姚升娟， 曲靜琦， 曹宇， 郭雅雯， 沈文

原發(fā)性肝癌作為一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。目前對(duì)于肝癌的治療方法，主要包括手術(shù)、肝移植和經(jīng)皮穿刺射頻消融(radiofrequency ablation，RFA)[2]。雖然根治性手術(shù)是治療肝癌最有效的方式，但經(jīng)手術(shù)切除后，患者發(fā)生并發(fā)癥的概率大大增加。近年來(lái)，隨著RFA等新型技術(shù)的發(fā)展和成熟，已被廣泛應(yīng)用于肝癌的治療中，除了具有微創(chuàng)、簡(jiǎn)便、可重復(fù)操作等優(yōu)勢(shì)，其療效和安全性也得到了廣大臨床醫(yī)師及患者家屬的認(rèn)可[3]。然而，也有多項(xiàng)研究表明，不同個(gè)體應(yīng)用RFA治療后的療效和復(fù)發(fā)情況存在差異[4,5]。因此，早期預(yù)測(cè)及評(píng)估RFA對(duì)原發(fā)性肝癌患者治療后的療效和復(fù)發(fā)情況對(duì)選擇合適的治療方法及改善患者預(yù)后具有重要意義。MRI具有成像序列多、軟組織分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)散加權(quán)成像可無(wú)創(chuàng)性精準(zhǔn)測(cè)定腫瘤細(xì)微結(jié)構(gòu)和活性情況，通過(guò)測(cè)量表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)值，MRI在肝癌診斷等方面具有重要意義[6,7]。但目前關(guān)于MRI在預(yù)測(cè)RFA治療肝癌效果及復(fù)發(fā)中的研究還較少。此外，微小RNA(micro RNA，miR)因其在細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等過(guò)程中的調(diào)控作用，近年來(lái)成為眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)。最近的研究表明，miR-204在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中起到重要作用，因此可能是肝癌診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物[8,9]，然而目前尚未有研究報(bào)道血清miR-204在肝癌經(jīng)RFA治療后療效及復(fù)發(fā)情況中的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究旨在探討MRI、血清miR-204及兩者聯(lián)合在肝癌經(jīng)RFA治療后療效和復(fù)發(fā)情況中的預(yù)測(cè)價(jià)值，以期為臨床治療決策的選擇提供參考依據(jù)。

材料與方法

1.病例資料

選擇2019年8月-2020年8月于本院行RFA治療的原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》中的診斷標(biāo)準(zhǔn),確診為原發(fā)性肝癌；②合并肝硬化；③腫瘤直徑<3 cm，且肝功能Child-Pugh分級(jí)為A或B級(jí)；④肝腫瘤數(shù)目不超過(guò)3個(gè)；⑤治療前未接受其他治療方案,臨床及影像學(xué)資料完整。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、腦、肺、腎疾病；②合并其他部位惡性腫瘤；③患有自身免疫性疾病。最終，本研究納入212例肝癌患者，其中男114例，女98例，平均年齡(58.28±5.38)歲。本研究所有程序均符合赫爾辛基宣言，獲得了醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批號(hào)：H2019073)。所有研究對(duì)象均自愿參與研究，并簽署了知情同意書(shū)。

2.研究方法

MRI檢查方法：于RFA術(shù)前一周內(nèi)對(duì)研究對(duì)象采用西門(mén)子3.0T Skyra MRI掃描儀行MRI檢查，先行常規(guī)MRI，然后行擴(kuò)散加權(quán)成像，最后行增強(qiáng)掃描。增強(qiáng)掃描對(duì)比劑采用釓塞酸二鈉(商品名：普美顯，德國(guó)拜耳醫(yī)藥)，劑量0.1 mL/kg，流率1 mL/s,經(jīng)肘前靜脈注入。采用MRI工作站進(jìn)行定量分析，全容積畫(huà)法手動(dòng)勾畫(huà)感興趣區(qū)，在軸面圖像病灶連續(xù)層面上對(duì)病灶邊緣進(jìn)行手動(dòng)勾畫(huà)，確保包含整個(gè)病灶，記錄表觀擴(kuò)散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)值，共測(cè)量5次，取平均值作為病灶A(yù)DC值并進(jìn)行記錄。

