張雅莉，韓建勛,，宋 薇，魏海燕，侯衛(wèi)靜，富 玉，付 萌，李 婷

(1.譜尼測(cè)試集團(tuán)股份有限公司，北京 100095；2.譜尼測(cè)試集團(tuán)北京檢驗(yàn)認(rèn)證科學(xué)研究院有限公司，北京 100095)

可可是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其種子可可豆可制作成可可粉等可可制品?？煽煞酆胸S富的多酚、可可堿、可可脂、粗纖維、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)和活性成分，是世界上三大嗜好性飲料之一[1-3]。目前，全球?qū)煽傻男枨笳谌找嬖黾覽4]，約有60個(gè)國家種植可可樹，然而只有厄瓜多爾等少數(shù)國家是可可的主要出口國[4-5]，導(dǎo)致可可價(jià)格一直居高不下[6]，給可可及可可制品的質(zhì)量把控提出了更高要求?？煽煞壑袚饺肟煽蓺な浅Ｒ姷馁|(zhì)量問題[2,7]，其存在不僅會(huì)影響感官體驗(yàn)，還可能引起霉菌毒素、重金屬或微生物等污染[8]?？煽煞壑锌煽蓺さ膿饺胫饕?種途徑：1) 人為添加，為牟取暴利一些不法企業(yè)以飼料名義進(jìn)口可可殼，粉碎加工后噴上可可香精摻入可可粉中[9]；2) 生產(chǎn)過程殘存，在一定程度上，可可加工過程中可可殼的殘存是不能完全避免的[8,10]?？煽煞壑锌煽蓺さ膿饺肓渴瞧滟|(zhì)量控制的重要參數(shù)[9]，目前國內(nèi)外尚無可可粉中可可殼摻入量的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，國際食品法典委員會(huì)(Codex Alimentarius Commission, CAC)發(fā)布的CXS 141-1983標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可可漿和可可蛋糕中可可殼摻入量的限值為5%，已成為可可加工行業(yè)普遍接受的可可殼摻入限值[8]。

目前，可可粉中可可殼摻入量的檢測(cè)方法有顯微鏡法[11]、重量法[12]、分光光度法[13]、液相色譜法[9,14-15]以及近紅外光譜法[16]等，均取得了較好的研究進(jìn)展。顯微鏡法操作簡(jiǎn)單，但難以定量[9]；重量法通過測(cè)定可可粉溶液中沉降成分的質(zhì)量來評(píng)估可可殼的摻入量，難以得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果[17]；分光光度法和液相色譜法主要通過測(cè)定可可粉或可可殼中多糖、脂質(zhì)、脂肪酸色酰胺等特征成分含量來評(píng)估可可殼含量，但是方法的靈敏度較低[9]。胡明華等[2]利用酸水解及柱前衍生的HPLC指紋圖譜法分析可可粉的多糖組分，結(jié)合系統(tǒng)聚類分析法可對(duì)摻入15%及以上可可殼的可可粉予以鑒別；張九魁等[9]建立了固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法檢測(cè)可可粉中二十二烷酸色酰胺和二十四烷酸色酰胺的含量，鑒別出摻入5%及以上可可殼的摻假可可粉。近紅外光譜技術(shù)具有快速、無損等優(yōu)點(diǎn)，其結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立模型后，可實(shí)現(xiàn)可可粉中可可殼的定性定量檢測(cè)，但該方法對(duì)于定標(biāo)樣本數(shù)據(jù)和模型的精確性都有很高的要求，需采集廣泛的代表性樣本，才能保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性[8,18-19]。超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-tandem mass spectrometry, UPLC-Q-TOF MS/MS)將具有高分離度、高靈敏度的液相色譜系統(tǒng)與能同時(shí)提供母離子和碎片離子準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)以及元素組成的高分辨質(zhì)譜有機(jī)結(jié)合，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中未知化合物的鑒定具有優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域的摻假鑒別研究[20-21]。

本研究擬采用UPLC-Q-TOF MS/MS技術(shù)結(jié)合UNIFI軟件以及化學(xué)計(jì)量學(xué)算法，通過確定可可殼相對(duì)于可可粉的特征標(biāo)志物，建立可可粉中摻雜可可殼的定量檢測(cè)方法，旨為可可粉的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Waters Xevo G2-XS QTOF/UPLC系統(tǒng)：美國Waters公司產(chǎn)品，配有MassLynx軟件(V4.1)和UNIFI軟件(V1.9.4)；ST-04A多功能粉碎機(jī)：上海樹立儀器儀表有限公司產(chǎn)品；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會(huì)社產(chǎn)品；AB135-S分析天平(感量0.01 mg)、AB204-S分析天平(感量0.1 mg)：瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品；0.22 μm有機(jī)相濾膜(尼龍)：天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

