賈賀園，姚 波，陳世稆，路時芳，曹 潔

(北京理工大學化學與化工學院，原子分子簇科學教育部重點實驗室，光電轉(zhuǎn)換材料北京市重點實驗室，北京 100081)

生物大分子選擇性C—C鍵活化是化學領(lǐng)域乃至生命科學領(lǐng)域的前沿課題，具有重要意義。由于化合物中活性相似的C—C鍵普遍存在，選擇性活化其中的1個C—C鍵是一大難點。李綱等[1]報道了首例羧基導(dǎo)向的遠程C(sp2)—H鍵的選擇性活化。關(guān)于質(zhì)譜法對自由基介導(dǎo)的選擇性C—C鍵斷裂尚未見報道。

多肽自由基離子(M·+)是一種奇電子離子，存在2個反應(yīng)中心(即自由基和電荷中心)，反應(yīng)活性很高，因具有獨特的結(jié)構(gòu)及氣相反應(yīng)活性而受到廣泛關(guān)注。與質(zhì)子化多肽離子([M+H]+)相比，多肽自由基離子可同時發(fā)生自由基和電荷誘導(dǎo)的反應(yīng)，具有多種氣相解離反應(yīng)途徑。比如：它既可以發(fā)生自由基誘導(dǎo)的斷裂蛋白/多肽骨架上的N—Cα鍵、酰胺鍵和Cα—C鍵，形成a/x、b/y和c/z系列離子，又可以斷裂側(cè)鏈上Cα—Cβ和Cβ—Cγ鍵，生成丟失完整(或部分)側(cè)鏈的碎片離子[2]。氨基酸殘基的質(zhì)子親和勢和自由基的位置決定了碎片離子的類型與豐度。相比之下，質(zhì)子化多肽的氣相解離路徑比較單一，主要發(fā)生電荷驅(qū)動的酰胺鍵斷裂反應(yīng)而產(chǎn)生b/y系列離子[3]。因此，多肽自由基離子可產(chǎn)生多種包含氨基酸序列信息的碎片離子，是目前蛋白測序方法的重要補充。同時，在亮氨酸和異亮氨酸等異構(gòu)體區(qū)分上[4]，多肽自由基離子顯示了特有的優(yōu)勢。

產(chǎn)生多肽自由基離子最經(jīng)典的方法是通過金屬-配體(L)-多肽(M)三元復(fù)合物[CuⅡ(L)(M)]2+的碰撞誘導(dǎo)解離反應(yīng)(collision induced dissociation, CID)獲得。Chu等[5-6]在CID時最先發(fā)現(xiàn)三元復(fù)合物[CuⅡ(L)(M)]2+發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)得到多肽自由基離子M·+。對[CuⅡ(L)(M)]2+的后續(xù)研究主要是通過改變金屬中心、設(shè)計配體和多肽的結(jié)構(gòu)來探索多肽自由基離子形成的影響因素。如Siu和Chu討論了配體結(jié)構(gòu)對[CuⅡ(L)(GGX)]2+形成自由基離子的影響[7-8]；O’Hair等[9]提出三價過渡金屬離子的三元復(fù)合物[MnⅢ(salen)(M)]+也可以得到自由基離子[9]。此外，修飾自由基引發(fā)劑的多肽衍生物的CID也是產(chǎn)生多肽自由基離子的重要方法。常用的自由基引發(fā)劑包括過氧化物[10-11]、偶氮自由基引發(fā)劑[12]、TEMPO衍生物[13]和硝酸酯前驅(qū)體[14]等。多肽與自由基引發(fā)劑在溶液中偶聯(lián)后，在CID時自由基引發(fā)劑內(nèi)部的弱化學鍵容易發(fā)生均裂，引入自由基形成自由基離子。引入的自由基最初位于特定原子上，如氨基N原子、偶氮相鄰C原子，進一步CID時自由基發(fā)生遷移，誘導(dǎo)多肽中不同鍵的斷裂，產(chǎn)生含有結(jié)構(gòu)信息的產(chǎn)物離子。從[CuⅡ(L)(M)]2+中制備自由基離子的方法與多肽和配體結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。當多肽中含有芳香族氨基酸或堿性氨基酸、配體有大體積或強吸電子能力的取代基時，有利于生成自由基離子[15-16]。相比之下，自由基引發(fā)劑法對多肽的結(jié)構(gòu)要求并不高，此方法的關(guān)鍵在于自由基引發(fā)劑與多肽中的靶向基團耦合。前人通常采用簡單的多肽模型研究自由基離子及其前體離子的氣相反應(yīng)[17-19]，而尚未見以非天然氨基酸組成的多肽為研究對象的報道。