圖1 患者,男,56歲,RFA治療后肝癌完全消融(箭)。 圖2 患者,女,42歲,RFA治療后肝癌完全消融(箭)。 圖3 患者,男,48歲,RFA治療后肝癌殘留(箭)。 圖4 患者,男，57歲,RFA治療后肝癌殘留(箭)。

血清miR-204水平測(cè)定:RFA術(shù)前抽取研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，然后于4℃、3000轉(zhuǎn)/min條件下離心10 min，取上層血清，置于-80℃條件下待用。采用定量實(shí)時(shí)聚合酶聯(lián)反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法測(cè)定血清中miR-204的相對(duì)表達(dá)量。由上海云序生物科技有限公司設(shè)計(jì)并提供引物，miR-204的引物序列如下：miR-204(F)：5′-ACGAAATGACCCATTGACCGT-3′，(R):5'- GAACCTCCAACGGAGAAGCG-3′；內(nèi)參基因U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系包括0.75 μL E×12 TaqMan⑧基因表達(dá)檢測(cè)液，7.5 μL TaqMan PCR反應(yīng)混合液，3 μL cDNA模板，再加ddH2O至15 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共循環(huán)40次，然后采用熒光定量PCR儀進(jìn)行定量測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法對(duì)miR-204的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，應(yīng)用2-ΔΔCT法計(jì)算結(jié)果并記錄。

3.療效評(píng)估及復(fù)發(fā)判斷標(biāo)準(zhǔn)

于RFA術(shù)后1個(gè)月再次進(jìn)行MRI檢查，參照原發(fā)性肝癌診療規(guī)范對(duì)治療效果進(jìn)行評(píng)估，判斷是否完全消融。對(duì)于有腫瘤殘留的患者，予以再次射頻消融治療，但不納入隨訪(fǎng)。對(duì)完全消融組患者定期進(jìn)行電話(huà)或門(mén)診隨訪(fǎng)，截止時(shí)間為患者死亡或出院后1年，記錄患者復(fù)發(fā)情況。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。應(yīng)用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線(xiàn)評(píng)估ADC值、血清miR-204及兩者聯(lián)合在預(yù)測(cè)RFA治療后療效和復(fù)發(fā)中的效能，兩者聯(lián)合的計(jì)算公式=β常量+ADC值×βADC值+miR-204×βmiR-204。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.不同療效肝癌患者的一般特征比較

經(jīng)RFA治療后，完全消融患者182例(85.8%，完全消融組)，腫瘤殘留患者30例(14.2%，殘留組，圖1～4)。兩組患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級(jí)、RFA前AFP及合并疾病情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，表1)。

表1 兩組患者的一般特征比較 (例)

2.不同療效肝癌患者的ADC值、血清miR-204水平比較

完全消融組的ADC值為(1.30±0.12)×10-3mm2/s，顯著高于殘留組[(1.14±0.12)×10-3mm2/s]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.091，P<0.001)；完全消融組的血清miR-204相對(duì)表達(dá)量為(1.43±0.12)，顯著高于殘留組[(1.25±0.10)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.246，P<0.001)。

3.ADC值、miR-204水平預(yù)測(cè)RFA術(shù)后療效的效能

ADC值預(yù)測(cè)RFA術(shù)后腫瘤殘留的AUC為0.837(95%CI：0.750～0.923)，截?cái)嘀禐?.16，敏感度為70.0%，特異度為90.7%；血清miR-204預(yù)測(cè)RFA術(shù)后腫瘤殘留的AUC為0.860(95%CI：0.805～0.916)，截?cái)嘀禐?.38，敏感度為96.7%，特異度為66.5%；ADC值聯(lián)合血清miR-204預(yù)測(cè)RFA術(shù)后腫瘤殘留的AUC為0.915(95%CI：0.861～0.970)，截?cái)嘀等DC值=1.20，miR204=1.31，此時(shí)敏感度為86.7%，特異度為90.7%(圖5)。

圖5 ADC值、miR-204水平及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)RFA術(shù)后療效的ROC曲線(xiàn)。