可可豆(4個(gè)批次，產(chǎn)地為厄瓜多爾)，可可粉(來源4個(gè)不同生產(chǎn)廠家)，以上樣品均于室溫避光儲(chǔ)藏。

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher Scientific公司產(chǎn)品；乙酸銨：優(yōu)級(jí)純，天津津科精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；亮氨酸腦啡肽：分析純，美國Waters公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備 自制可可粉和可可殼粉：將可可豆果實(shí)(可食部分)和可可豆果皮分開，磨粉過125目篩，分別標(biāo)記為可可粉組(G組)和可可殼粉組(K組)，置于陰涼干燥處，待測(cè)。

模擬制備可可粉中摻雜可可殼粉：分別稱取0、0.1、0.5、1、2、5 g(精確0.001 g)可可殼粉于50 mL干燥具塞離心管中，再加入一定量的可可粉至共10 g，充分混合，制備得到可可殼摻入量分別為0、1%、5%、10%、20%、50%的可可粉摻雜模擬樣品，置于陰涼干燥處，待測(cè)。

盲樣制備：分別將4個(gè)批次的可可粉和可可殼粉進(jìn)行等比例混合，得到混合的可可粉和可可殼粉；再將以上不同批次混合后的可可粉和可可殼粉按一定比例混合，模擬制成3個(gè)盲樣，置于陰涼干燥處，待測(cè)。

1.3.2樣品前處理 準(zhǔn)確稱取約1 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL具塞離心管，加約20 mL甲醇，渦旋混勻，超聲20 min；取出后以8 000 r/min離心5 min，收集上清液，向殘?jiān)屑尤?0 mL甲醇重復(fù)提取，合并上清液；將上清液于40 ℃旋蒸至干，加入1 mL甲醇復(fù)溶，過0.22 μm濾膜，待分析。其中，為監(jiān)測(cè)儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性，在進(jìn)行可可粉和可可殼粉樣品前處理后，吸取同等體積的樣品溶液混勻，作為質(zhì)控(QC)樣品。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

1.3.3儀器條件 液相色譜條件： Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)；柱溫40 ℃；流動(dòng)相：MSE和MS/MS模式下流動(dòng)相A分別為水和乙酸銨水溶液(5 mmol/L)，流動(dòng)相B均為乙腈，洗脫梯度列于表1；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度Table 1 Elution gradient of mobile phase

MSE模式質(zhì)譜條件：ESI離子源，正、負(fù)離子模式；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；靈敏度模式掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200；掃描時(shí)間0.2 s；碰撞能量：低碰撞能量為off，高碰撞能量為10～35 eV；實(shí)時(shí)校正液：亮氨酸腦啡肽，正離子條件m/z556.277 1，負(fù)離子條件m/z554.261 5。

UNIFI軟件參數(shù)設(shè)置：高能量和低能量下響應(yīng)閾值分別為50、250；精確質(zhì)量偏差閾值5 mu；可識(shí)別的化合物加合峰形式包括+H、+H2O+H、-H、+e峰；實(shí)時(shí)校正液：亮氨酸腦啡肽，正離子條件m/z556.276 6，負(fù)離子條件m/z554.262 0。

MS/MS模式質(zhì)譜條件：ESI離子源，負(fù)離子模式；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度250 ℃；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；毛細(xì)管電壓2.0 kV；錐孔電壓40 V；靈敏度模式掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z50～500；監(jiān)測(cè)母離子m/z375.18，監(jiān)測(cè)子離子m/z191.07*、289.07(*為定量離子)；掃描時(shí)間0.2 s；碰撞能量15～40 eV；實(shí)時(shí)校正液：亮氨酸腦啡肽，m/z554.261 5。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將采集的可可粉(G組)和可可殼粉(K組)MSE數(shù)據(jù)導(dǎo)入U(xiǎn)NIFI軟件中完成質(zhì)量校正、加合離子設(shè)定等處理，進(jìn)行化合物峰提取，并結(jié)合UNIFI軟件自帶的天然活性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行自動(dòng)匹配鑒定；將經(jīng)UNIFI軟件處理的數(shù)據(jù)導(dǎo)入EZinfo軟件進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis, PCA)與有監(jiān)督的正交偏最小二乘法-判別式分析(orthogonal partial least squares-discriminate analysis, OPLS-DA)。

1.5 特征標(biāo)志物的篩選與鑒定

根據(jù)OPLS-DA模型的變量投影重要性(variable importance in the project, VIP)篩選潛在特征標(biāo)志物，設(shè)置VIP≥3，且以僅存在于可可殼中為原則確定可可殼的特征標(biāo)志物，并進(jìn)行鑒定。

