AKT1、IL-6、TNF、VEGFA、ALB、TP53、MAPK1、CASP3、MAPK8、PTGS2、MMP9、JUN、CXCL8、EGFR、CCL2、EGF、IL1B、MMP2、NOS3、PPARG、SERPINE1、HMOX1、RELA、MPO、PTEN、STAT1、CAV1.

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析和KEGG信號(hào)通路分析

結(jié)果顯示，共有GO條目251個(gè)，其中生物過(guò)程（BP）條目134個(gè)、分子功能（MF）條目84個(gè)、細(xì)胞組成（CC）條目43個(gè)（圖5）.BP主要涉及細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)、血管形成、血管收縮的正向調(diào)節(jié)等過(guò)程；MF主要涉及相同蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合等方面；CC主要涉及細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)等方面.

圖5 GO功能富集分析氣泡圖

SLEP對(duì)治療DN共涉及92條通路KEGG通路富集結(jié)果（圖6和圖7）.結(jié)果顯示，SLEP治療DN的通路主要涉及TNF、FoXO、MAPK、PI3K/Akt、NOD樣受體等信號(hào)通路.

圖6 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖7 靶點(diǎn)-KEGG通路-疾病圖

2.4 分子對(duì)接

本研究選取交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前五的蛋白（AKT1、ALB、IL-6、TNF、VEGFA）、排名前三的活性化合物（山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇）與上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證.核心靶點(diǎn)蛋白基本信息（表3），核心化合物和核心靶點(diǎn)對(duì)接得分熱圖（圖8），具有良好的結(jié)合活性（圖9）.結(jié)果表明，通過(guò)篩選得到的核心化合物和關(guān)鍵靶點(diǎn)具有較好的結(jié)合活性.

表3 核心靶點(diǎn)蛋白基本信息

圖8 SLEP核心化合物和核心靶點(diǎn)對(duì)接得分熱圖

圖9 核心活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接圖

3 討論

本次研究主要涉及3個(gè)核心成分（山奈酚、槲皮素和β-谷甾醇）.槲皮素是黃酮類(lèi)化合物之一，對(duì)腫瘤、病毒的增殖有一定的抑制作用，并且對(duì)心血管疾病和腎臟疾病等也有一定的治療作用.LEI等［17］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素治療8周可延緩小鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖，減輕腎功能損傷，并在16周時(shí)激活db/db小鼠腎皮質(zhì)Hippo通路，槲皮素能有效抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖.JIANG等［18］研究表明，槲皮素可以降低糖尿病小鼠的血尿素氮、血糖、甘油三酯等生物指標(biāo)，還可以改善小鼠的蛋白尿，但是對(duì)小鼠的高密度脂蛋白膽固醇無(wú)明顯影響.此外，LDLR、HMGCR、SREBP-2和SCAP的表達(dá)明顯下調(diào)，可減輕db/db小鼠腎臟脂質(zhì)譜的改變和脂滴的積累，從而減輕db/db小鼠的腎臟損傷.山奈酚是一種天然的多黃酮醇，作為抗糖尿病藥物受到廣泛關(guān)注.有研究發(fā)現(xiàn)［19］，山奈酚通過(guò)促進(jìn)GLP-1、胰島素的釋放和抑制RhoA/Rho激酶改善腎損傷和纖維化.β-谷甾醇可以降低膽固醇和防治心腦血管疾病.BABU等［20］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇與受體后胰島素信號(hào)分子β-arrestin-2、c-Src和IRS-1以及Akt蛋白具有高親和力，能夠減弱胰島素抵抗，減輕高脂飲食誘發(fā)脂肪組織損傷.

通過(guò)對(duì)27個(gè)預(yù)測(cè)治療靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)計(jì)算其拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，獲得4個(gè)關(guān)鍵基因，別是AKT1、IL-6、TNF、VEGFA.AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠調(diào)節(jié)胰島素代謝.研究表明［21-22］，AKT1是PI3K/Akt通路的重要因子，PI3K/Akt細(xì)胞信號(hào)通路在調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成以及細(xì)胞存活等方面起到了重要作用，且胰島素能夠通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)胰島B細(xì)胞功能.TNF-α、IL-6是脂肪細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，能夠參與能量代謝、脂質(zhì)代謝等，在生殖系統(tǒng)和心血管等方面起到重要作用［23］.高血糖可以通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而改善微血管的通透性，通過(guò)促進(jìn)TNF-α、IL-6等的分泌來(lái)加劇炎癥反應(yīng)［24］.有實(shí)驗(yàn)證明，VEGFA可以增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和分化，誘導(dǎo)血管擴(kuò)張、改善血管的通透性，在腎臟發(fā)育中起著重要作用，與糖尿病腎病密切相關(guān)［25］.

信號(hào)通路富集分析結(jié)果顯示：SLEP治療DN的通路有TNF、FoxO、MAPK、PI3K/Akt、NOD樣受體等信號(hào)通路.TNF信號(hào)通路中的TNF-α能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，且含量與DN的損傷程度呈正相關(guān)，在早期高血糖、脂代謝紊亂及胰島素抵抗均發(fā)生微炎癥的產(chǎn)生［26］.FoxO主要通過(guò)生長(zhǎng)因子信號(hào)等來(lái)調(diào)控細(xì)胞的凋亡、增殖和氧化應(yīng)激等，F(xiàn)oxO信號(hào)通路為研究DN機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)［27］.MAPK信號(hào)通路由細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)激酶如ERK、JUN等調(diào)控MAPK，涉及多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化和遷移［28］.PI3K/Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程，是胰島素的主要下游分子通路，胰島素抵抗2型糖尿病發(fā)生的基本機(jī)制都與該通路異常有關(guān)［29-30］，糖尿病狀態(tài)下會(huì)使PI3K/Akt通路受到抑制，功能下調(diào)導(dǎo)致糖尿病大鼠腎小管凋亡［31］，PI3K/Akt信號(hào)通路能通過(guò)調(diào)控腎 組 織 中AQP-1的 表 達(dá) 能 改 善DN癥 狀［32］.NOD樣受體通路是重要的信號(hào)通路之一，具有激活免疫的作用［33］，在接收到刺激后會(huì)通過(guò)信號(hào)傳遞的方式引發(fā)機(jī)體的炎性反應(yīng)，增加炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的表達(dá)，從而使得該通路對(duì)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)有著重要的作用［34］.

4 結(jié)語(yǔ)

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)闡述SLEP治療DN的潛在作用機(jī)制，其中槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等化合物可能通過(guò)IL-6、TNF、VEGFA等靶點(diǎn)及TNF、FoxO、PI3K/Akt等信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種功效，用以改善糖尿病腎病.由于生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)依舊有待完善，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果可能存在部分偏倚，仍需后續(xù)進(jìn)行基礎(chǔ)研究用以佐證.