丁敏 / 上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院

0 引言

2021年國(guó)際法制計(jì)量組織和國(guó)際計(jì)量局發(fā)布的“世界計(jì)量日”主題為“測(cè)量守護(hù)健康”。臨床檢驗(yàn)是健康監(jiān)測(cè)的重要手段，臨床檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確、有效是疾病正確診斷的關(guān)鍵，因此，實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性和可比性就需要建立和保證其量值溯源性。多年來(lái)，臨床檢驗(yàn)量值的溯源問(wèn)題在國(guó)際上受到廣泛重視。歐洲議會(huì)和理事會(huì)在1998年10月簽署關(guān)于體外診斷器具的指令（Directive 98/79/EC），該指令的一項(xiàng)關(guān)鍵內(nèi)容是要求體外診斷器具的校準(zhǔn)物質(zhì)和（或）質(zhì)控物質(zhì)定值的溯源性必須通過(guò)已有的高一級(jí)的參考方法和（或）參考物質(zhì)予以保證[1]。為配合該指令的實(shí)施，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）1999年起草了5個(gè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[2]， 其中與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)密切相關(guān)的ISO 17511中的“體外診斷醫(yī)療器械——校準(zhǔn)品、正確度控制品、人源樣品定值的量值溯源性的建立要求”[3]，明確提出臨床檢驗(yàn)的量值溯源是運(yùn)用參考測(cè)量程序或參考物質(zhì)建立或驗(yàn)證常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由此可見(jiàn)，參考物質(zhì)即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是臨床檢驗(yàn)量值溯源的重要的標(biāo)的，是檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要保障。

1 國(guó)外臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展?fàn)顩r

發(fā)達(dá)國(guó)家從20世紀(jì)中期開(kāi)始重視標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在臨床量值傳遞中的作用，各國(guó)計(jì)量機(jī)構(gòu)將生物、臨床等新興領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展的重點(diǎn)領(lǐng)域。20世紀(jì)60年代美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院（NIST）利用研制的膽固醇系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使全美臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)量血液中膽固醇結(jié)果錯(cuò)誤的陰性和陽(yáng)性數(shù)從1969年的18%穩(wěn)定地減少到近年的3.0%[4]； NIST從2009年以來(lái)投入大量經(jīng)費(fèi)開(kāi)展蛋白質(zhì)組和基因組測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)研究，建立了一批有機(jī)生化及生物大分子等高準(zhǔn)確度計(jì)量方法以及體外診斷的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為診斷試劑盒等的量值溯源提供技術(shù)服務(wù)。2015年，美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬宣布美國(guó)“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”，進(jìn)一步推動(dòng)作為臨床檢驗(yàn)“砝碼”和“標(biāo)尺”的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制和發(fā)展。

位于比利時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和計(jì)量研究所（IRMM）于1970年后期開(kāi)始臨床檢驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，其他國(guó)際組織如國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)（IAEA）等也較早開(kāi)展了這方面的研究工作[5]。世界衛(wèi)生組織（WHO）于1997年發(fā)布首個(gè)用于核酸擴(kuò)增技術(shù)的核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。英國(guó)的國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所（NIBSC）與WHO合作，研制了大量涉及蛋白、抗體、激素等國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。2017年WHO公布的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目錄中共有430種生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中大部分為臨床檢驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

目前，臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目至少有數(shù)百種，由于參考系統(tǒng)的不完善，國(guó)際約定參考測(cè)量程序的空缺，根據(jù)國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（JCTLM）列表顯示，截至2019年，列入JCTLM列表的國(guó)際參考物質(zhì)有295種，參考測(cè)量程序有201個(gè)，18家參考測(cè)量實(shí)驗(yàn)室可以提供187項(xiàng)參考測(cè)量服務(wù)，涉及150種分析項(xiàng)目，其中臨床化學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目137種，涉及類別有維生素和微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、非肽類激素、非電解質(zhì)金屬、代謝物和底物、酶、電解質(zhì)、藥物濃度等[6]。