1.6 定量檢測(cè)模型的構(gòu)建

為定量檢測(cè)可可粉樣品中可可殼粉的摻入情況，在可可粉中加入可可殼粉，制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0%、1%、5%、10%、20%和50%的可可粉摻雜模擬樣品，按照1.3.3節(jié)MS/MS模式的液相色譜和質(zhì)譜方法上機(jī)采集數(shù)據(jù)，以可可粉中可可殼粉的摻入量為橫坐標(biāo)，特征標(biāo)志物苦木內(nèi)酯Ⅰ的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 可可粉與可可殼粉代謝指紋圖譜分析

采用UPLC-Q-TOF MS/MS技術(shù)在正、負(fù)離子模式下采集可可粉和可可殼粉樣品的信息，生成基峰色譜圖(base peak intensity, BPI)，示于圖1。可見，可可粉和可可殼粉中的相關(guān)組分在28 min內(nèi)均得到較好的分離和響應(yīng)值，且譜峰差異明顯。通過統(tǒng)計(jì)圖1的譜峰，在正離子模式下，可可粉和可可殼粉分別有31、32個(gè)響應(yīng)較高的譜峰；而在負(fù)離子模式下，可可粉和可可殼粉分別有58、61個(gè)響應(yīng)較高的譜峰；負(fù)離子模式下的離子響應(yīng)明顯優(yōu)于正離子模式。因此，本研究采用負(fù)離子模式對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

注：a，b.正離子模式;c，d.負(fù)離子模式

使用UNIFI軟件處理負(fù)離子模式下采集的MSE原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行峰識(shí)別和對(duì)齊后，得到包含母離子質(zhì)荷比、保留時(shí)間和離子響應(yīng)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，結(jié)合UNIFI軟件自帶的天然活性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫對(duì)可可粉和可可殼粉中響應(yīng)較高的譜峰進(jìn)行歸屬，其相關(guān)信息分別列于表2和表3。

表2 負(fù)離子模式下，可可粉中鑒定的成分Table 2 Components of cocoa powder identified in negative ion mode

表3 負(fù)離子模式下，可可殼粉中鑒定的成分Table 3 Components of cocoa shell powder identified in negative ion mode

2.2 定性判別分析

PCA分析屬于一種模糊識(shí)別方式，是將復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，剔除冗余數(shù)據(jù)后，找出對(duì)整體貢獻(xiàn)值最大的信息[22]，通過原始數(shù)據(jù)直觀地反映2組樣品間的整體差異，但是無法消除隨機(jī)誤差和組內(nèi)誤差[23]。將2.1節(jié)UNIFI軟件分析得到的包含母離子質(zhì)荷比、保留時(shí)間和離子響應(yīng)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入EZinfo軟件進(jìn)行PCA分析。結(jié)果表明，所有QC樣品在PCA得分圖上緊密聚集在一起，而且同1個(gè)樣品的3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)也緊密聚集在一起，表明數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠，示于圖2。G組和K組樣品在PCA模型的第二主成分上聚集成2類，示于圖2a，表明可可粉和可可殼粉的化學(xué)成分存在明顯差異。同時(shí)，2組樣品點(diǎn)分布都有所離散，表明不同批次間的可可粉和可可殼也存在一定的組分差異。

圖2 可可粉與可可殼粉的PCA(a)和OPLS-DA(b)得分圖Fig.2 PCA (a) and OPLS-DA (b) scores plot of cocoa powder and cocoa shell powder

OPLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，可降低樣品組內(nèi)差異、放大組間差異，排除無關(guān)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)造成的影響，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣品的有效預(yù)測(cè)[24]。為充分提取2組樣品檢測(cè)的差異信息，準(zhǔn)確篩選出可可殼粉的特征標(biāo)志物，進(jìn)一步采用OPLS-DA模型分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，可可粉和可可殼粉樣品在OPLS-DA得分圖上聚集成2類，得以明顯區(qū)分，示于圖2b。

2.3 定量檢測(cè)分析

2.3.1特征標(biāo)志物的應(yīng)用 通過建立OPLS-DA模型，得到可可粉與可可殼粉的S-plot圖，示于圖3。在S-plot圖中分布的點(diǎn)越靠近兩極，代表對(duì)應(yīng)化合物對(duì)2組樣品分組的貢獻(xiàn)程度越大，VIP值也越大。以VIP≥3且S-plot圖中的模型參數(shù)p[1]>0為篩選條件，初步得到119個(gè)化合物信息，這些化合物在可可殼粉中的含量均大于可可粉中的含量。選擇在K組中檢測(cè)到而在G組中未檢測(cè)到的化合物作為特征標(biāo)志物，共得到23個(gè)化合物信息，如tR=1.83 min(m/z267.048 9)、tR=2.10 min(m/z315.072 5)、tR=3.48 min(m/z467.121 1)、tR=6.04 min(m/z187.095 0)、tR=6.66 min(m/z177.016 7)、tR=12.34 min(m/z375.183 1)、tR=18.88 min(m/z331.244 9)、tR=19.38 min(m/z313.235 6)等，對(duì)其進(jìn)一步推測(cè)鑒定。其中，tR=12.34 min(m/z375.183 1)經(jīng)與天然活性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配，鑒定為苦木內(nèi)酯Ⅰ(nigakilactone Ⅰ)，示于圖3?？嗄緝?nèi)酯Ⅰ的質(zhì)譜信息及其母離子(m/z375.183 1)、碎片離子(m/z315.086 0、289.070 2、191.073 0)的歸屬示于圖4。因此，可將苦木內(nèi)酯Ⅰ作為可可殼粉的特征標(biāo)志物用來鑒定可可粉中可可殼粉的摻入。