本文擬采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)法，首先研究一系列自合成多肽衍生物質(zhì)子化肽的氣相解離反應(yīng)，明確該多肽衍生物的結(jié)構(gòu)特點。與此同時，嘗試采用三元復(fù)合物法([CuⅡ(L)(M)]2+)和TEMPO自由基引發(fā)劑法制備氣相自由基離子。最后，通過TEMPO自由基引發(fā)劑法將鄰甲基苯甲酰(Bz)自由基引入多肽衍生物分子中，并將該離子應(yīng)用于多肽衍生物酯基鄰近C—C鍵斷裂及異構(gòu)體識別研究。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Agilent 6520 Q-TOF質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(ESI)及Qualitative Analysis B.04.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Bruker Amazon Speed Dual Funnel離子阱質(zhì)譜儀：德國Bruker公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源及Data Analysis 5.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 材料與試劑

高氯酸銅、二亞乙基三胺(dien)、L-組氨酸：均為上海阿拉丁生化科技有限公司產(chǎn)品；2,2′∶6′,2″-三聯(lián)吡啶(terpy)、無水氯化銅、甲醇：均為上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。本文涉及的多肽衍生物：由北京理工大學化學與化工學院姚波教授課題組提供，合成路線詳見文獻[20]。自由基引發(fā)劑o-TEMPO-Bz-NHS(鄰-[(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基)甲基]苯甲酸-N-羥基丁二酰亞胺酯)的合成及其與多肽衍生物的偶聯(lián)反應(yīng)參照文獻[13]。

1.3 樣品制備

Cu(L)(ClO4)2(L=terpy，dien)的合成及[Cu(L)M](ClO4)2溶液的配制：1) Cu(L)(ClO4)2的合成參照文獻[21]，用Cu(ClO4)2代替Cu(NO2)2，將Cu(ClO4)2用水溶解后，與配體溶液以摩爾比1.5∶1混合(terpy用乙醇溶解，dien用原溶液即可)，反應(yīng)后用冷的CH3CH2OH∶H2O(1∶1)重結(jié)晶2次，得到純的Cu(L)(ClO4)2；2) 將多肽衍生物的甲醇-水溶液(1 g/L)和Cu(L)(ClO4)2的甲醇溶液(1 g/L)按摩爾比4∶1混合后，用注射泵以300 μL/h注入ESI離子源中，即可在一級譜圖中得到[Cu(L)M]2+。

[Cu(His)M]Cl2溶液的配制：將多肽衍生物的甲醇-水溶液(1 g/L)、無水氯化銅的水溶液(1 g/L)和組氨酸的水溶液(1 g/L)按摩爾比2∶1∶2混合后，用注射泵以300 μL/h注入ESI離子源中，即可在一級譜圖中得到[Cu(His)M]2+。

1.4 質(zhì)譜條件

[M+H]+和[CuⅡ(L)(M)]2+的質(zhì)譜實驗在Agilent Q-TOF質(zhì)譜儀上完成；TEMPO-Bz-M的質(zhì)譜實驗和其他多級質(zhì)譜實驗均在Bruker離子阱質(zhì)譜儀上完成。

Agilent Q-TOF質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；干燥氣N2；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力206 kPa；毛細管電壓3 500 V；碎裂電壓85 V；錐孔電壓60 V；隔離寬度m/z1.3；質(zhì)量掃描范圍m/z50～3 000。