2 我國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展現(xiàn)狀

我國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展起步較晚，但是發(fā)展迅速，目前，與大眾健康相關(guān)的生物和臨床有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已有近千種。2006年，國(guó)家科技部“863”計(jì)劃將體外診斷試劑及參考物質(zhì)列入專項(xiàng)，項(xiàng)目的目標(biāo)之一是研制16個(gè)臨床生化標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),包括7個(gè)酶學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、7個(gè)無(wú)機(jī)離子標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和2個(gè)小分子代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[7]。近年研制成功的冷凍人血清中無(wú)機(jī)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，血清膽固醇、總甘油、游離甘油和甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，都為相應(yīng)領(lǐng)域的臨床檢驗(yàn)量值溯源提供了有效的保證。

核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面：2005年國(guó)家衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心研制的乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸血清標(biāo)準(zhǔn)品為首個(gè)核酸有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，至今為止核酸/質(zhì)粒有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)發(fā)展迅速，主要為乙肝、丙肝病毒、人類免疫缺陷、人乳頭瘤病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)以來(lái)，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院、上海市計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院迅速響應(yīng)，研制了新型冠狀病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為核酸檢測(cè)質(zhì)量控制提供有力保障[8]。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面，目前，絕大部分蛋白質(zhì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果沒(méi)有溯源性，我國(guó)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有人類免疫球蛋白、血清白蛋白、抗凝蛋白C等不同基體形式、不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。細(xì)菌類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面，微生物菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究方向已由標(biāo)準(zhǔn)菌株向含基體的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方向發(fā)展。

目前，我國(guó)生物類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尚存在以下問(wèn)題：一是復(fù)雜基體類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類少，覆蓋面不夠?qū)?，現(xiàn)今國(guó)內(nèi)研究的生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)多為純物質(zhì)、溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且已有的基體類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特征量以無(wú)機(jī)元素居多，有良好的互換性的血清、全血基體，且表征生物特性量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較少；二是生物大分子類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)種類較少，國(guó)內(nèi)核酸和質(zhì)粒類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)近幾年發(fā)展增速較快，但是蛋白、脂類、生物素、多肽、核酸及細(xì)胞等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)仍較為缺乏，腫瘤和重大傳染病標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亟待開(kāi)發(fā)；三是臨床標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源性有待解決，能溯源到SI單位的主要為一些化學(xué)定義明確的化合物，包括電解質(zhì)類（鉀、鈉、氯等）、代謝物（如膽固醇、甘油三酯、葡萄糖、尿素等）和甲狀腺激素等，生物大分子類物質(zhì)由于沒(méi)有建立參考測(cè)量程序和形態(tài)表征等問(wèn)題帶來(lái)研制的困難。

3 臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是生物測(cè)量量值溯源和比對(duì)的基礎(chǔ)，按其研制過(guò)程包含原材料收集制備、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)、定值、不確定度評(píng)價(jià)、互換性研究等主要步驟。

3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料選擇及制備

1）原材料的選擇

臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)材料的選擇應(yīng)遵循適用性、代表性以及易復(fù)制的原則[9]。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)材料應(yīng)有穩(wěn)定的來(lái)源，保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效復(fù)制，以維持量值的連續(xù)溯源性。另外，生物基體中成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基體選擇應(yīng)考慮其與實(shí)測(cè)樣品的同質(zhì)性，同一臨床檢驗(yàn)指標(biāo)，基體不同測(cè)量結(jié)果會(huì)有較大差異。例如全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清血糖的結(jié)果與快速血糖分析儀測(cè)定末梢血、靜脈全血血糖結(jié)果存在明顯差異[10]，臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基體材料還應(yīng)重視其安全性，要保證材料不攜帶危險(xiǎn)的傳染源、無(wú)生物安全性危害。例如牛血由于不含有肝炎、艾滋病等致病因子，且牛血的基體與人血極為相似，牛血也是較常用的人血替代品[11-14]。