4.不同復(fù)發(fā)情況肝癌患者的一般特征比較

對(duì)RFA治療后完全消融的182例肝癌患者進(jìn)行隨訪(fǎng)，期間11例患者失訪(fǎng)，將其剔除。最終32例患者復(fù)發(fā)(復(fù)發(fā)組，圖6、7)，復(fù)發(fā)率為18.7%，139例患者未復(fù)發(fā)(未復(fù)發(fā)組)。未復(fù)發(fā)組與復(fù)發(fā)組兩組患者的性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級(jí)、RFA術(shù)前AFP及合并疾病情況比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05，表2)。

圖6 患者，男，28歲， RFA治療后腫瘤復(fù)發(fā)(箭)。 圖7 患者，男，57歲，RFA治療后腫瘤復(fù)發(fā)(箭)。 圖8 ADC值、miR-204水平及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)RFA術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線(xiàn)。

表2 兩組患者的一般特征比較 (例)

5.不同復(fù)發(fā)情況肝癌患者的ADC值、miR-204水平比較

復(fù)發(fā)組的術(shù)前ADC值為(1.21±0.14)×10-3mm2/s，低于未復(fù)發(fā)組[(1.33±0.13)×10-3mm2/s]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.052，P<0.001)；復(fù)發(fā)組的血清miR-204相對(duì)表達(dá)量為(1.29±0.12)，低于未復(fù)發(fā)組[(1.46±0.14)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.188，P<0.001)。

6.ADC值、miR-204水平預(yù)測(cè)RFA術(shù)后復(fù)發(fā)的價(jià)值

ADC值預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的AUC為0.742(95%CI：0.646～0.838)，截?cái)嘀禐?.22，敏感度為53.1%，特異度為82.0%；血清miR-204預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的AUC為0.822(95%CI：0.746～0.898)，截?cái)嘀禐?.34，敏感度為71.9%，特異度為84.2%；ADC值聯(lián)合血清miR-204預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的AUC為0.868(95%CI：0.807～0.929)，截?cái)嘀等DC值=1.22，miR-204=1.42，此時(shí)敏感度為81.3%，特異度為79.1%(圖8)。

討 論

RFA是將電極刺入腫瘤中，通過(guò)發(fā)射頻波，使腫瘤局部溫度升高，從而使癌細(xì)胞變性壞死，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的[10]。作為臨床非手術(shù)治療肝癌的主要方法，RFA具有創(chuàng)傷小、并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)[11]。然而，相關(guān)研究表明RFA術(shù)后部分肝癌患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)。因此早期評(píng)估RFA治療后的療效和預(yù)后對(duì)選擇治療方式、改善患者預(yù)后具有重要意義。MRI檢查在肝癌療效評(píng)估中具有重要價(jià)值。近年來(lái)，大量研究顯示血清分子標(biāo)志物對(duì)肝癌療效和預(yù)后評(píng)估具有重要意義，miR-204已被證實(shí)在肝癌的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性中參與調(diào)控作用[9,12]。因此本研究探討了MRI聯(lián)合血清miR-204在RFA治療原發(fā)性肝癌后療效和復(fù)發(fā)情況中的預(yù)測(cè)價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)RFA治療后，完全消融患者占85.8%，腫瘤殘留患者占14.2%，這與李世興等[13]之前報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似。對(duì)治療有效與無(wú)效組的基礎(chǔ)資料進(jìn)行比較，結(jié)果顯示性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位、Child- Pugh分級(jí)、RFA前AFP及合并疾病情況兩組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這提示可能有其他因素與RFA治療后的療效有關(guān)。之前的研究表明腫瘤直徑和腫瘤位置是影響腫瘤預(yù)后的重要因素[14]。鄭孝文等[14]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)病灶直徑≥3 cm時(shí)，可導(dǎo)致病灶殘留率升高，當(dāng)病灶位于大血管下方時(shí)，也可導(dǎo)致病灶殘留率升高。本研究中，殘留組和復(fù)發(fā)組的腫瘤直徑大于完全消融組和未復(fù)發(fā)組，雖然完全消融組與殘留組、復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P值均接近0.05(分別為0.055和0.053)；此外，完全消融組與殘留組、復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的的腫瘤部位分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P值亦均接近0.05(分別為0.053和0.059)，與以上文獻(xiàn)報(bào)道不符，筆者分析可能的原因如下：①本研究是一項(xiàng)前瞻性研究，醫(yī)生對(duì)處于特殊位置的腫瘤病灶可能更加關(guān)注，對(duì)特殊部位的腫瘤改進(jìn)了穿刺操作技術(shù)，并且操作更加謹(jǐn)慎，所以可能降低了特殊位置腫瘤的殘留率；②本研究樣本量不夠大，且納入的腫瘤直徑均<3 cm，可能導(dǎo)致一定程度上的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚；雖然完全消融組與殘留組、復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的腫瘤直徑、腫瘤部位分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但P值均接近0.05，說(shuō)明兩組間還是有明顯差異的。本研究結(jié)果顯示，殘留組的ADC值顯著低于完全消融組，這與之前的研究結(jié)果一致[15]。擴(kuò)散加權(quán)成像能從分子水平反映組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)，ADC值便是其重要指標(biāo)。之前的研究表明，經(jīng)RFA治療后消融區(qū)細(xì)胞發(fā)生不同程度的變性壞死，細(xì)胞組織間水分子增多，擴(kuò)散速率增快，對(duì)應(yīng)擴(kuò)散圖像上的低信號(hào)，ADC值也隨之增大[15]，因此可通過(guò)比較腫瘤內(nèi)部的ADC值分析其內(nèi)部變化。此外，本研究發(fā)現(xiàn)殘留組的血清miR-204水平也顯著低于完全消融組。之前的研究顯示，miR-204對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖具有抑制作用，并且可通過(guò)靶向NUAK1抑制肝癌耐藥，因此當(dāng)miR-204水平降低時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致治療效果較差[16]。本研究結(jié)果顯示，ADC值和血清miR-204水平降低可能預(yù)示著RFA治療效果不佳,并對(duì)這2個(gè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行了ROC曲線(xiàn)分析;結(jié)果顯示，ADC值預(yù)測(cè)RFA術(shù)后腫瘤殘留的特異度較高(90.7%)，但敏感度不佳(70.0%)，血清miR-204預(yù)測(cè)RFA術(shù)后腫瘤殘留的敏感度較高(96.7%)，但特異度有所欠缺(66.5%)，因此，筆者嘗試聯(lián)合ADC值與血清miR-204對(duì)術(shù)后療效進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示，兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的敏感度為86.7%，特異度為90.7%，效能較高。因此，ADC值聯(lián)合血清miR-204對(duì)預(yù)測(cè)RFA治療肝癌后的療效具有較高價(jià)值。