Bruker離子阱質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；正離子模式；毛細管電壓4 500 V；端蓋補償電壓500 V；霧化氣壓力50 kPa；干燥氣N2；干燥氣溫度180 ℃；干燥氣流速4 L/min；隔離寬度m/z1；自動增益時間10 ms；碰撞氣He；質(zhì)量掃描范圍m/z50～3 000。

1.5 計算方法

本文所有計算應(yīng)用Gaussian 09程序，采用密度泛函理論(DFT)方法，使用6-31+g(d,p)基組進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，所有結(jié)構(gòu)都進行了頻率校正。

2 結(jié)果與討論

2.1 自合成多肽衍生物的結(jié)構(gòu)表征

本研究合成了6種由非天然氨基酸組成的多肽衍生物(A1～A6)，結(jié)構(gòu)式示于圖1，其中A3和A4是同分異構(gòu)體。采用ESI-MS/MS結(jié)合量化計算方法對其結(jié)構(gòu)進行表征，并探索區(qū)分同分異構(gòu)體的方法。6種二肽衍生物[M+H]+的CID質(zhì)譜圖示于圖2，二肽衍生物離子[M+H]+的解離均以電荷誘導(dǎo)的酰胺鍵斷裂反應(yīng)為主，生成a1+(m/z162.127 6)和[y1+2H]+(m/z118.093 1(M=A1)，m/z146.117 9(M=A2)，m/z160.120 8(M=A3)，m/z160.119 8(M=A4)，m/z194.117 9(M=A5))產(chǎn)物離子。A1～A5中只存在1個酰胺鍵，且主要結(jié)構(gòu)差異在于C-端氨基酸側(cè)鏈不同。A1～A5的氣相裂解反應(yīng)呈現(xiàn)較好的規(guī)律性，以質(zhì)子化三肽A6為例，其氣相反應(yīng)機理示于圖3。A6的第1個酰胺鍵斷裂時發(fā)生的親核反應(yīng)是由N-端氨基N原子參與[22]，示于圖3a。首先，質(zhì)子轉(zhuǎn)移到酰胺鍵的N原子上，被質(zhì)子化的N原子會增加酰胺鍵的鍵長，削弱酰胺鍵的鍵能；然后，氨基N原子對酰胺鍵中的羰基C原子進行親核進攻，同時酰胺鍵斷裂形成含有內(nèi)酰胺環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的質(zhì)子二聚體(proton-bound dimer Ⅰ)，其解離碎片取決于2個碎片質(zhì)子親和勢(proton affinity, PA)的相對大小。對于A1～A5，N-端碎片側(cè)鏈均是含有苯環(huán)的叔丁基結(jié)構(gòu)，其PA值大于C-端碎片，進而形成b1+。由于具有內(nèi)酰胺環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的b1+很不穩(wěn)定，容易失去CO得到a1+，所以[M+H]+形成的a1+豐度遠大于[y1+2H]+。A1～A5中，C-端氨基酸側(cè)鏈的取代基會直接影響[y1+2H]+的相對豐度，酰胺鍵斷裂形成的N-端和C-端碎片PA值的計算結(jié)果列于表1。A5的C-端氨基酸側(cè)鏈R1=CH2C6H5，其PA值最大，[y1+2H]+的相對豐度最高；相反，A1的R1=CH3，其PA值最小，[y1+2H]+的相對豐度最低。A6第2個酰胺鍵斷裂是由第1個酰胺鍵中的羰基O原子對第2個酰胺鍵的羰基C原子進行親核進攻，同時酰胺鍵斷裂形成含有惡唑酮環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)子二聚體(proton-bound dimer Ⅱ)，通過對質(zhì)子的競爭形成[y1+2H]+和b2+，示于圖3b。與反應(yīng)a不同的是，具有質(zhì)子化惡唑酮環(huán)結(jié)構(gòu)的b2+可以穩(wěn)定存在，也可以進一步丟失CO得到a2+。在三肽A6中，3個氨基酸側(cè)鏈都是C原子數(shù)為3或4的烷基鏈，對PA值的貢獻相近，酰胺鍵斷裂形成的競爭產(chǎn)物離子的相對豐度主要取決于碎片離子中所含氨基酸的個數(shù)，即二肽的PA值大于單體氨基酸的PA值。