注：紅框表示VIP≥3的化合物

圖4 苦木內(nèi)酯Ⅰ的質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrum of nigakilactone Ⅰ

2.3.2定量檢測(cè)模型信息 按1.6節(jié)方法得到的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖5。結(jié)果可知，在可可殼粉摻入量為1%～50%范圍內(nèi)，苦木內(nèi)酯Ⅰ峰面積與可可殼粉摻入量之間的線性關(guān)系良好，線性方程為y=187.82x+646.96，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.999 9，檢出限(LOD,S/N≥3)為0.3%，定量限(LOQ,S/N≥10)為1%。

圖5 苦木內(nèi)酯Ⅰ峰面積和可可殼粉摻入量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve between the peak area of nigakilactone Ⅰ and the content of cocoa shell powder

2.3.3盲樣驗(yàn)證以及市售樣品檢測(cè) 為驗(yàn)證方法的可靠性與適用性，對(duì)模擬制備的3份盲樣和4份市售可可粉樣品進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果列于表4。其中，7份樣品檢測(cè)含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.89%～2.28%范圍內(nèi)，表明本方法精密度良好；3份盲樣檢測(cè)出的可可殼粉含量與實(shí)際摻入量基本一致，相對(duì)誤差在3.89%～7.81%范圍內(nèi)，表明本方法準(zhǔn)確度較好；4份市售可可粉樣品中可可殼粉的檢測(cè)含量分別為9.03%、2.51%、3.33%、2.79%。參考CXS 141-1983規(guī)定，推測(cè)市售可可粉樣品1中可能人為摻入了可可殼，其他3份市售樣品中檢測(cè)到的可可殼可能來自加工過程中的污染。由此，所建立的方法可用于市售可可粉中摻入可可殼的定量檢測(cè)。

表4 盲樣和市售可可粉樣品中可可殼粉摻入量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Results of the contents of cocoa shell power in blind samples and commercial samples

3 結(jié)論

為實(shí)現(xiàn)可可粉中可可殼的定性定量檢測(cè)，本研究采用UPLC-QTOF MS/MS技術(shù)，以厄瓜多爾產(chǎn)地可可豆為研究對(duì)象，通過分析可可粉與可可殼粉中的組分差異，結(jié)合PCA和OPLS-DA模型，在無監(jiān)督和有監(jiān)督2種模式下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)純可可粉和可可殼粉的判別區(qū)分。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)苦木內(nèi)酯Ⅰ是可可殼粉的特征標(biāo)志物?？嗄緝?nèi)酯Ⅰ屬于苦木內(nèi)酯類化合物，苦木內(nèi)酯類化合物結(jié)構(gòu)相似，為苦木科鴉膽子屬植物中主體特征生物活性成分，具有殺蟲止痢、抗瘧、抗腫瘤、抗炎以及降血糖等多種功效[25]。

使用MS/MS模式檢測(cè)摻有一定量可可殼粉的可可粉模擬樣品，當(dāng)沿用MSE模式中使用的液相色譜方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰與其他雜峰未完全分離，且峰形有一定的拖尾現(xiàn)象。通過優(yōu)化MS/MS模式下的流動(dòng)相及其洗脫梯度，目標(biāo)峰與其他雜峰的分離度較好，且峰形對(duì)稱度良好，可用來定量檢測(cè)可可粉中可可殼粉的摻入量。本方法的檢出限為0.3%，定量限為1%，與HPLC等方法鑒別摻入可可殼的可可粉研究結(jié)果[2,9]對(duì)比，本方法的定量限更低，結(jié)果更準(zhǔn)確。

本方法前處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、靈敏度高，可為市售可可粉樣品的摻假鑒別提供技術(shù)手段。后續(xù)將會(huì)選擇更多產(chǎn)地(如西非和亞洲等)的可可豆作為樣品，以進(jìn)一步補(bǔ)充和完善研究?jī)?nèi)容。