劉若男，陳婉冰，楊 宏，胡亦清，魯 群，董 軍，劉 睿,4

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點實驗室，湖北 武漢 430070；2.武漢市蜂產(chǎn)品質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070；3.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與安全研究所，湖北 武漢 430070；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，湖北 武漢 430070)

黃烷-3-醇類膳食多酚包括兒茶素、表兒茶素、原花青素及其衍生物，富含此類化合物的膳食具有較好的抗氧化、抗炎作用[1-2]，對心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等慢性疾病具有預(yù)防或緩解作用[3]。研究表明[4]，黃烷-3-醇類化合物經(jīng)口攝入后，其在體內(nèi)血液中的濃度僅能達(dá)到nmol/L～μmol/L水平，不足攝入量的1%[4]，而大量母體化合物進(jìn)入結(jié)腸并被腸道微生物群降解，主要產(chǎn)生小分子酚酸，然后再被吸收至循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)各組織或器官[5]。關(guān)于黃烷-3-醇類化合物在體內(nèi)經(jīng)腸道微生物代謝后對健康的影響機(jī)制仍未得到完整解析。目前，一些研究者將黃烷-3-醇類化合物對人類慢性疾病的影響和可能的干預(yù)機(jī)制歸因于它們的腸道微生物代謝產(chǎn)物[6]。羥基苯甲酸、苯丙酸、苯乙酸、馬尿酸、阿魏酸及其葡醛酸苷和硫酸酯綴合物均被證明比母體化合物具有更強(qiáng)的生物活性[7-8]?？梢姡S烷-3-醇類化合物發(fā)揮有益作用的能力與其腸道微生物的代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。盡管對黃烷-3-醇類化合物的腸道微生物代謝產(chǎn)物的定性鑒定取得了一定的進(jìn)展[5,9-10]，但其精準(zhǔn)定量仍需重點突破，該成果可以揭示黃烷-3-醇類化合物的生物利用度和體內(nèi)外生物活性。

攝入富含黃烷-3-醇類化合物的膳食后，體內(nèi)主要出現(xiàn)黃烷-3-醇母體化合物及其Ⅱ-相衍生物、5-碳開環(huán)代謝產(chǎn)物(主要為苯基戊內(nèi)酯類和苯基戊酸類及其Ⅱ-相衍生物)、小分子酚酸以及Ⅱ-相衍生物等3類代謝產(chǎn)物，其中，后2類代謝物含量在血漿、尿液和糞便中占主導(dǎo)。研究表明[11]，這些代謝產(chǎn)物主要以葡萄糖醛酸化和硫酸酯化Ⅱ-相代謝產(chǎn)物的形式存在。Ⅱ-相代謝產(chǎn)物同樣也是其他多酚類化合物的特征代謝產(chǎn)物，但由于其標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得，常采用酶解打破葡萄糖醛酸鍵或硫酸酯鍵定性或定量多酚代謝產(chǎn)物前體。Kahle等[12]對血清和尿液樣本酶解后，實現(xiàn)了對5-咖啡基奎寧酸、4-對香豆基奎寧酸、咖啡酸、(-)表兒茶素、根皮素、槲皮素及馬尿酸等代謝產(chǎn)物的定量分析。

目前，常使用三重四極桿(QQQ)、飛行時間(TOF)、四極飛行時間(Q-TOF)、線性離子阱(LTQ)、靜電場軌道離子阱(Orbitrip)等方法對復(fù)雜生物樣品進(jìn)行精確靶向定量。其中，QQQ掃描速度快、干擾小，具有較寬的線性范圍，廣泛用于定量分析，但是需要依賴目標(biāo)待測物的標(biāo)準(zhǔn)品建立分析方法[13-14]；TOF、LTQ和Orbitrip均為高分辨和高靈敏度的質(zhì)譜儀，皆可提供精準(zhǔn)質(zhì)量數(shù)、多級碎片離子質(zhì)量和準(zhǔn)確的離子色譜，但掃描速度慢、線性范圍窄，在定量方面的應(yīng)用較少，但隨著質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件的開發(fā)以及新定量模式的需求，也逐漸應(yīng)用于靶向定量分析[15-18]。