筆者進(jìn)一步對(duì)治療后效果較好的182例患者進(jìn)行了為期1年的定期隨訪(fǎng)，剔除11例失訪(fǎng)患者后，共有171例患者完成了隨訪(fǎng),其中32例(18.7%)患者復(fù)發(fā)，這與孟兆偉等[15]報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似。本研究結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)組的ADC值和血清miR-204均顯著低于未復(fù)發(fā)組。之前研究發(fā)現(xiàn)，ADC值是微血管侵犯的獨(dú)立影響因素，在一定程度上ADC值可反映肝癌細(xì)胞的侵襲情況，與肝癌復(fù)發(fā)有關(guān)。Yu等[16]的研究顯示，miR-204是一種腫瘤抑制因子，在肝癌的疾病進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中具有重要調(diào)控作用，miR-204表達(dá)降低預(yù)示著患者預(yù)后不良。筆者進(jìn)一步對(duì)ADC值、血清miR-204預(yù)測(cè)RFA治療后復(fù)發(fā)的效能進(jìn)行了評(píng)估,結(jié)果顯示ADC值聯(lián)合血清miR-204預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的敏感度為81.3%，特異度為79.1%，效能較高。

本研究存在以下局限性：首先，本研究所有的研究對(duì)象均來(lái)自同一家醫(yī)院，因此選擇偏倚不可避免；其次，本研究的樣本量較小，可能會(huì)造成一定程度上的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚，進(jìn)而影響模型的要素選擇，因此本研究的結(jié)論還需更大樣本量研究的證實(shí)；最后，本研究是一項(xiàng)前瞻性研究，研究設(shè)計(jì)中的盲法至關(guān)重要，但是在實(shí)施過(guò)程中無(wú)法嚴(yán)格貫徹盲法，因此可能也造成了一定程度上的偏倚。

綜上所述，MRI聯(lián)合血清miR-204對(duì)原發(fā)性肝癌RFA術(shù)后療效及復(fù)發(fā)情況具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，可為臨床治療決策的選擇提供參考依據(jù)。