2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

應(yīng)根據(jù)臨床樣本的性質(zhì)選擇合理的制備程序、工藝，防止外來(lái)污染，過(guò)程損失造成特性量值的影響，同時(shí)使樣本具備長(zhǎng)時(shí)間保存的量值穩(wěn)定性。下面列舉了樣本制備的幾種情況：一是試劑的純化。臨床檢驗(yàn)的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分通常需要達(dá)到99.5%以上的含量，需采用重結(jié)晶、區(qū)域熔融等方法對(duì)市售材料進(jìn)行提純[15]，蛋白類材料可通過(guò)離子交換色譜法、排阻色譜法和色譜層析等方法純化[16]；核酸類材料可以通過(guò)層析法、磁珠法或通過(guò)商用的試劑盒進(jìn)行純化[17,18]。二是特性組分的添加。為實(shí)現(xiàn)標(biāo)稱值與臨床檢測(cè)范圍相當(dāng)，可以通過(guò)定量加入外源性成分和測(cè)定添加內(nèi)源性成分的方法制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[19]，添加特性組分時(shí)，要充分考慮引入的雜質(zhì)或組分對(duì)樣本基體的影響。三是樣本的均勻化。采用合適的工藝以及正確運(yùn)用顆粒粉碎和混合技術(shù)，保證樣本顆粒的均勻以及多種基體、材料混合的充分，均勻化的過(guò)程中要及時(shí)進(jìn)行均勻性初檢以對(duì)制備效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。四是樣本的包裝保存處理。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性成分不穩(wěn)定時(shí)需要添加一定的穩(wěn)定劑，如乳糖、蔗糖、甘露醇等。對(duì)于血、尿液等難以穩(wěn)定保存的基體，通常通過(guò)冷凍干燥、冷凍的方法來(lái)保存，也可加入疊氮化鈉或者通過(guò)γ輻照等來(lái)防腐。各種保存方法也需要開(kāi)展可行性評(píng)估，避免對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主成分的影響。例如，有報(bào)告指出，人血清酯蛋白在凍干過(guò)程中發(fā)生變性，且不可逆，因此，NIST在制備人血清酯蛋白SRM-1951-1a時(shí)，放棄了原來(lái)采用的凍干步驟，而采取超低溫-80 ℃保存[20]。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

均勻性檢驗(yàn)是為確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值在材料各部分（或單元）間沒(méi)有差異的過(guò)程。穩(wěn)定性是在一段時(shí)間內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保持其量值的性質(zhì)。我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法中明確規(guī)定，一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性應(yīng)在一年以上，二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性應(yīng)在半年以上。均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)的抽樣方法、檢驗(yàn)要求和檢驗(yàn)方法在JJF 1006-1994《一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》[9]、JJF 1343-2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》[21]、ISO導(dǎo)則35《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-均勻性和穩(wěn)定性的表征和評(píng)價(jià)指南》[22]中有明確規(guī)定。選定均勻性檢驗(yàn)方法時(shí)還需充分考慮實(shí)際最小取樣量是否滿足使用需要，避免評(píng)價(jià)結(jié)果缺乏充分代表性。對(duì)于臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由于儲(chǔ)存條件要求較高，運(yùn)輸條件往往難以達(dá)到要求，因此，在設(shè)計(jì)特定的基體和特性組合時(shí)，應(yīng)在可能的運(yùn)輸溫度條件下進(jìn)行短期穩(wěn)定性研究。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過(guò)程要保證其溯源性，依據(jù)ISO 17511：2020，臨床標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)根據(jù)其等級(jí)采用不同計(jì)量學(xué)等級(jí)的測(cè)量程序或方法進(jìn)行定值，該標(biāo)準(zhǔn)中的溯源到SI單位的完整校準(zhǔn)等級(jí)圖（見(jiàn)圖1），給出一級(jí)參考物質(zhì)（通常為純物質(zhì)）采用質(zhì)量平衡法、定量磁共振、基因測(cè)序等測(cè)量程序進(jìn)行定值，一級(jí)參考物質(zhì)通過(guò)重量法、計(jì)數(shù)法等一級(jí)測(cè)量程序（通常為絕對(duì)法）將量值傳遞到一級(jí)校準(zhǔn)品[23]，再通過(guò)參考程序傳遞到具有臨床互換性的二級(jí)參考物質(zhì)或校準(zhǔn)品。JJF 1855-2000中給出了質(zhì)量平衡法等純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的主要方法和相關(guān)要求[24]。對(duì)于部分定義明確的臨床小分子化合物，定值時(shí)通常使用的方法有等離子體質(zhì)譜法、同位素稀釋質(zhì)譜法、原子吸收法、離子色譜法、液相色譜法[25]。其中，同位素稀釋質(zhì)譜法是臨床上廣泛使用的參考測(cè)量程序，還應(yīng)用于臨床有機(jī)酸、葡萄糖等代謝物以及蛋白等生物大分子的定量測(cè)定。截至2018年，國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(huì)（JCTLM）給出的26個(gè)完整的臨床參考溯源系統(tǒng)中，有19個(gè)項(xiàng)目是基于同位素稀釋質(zhì)譜法作為參考測(cè)量程序的[26]。近年臨床核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值技術(shù)發(fā)展迅速，已有多種病毒核酸類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（dPCR）進(jìn)行準(zhǔn)確定量[27,28]。