本研究擬使用葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶打破Ⅱ-相代謝產(chǎn)物的酯鍵，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品開發(fā)定量方法，采用超高效液相色譜-三重四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-QQQ-MS)法靶向定量分析黃烷-3-醇類化合物及其主要代謝產(chǎn)物，同時測定其在血漿、糞便、尿液等不同生物基質(zhì)中的含量，并從靈敏度、精確度、穩(wěn)定性等方面進(jìn)行方法學(xué)驗證。希望為黃烷-3-醇類化合物的靶向定量研究提供方法，為選擇與健康相關(guān)的有效生物標(biāo)志物提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Acquity UPLC H-Class PLUS超高效液相色譜系統(tǒng)：美國Waters公司產(chǎn)品，由 Acquity UPLC QSM四元溶劑管理系統(tǒng)、Acquity UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)、Acquity UPLCPDA檢測系統(tǒng)組成；Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源及Masslynx數(shù)據(jù)處理軟件；Gradient A10 Milli-Q超純水器：法國Milli-pore公司產(chǎn)品；Vortex-2500M多管渦旋混合器：中國力辰科技公司產(chǎn)品；LHS-100CH恒溫培養(yǎng)箱：中國上海一恒公司產(chǎn)品；YTLG-12A冷凍干燥機(jī)：中國上海葉拓公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

5-(3-羥基苯基)-戊內(nèi)酯(純度98.78%)、 4-羥基-5-(3-羥基苯基)-戊酸(純度98.13%)：由藥明康德新藥開發(fā)有限公司合成；高香草酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國蘇州愛瑪特生物科技有限公司產(chǎn)品；原花青素A1(純度95.23%)、原花青素A型三聚體(純度97.34%)：從花生紅衣原花青素中分離得到；其余標(biāo)準(zhǔn)品均為上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。硫酸酯酶(酶活力值為10 kU)、葡萄糖醛酸酶(酶活力值為100 kU)：來源于羅曼蝸牛，美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈、甲醇：均為色譜級，美國Fisher公司產(chǎn)品；甲酸(色譜級)：德國 Merck公司產(chǎn)品；血漿、尿液、糞便：取自C57BL/6健康小鼠，購自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm×1.9 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸，B相為含0.1%甲酸的乙腈；柱溫40 ℃；洗脫梯度：0～2 min(95%A)，2～10 min(95%～60%A)，10～12.5 min(60%～5%A)，12.5～15 min(5%～95%A)。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，毛細(xì)管電壓3 kV，脫溶溫度500 ℃，脫溶氣(N2)流速750 L/h。使用0.1、0.5、5、50 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液從低濃度到高濃度進(jìn)行質(zhì)譜調(diào)諧分析，直至獲得化合物響應(yīng)值最高的子離子信息；然后選擇該離子進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化，通過手動調(diào)諧的方式優(yōu)化各分析物的MS/MS參數(shù)(錐孔電壓和碰撞能量)，使子離子的響應(yīng)值達(dá)到最高。采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，選擇最敏感的躍遷(母離子和子離子)進(jìn)行定量。使用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.4.1調(diào)諧標(biāo)準(zhǔn)品的配制 分別精密稱取適量的各標(biāo)準(zhǔn)品，加入70%甲醇溶解，配制2 000、200、50、0.5、0.1 mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于調(diào)諧分析。

1.4.2混合標(biāo)準(zhǔn)品的配制 根據(jù)調(diào)諧過程中化合物定量子離子響應(yīng)值的差異，將33種標(biāo)準(zhǔn)品分成4組，質(zhì)譜響應(yīng)較低時，需要該化合物在混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液中以較高的濃度存在，以保證同一條件下每種化合物都能得到較均衡的響應(yīng)值。4組混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的最高濃度分別為25、50、100、200 mg/L，取4組等體積標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液S1，依次稀釋得到S2～S9，稀釋梯度列于表1。根據(jù)化合物對應(yīng)的濃度范圍和響應(yīng)的峰面積，使每種化合物都得到1個MRM函數(shù)。

表1 各組混合標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和稀釋梯度Table 1 Concentration and dilution gradient of each group of mixed standards