圖1 多肽衍生物A1～A6的結(jié)構(gòu)、化學式和相對分子質(zhì)量Fig.1 Structures, formulas and relative molecular mass of the polypeptide derivatives A1-A6

圖2 [M+H]+的CID質(zhì)譜圖Fig.2 CID spectra of [M+H]+

注：a.第1個酰胺鍵斷裂；b.第2個酰胺鍵斷裂；c.C-端酯基鍵斷裂；圖中箭頭表示親核進攻方向

表1 [M+H]+ (M=A1～A5)酰胺鍵斷裂的N-端和C-端碎片的PA值Table 1 PA of N-terminal and C-terminal fragments by amide bond cleavage in [M+H]+ (M=A1-A5)

2.2 自由基介導(dǎo)的選擇性C—C鍵斷裂及異構(gòu)體區(qū)分

通過觀察異構(gòu)體A3和A4的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其主要差異來源于C-端氨基酸側(cè)鏈的不同，一個是i-C4H9，另一個是s-C4H9。由于電荷只參與多肽骨架上的酰胺鍵斷裂反應(yīng)，不涉及側(cè)鏈，所以本研究的設(shè)計思路是將自由基引入多肽離子結(jié)構(gòu)使其形成自由基離子。多肽自由基離子具有自由基和電荷2個反應(yīng)中心，與質(zhì)子化分子相比，其解離途徑更豐富。更重要的是，自由基可以誘導(dǎo)多肽丟失部分側(cè)鏈的反應(yīng)，為異構(gòu)體識別提供理論支持。