圖1 ISO 17511：2020 溯源到SI單位的完整校準(zhǔn)等級(jí)

3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的互換性

ISO 17511：2020對(duì)物質(zhì)互換性定義為“由兩個(gè)測(cè)量程序測(cè)量參考物質(zhì)中的特定量得到的測(cè)量結(jié)果間的關(guān)系，與測(cè)量特定樣品的特定量得到的測(cè)量結(jié)果關(guān)系的一致程度”[3]。出于調(diào)整濃度、貯存和運(yùn)輸?shù)饶康?，?duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料所進(jìn)行的成分調(diào)整（如添加外源性物質(zhì)）或加工（如凍干）等[29]，造成基體與新鮮臨床樣品的差異。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基體如果與天然人體樣品不同或者是經(jīng)過(guò)處理的天然人體樣品，均需要驗(yàn)證其互換性。美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）出版的EP-14 A3《處理樣本的互換性評(píng)價(jià)》給出了臨床標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可互換性評(píng)價(jià)方法[30]。

以牛血清中鉀鈉氯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的可互換性試驗(yàn)說(shuō)明[19]：選取20份病人新鮮血清作為分析樣本，5份牛血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為對(duì)比樣本，以原子吸收分光光度法和臨床檢驗(yàn)離子選擇性電極法在同一天內(nèi)對(duì)上述所有樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)順序?yàn)閷?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機(jī)插入病人新鮮血清。病人新鮮血清樣本用原子吸收分光光度法檢測(cè)結(jié)果的平均值和用離子選擇性電極法檢測(cè)結(jié)果的平均值，采用戴明（demiding’s）線性回歸法擬合回歸方程，將牛血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原子吸收分光光度法檢測(cè)值代入回歸式得到對(duì)應(yīng)離子選擇性電極法回歸預(yù)期值，通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算給出的置信概率為95%的可信區(qū)間，若離子選擇性電極法檢測(cè)牛血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到的結(jié)果是處于該區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為處理后的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基體與新鮮血清的基體差異可接受。

4 結(jié)語(yǔ)

臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制是發(fā)展和完善臨床檢驗(yàn)參考系統(tǒng)的必然要求，開(kāi)展臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制需要加強(qiáng)計(jì)量部門、臨床檢驗(yàn)管理部門、臨床實(shí)驗(yàn)室、診斷試劑和儀器生產(chǎn)廠商等領(lǐng)域的合作。以需求為導(dǎo)向，加快研制多發(fā)性疾病、危害性較大疾病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；同時(shí)密切關(guān)注國(guó)內(nèi)外行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)，瞄準(zhǔn)體外診斷高新領(lǐng)域，研制高準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，助力我國(guó)分子診斷POCT、基因芯片、液體活檢和質(zhì)譜檢測(cè)等前沿新技術(shù)的臨床應(yīng)用。