1.5 樣品處理方法

1.5.1尿液樣品 使用代謝籠收集小鼠24 h內(nèi)的尿液樣本，并定容至8 mL，所有尿液樣本過0.22 μm濾膜，凍存于-80 ℃。分析前取出，對尿液樣本解凍、渦旋，然后取0.5 mL尿液樣本，加入0.25 mL混合酶(含1 000 U 葡萄醛酸酶和100 U 硫酸酯酶)，在37 ℃水解3 h，再加入20 μL 6 mol/L鹽酸中止反應(yīng)，以12 000r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，用于代謝產(chǎn)物含量的測定[19-20]。

1.5.2糞便樣品 稱取100 mg糞便，加入200 mg玻璃微珠和1 mL 50%甲醇進(jìn)行渦旋，混合均勻后，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，分析測定前過0.22 μm濾膜。

1.5.3血漿樣品 采血于肝素鈉抗凝管，以10 000 r/min離心10 min，取上清液，密封，凍存于-80 ℃。樣品前處理時，將其取出放于冰上30～60 min，待樣品完全溶解后，取100 μL血漿，加入100 μL混合酶，在37 ℃水解3 h，水解結(jié)束后，加入500 μL含2%甲酸的乙腈溶液，超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，用于沉淀蛋白；取上清液，真空冷凍干燥后保存。測定時取出樣品，加入100 μL含0.1%甲酸的甲醇溶液復(fù)溶，渦旋，然后以12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用于UPLC-MS/MS檢測[21-22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 處理條件的優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[19-22]報道，優(yōu)化了3種不同生物基質(zhì)的處理方法，以加標(biāo)回收率作為優(yōu)化指標(biāo)，優(yōu)化方案示于圖1，優(yōu)化效果示于圖2。使用方案一處理尿液樣本時，黃烷-3-醇類化合物均出現(xiàn)了未檢出的結(jié)果，包括兒茶素、表兒茶素、原花青素B1、原花青素A1、三聚體，這可能是因為pH值較高，黃烷-3-醇類化合物在偏酸性的條件下更穩(wěn)定，經(jīng)過調(diào)整pH值后，這一現(xiàn)象得到改善，且回收率范圍更合理。在糞便樣本處理過程中也同樣存在pH值較高的現(xiàn)象，將0.1%乙酸調(diào)整為2%甲酸后，可以提高大多數(shù)化合物的回收率。擬定的血漿樣本處理方案的回收率能夠達(dá)到方法學(xué)驗證標(biāo)準(zhǔn)，未進(jìn)行優(yōu)化。

圖1 優(yōu)化不同基質(zhì)的處理方案Fig.1 Processing schemes of optimized different matrixes

注：a.尿液樣本；b.糞便樣本

2.2 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

黃烷-3-醇類化合物的代謝產(chǎn)物主要為小分子酚酸類。本實驗在電噴霧負(fù)離子模式下對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，每種化合物的母離子Q1[M-H]-出現(xiàn)后，對Q1進(jìn)行碰撞解離，通過子離子掃描，得到目標(biāo)化合物的特征碎片離子。在此基礎(chǔ)上，對去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子對的信號達(dá)到最強(qiáng)。根據(jù)化合物的特征離子對、目標(biāo)子離子的出峰時間，以及對應(yīng)的去簇電壓和碰撞能量等，建立MRM定量方法的基本信息。33種化合物優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)列于表2。

表2 33種代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters of 33 metabolites

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1線性分析 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，最小二乘法進(jìn)行回歸計算，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程和線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果列于表3?？梢?，33種化合物在線性范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

表3 33種代謝產(chǎn)物的回歸方程、線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Regression equation, linearity, LOD and LOQ of 33 metabolites

2.3.2靈敏度 利用一系列已知低濃度混標(biāo)與空白樣品的測量信號進(jìn)行比較，確定各化合物的檢出限(LOD)為3倍信噪比對應(yīng)的濃度，定量限(LOQ)為8倍信噪比對應(yīng)的濃度，結(jié)果列于表3?？梢?，檢出限的最小值為0.006 3 mg/L，對應(yīng)的化合物有表兒茶素、原花青素B1、原花青素A1、原花青素三聚體、對香豆酸，這些化合物幾乎沒有噪音干擾；檢出限的最大值為2.5 mg/L，對應(yīng)的化合物僅有3,4-二羥基苯乙酸，該化合物的特征子離子響應(yīng)相對較差；33種化合物的定量限在0.015 6～10 mg/L之間，最大值對應(yīng)的化合物仍是3,4-二羥基苯乙酸。

2.3.3回收率 樣品在處理過程中會存在一定的損失，因此，定量分析中回收率的評估尤為重要?；厥章试u估流程如下：將標(biāo)準(zhǔn)品加入原始空白生物基質(zhì)樣本中，按照1.5節(jié)方法處理樣品，同時在經(jīng)過前處理的各基質(zhì)樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品，分析空白樣本中各化合物的含量(以峰面積表示)，按照以下公式評估回收率。

回收率=(樣本提取前的峰面積-空白樣品的峰面積)/(樣本提取后的峰面積-空白樣品的峰面積)×100%。33種化合物在血漿、尿液、糞便中的回收率列于表4。結(jié)果表明，不同基質(zhì)的回收率大多在70%～120%之間，其中，糞便樣品的加標(biāo)回收率最好，血漿樣品次之。Quifer等[24]研究表明，酶解處理和孵育過程對樣品中游離態(tài)的多酚和酚酸在回收率方面有負(fù)面影響，酶水解可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因。

2.3.4基質(zhì)效應(yīng) 將尿液、血漿或糞便等生物樣本提取后，加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液分析并制作校準(zhǔn)曲線，并用甲醇制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，通過比較以上結(jié)果來評價基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果以100%為基準(zhǔn)進(jìn)行比較，基質(zhì)效應(yīng)為正，即為增強(qiáng)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)為負(fù)，則為減弱效應(yīng)[23]。33種化合物在血漿、尿液、糞便中的基質(zhì)效應(yīng)列于表4?？梢姡衔镌诩S便和尿液樣品中的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為輕微的離子抑制作用，而在血漿樣品中則表現(xiàn)為離子增強(qiáng)作用。雖然有些化合物的基質(zhì)效應(yīng)較高，但大多數(shù)化合物的基質(zhì)效應(yīng)介于±20%之間可被接受。

表4 33種化合物在糞便、尿液、血漿中的回收率及基質(zhì)效應(yīng)Table 4 Recovery and matrix effect of 33 compounds in feces, urine and plasma

續(xù)表4

2.3.5日內(nèi)和日間精密度 對混合標(biāo)準(zhǔn)品、血漿、尿液和糞便4種樣本進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度評估，混標(biāo)選擇S6(A組0.5 mg/L、B組1 mg/L、C組2 mg/L、D組4 mg/L)進(jìn)行評估；血漿、尿液、糞便按1.5節(jié)條件進(jìn)行前處理后，用生物樣本提取液配制與混合標(biāo)準(zhǔn)品S6等濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行評估。33種化合物的日內(nèi)和日間精密度示于圖3?？梢姡瑯?biāo)準(zhǔn)品以及不同基質(zhì)的日內(nèi)、日間精密度均小于15%，表明方法的精密度和穩(wěn)定性良好。

圖3 日內(nèi)和日間精密度Fig.3 Inter-day and intra-day precisions

3 結(jié)論

本研究使用超高效液相色譜-三重四極桿-串聯(lián)質(zhì)譜測定血漿、尿液和糞便中黃烷-3-醇類化合物的主要腸道微生物代謝產(chǎn)物，依據(jù)化合物子離子響應(yīng)值差異，確定了33種化合物在混合標(biāo)準(zhǔn)品中的濃度，使所有化合物在同一條件下得到適宜的響應(yīng)；同時，在15 min分析時間內(nèi)，使混合標(biāo)準(zhǔn)品中33種化合物達(dá)到較好的分離。經(jīng)方法學(xué)驗證，33種化合物具有較好的線性關(guān)系，以尿液、糞便和血漿為研究材料，日內(nèi)、日間精密度RSD值均在15%以下，基質(zhì)效應(yīng)介于±20%之間，回收率在70%～120%之間。該方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、抗基質(zhì)干擾能力較強(qiáng)，可以為黃烷-3-醇類化合物靶向定量的深入研究提供參考。