自由基離子的第一種制備方法是由金屬-配體-L-多肽組成的三元復(fù)合物[CuⅡ(L)(M)]2+通過多肽和金屬離子間的電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。Chu等[23-24]在研究中發(fā)現(xiàn)，多肽在三元復(fù)合物中大多以兩性結(jié)構(gòu)存在。通過三元復(fù)合物的氣相裂解反應(yīng)[CuⅡ(dien)(YGW)]2+→[CuⅠ(dien)]++YGW·+制備多肽自由基離子要經(jīng)歷電子轉(zhuǎn)移、從N-端到C-端的質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電荷分離3個反應(yīng)歷程。本課題組[25]對[CuⅡ(4Cl-tpy)(Ac-YGW-OMe)]2+體系的研究表明，三元復(fù)合物中三肽的非兩性結(jié)構(gòu)有利于三元復(fù)合物的電子轉(zhuǎn)移過程。對于化學修飾型多肽Ac-YGW-OMe來說，其只能以非兩性結(jié)構(gòu)存在于三元復(fù)合物中，多肽自由基離子的產(chǎn)率會顯著提高。將6個多肽衍生物與Cu2+和3種配體L=His，terpy和dien組成三元復(fù)合物[CuⅡ(L)(M)]2+，通過三元復(fù)合物的氣相解離反應(yīng)制備M·+，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，M·+沒有出現(xiàn)在質(zhì)譜圖中，表明M·+的穩(wěn)定性極差，主要是因為M·+缺乏共軛結(jié)構(gòu)。但在相應(yīng)的CID譜圖中觀察到另一個與M·+互補的電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)物離子[CuⅠ(L)]+(m/z217.997 6，相對豐度(RA) 18%(L=His)；m/z296.025 2，RA 100%(L=terpy)；m/z166.039 9，RA 20%(L=dien))，示于圖4(6個多肽衍生物的[CuⅡ(L)(M)]2+氣相裂解反應(yīng)相似，以A3、A4為例進行說明，A1、A2、A5、A6的[CuⅡ(L)(M)]2+質(zhì)譜圖示于附圖1、2、3，可登錄《質(zhì)譜學報》官網(wǎng)http:∥www.jcmss.com.cn下載)。與此同時，當L=His和dien時，還觀察到“配體”和金屬離子間的氧化還原反應(yīng)，對應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物為[CuⅠ(M)]+(m/z411，RA 100%(L=His)，RA 18%(L=dien))。根據(jù)[CuⅠ(L)]+/[CuⅠ(M)]+的比值可大致判斷L與Cu2+的絡(luò)合能力順序為：terpy>dien>His。需要說明的是，His作為弱配體存在于三元復(fù)合物中，其存在形式可以通過量化計算得到。以A3為例，由量化計算得到的3種不同配體形成的三元復(fù)合物[CuⅡ(His)(A3)]2+、[CuⅡ(terpy)(A3)]2+和[CuⅡ(dien)(A3)]2+的最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)示于圖5。在[CuⅡ(His)(A3)]2+中，His以兩性結(jié)構(gòu)存在于復(fù)合物中，CuⅡ在正方形平面上形成4個強的金屬-配體配位鍵：CuⅡ與His的氨基N原子、羧基O原子分別形成2個強配位鍵(鍵長分別為1.909 ?和1.994 ?)，與A3的氨基N原子、第2個羰基O原子形成2個配位鍵。這一結(jié)論與Siu等[19]對[CuⅡ(L)n(His)]2+的研究結(jié)果相符，即在[CuⅡ(丙酮)2(His)]2+中His是以兩性結(jié)構(gòu)形式存在，原因是丙酮這類“弱配體”會使其中的氨基酸以兩性結(jié)構(gòu)存在于復(fù)合物中[19]。當L=含氮配體terpy和dien時，CuⅡ與L形成3個強配位鍵，與A3形成一強一弱2個配位鍵，其中4個強配位鍵在一個平面內(nèi)，另一個弱配位鍵位于該平面的軸向位置。遺憾的是，在圖4所示的CID譜圖中未直接觀察到His·+、dien·+和M·+，表明它們在氣相中均不穩(wěn)定。但檢測到了2個次級碎片離子[His-CO2]·+(m/z111.076 5，RA 16%)和[His-CO2-NH=CH2]·+(m/z82.053 1，RA 84%)，間接表明了His·+離子的存在，這些特征碎片離子表明，由復(fù)合物離子[CuⅡ(His)(M)]2+氧化還原反應(yīng)直接得到的、呈兩性結(jié)構(gòu)的His·+相當不穩(wěn)定，它可以連續(xù)丟失CO2和甲亞胺分別得到[His-CO2]·+和[His-CO2-NH=CH2]·+碎片離子。由此看來，在三元復(fù)合物[CuⅡ(His)(M)]2+中，“配體”與“多肽”的界限并不明確，M也可作為CuⅡ的“配體”。由圖4還可以看出，[CuⅡ(L)(M)]2+的CID譜圖均出現(xiàn)較強的a1+碎片離子(m/z162，RA 38%(L=His)，RA 55%(L=terpy)，RA 84%(L=dien))，這種現(xiàn)象以M=三肽衍生物(A6)、L=dien時最為突出。A6的CID譜圖示于附圖4，生成了a1+(m/z86.097 5，RA 12%)、a2+(m/z199.182 5，RA 42%)、b2+(m/z227.177 9，RA 100%)和[y1+2H]+(m/z146.119 0，RA 48%)碎片離子，根據(jù)質(zhì)子化多肽的氣相裂解反應(yīng)，判斷它們都是由[M+H]+產(chǎn)生的次級碎片離子，質(zhì)子的來源是His和dien配體。此外，L=terpy時，[CuⅡ(terpy)(M)]2+的氣相解離反應(yīng)還出現(xiàn)1個丟失M完整側(cè)鏈的離子峰，如[CuⅠ(M-H-133)]·+(m/z235.014 8(M=A1)，m/z263.044 1(M=A2)，m/z277.061 3(M=A3)，m/z277.061 0(M=A4)，m/z311.044 5(M=A5))，[CuⅠ(M-H-57)]·+(m/z376.128 9(M=A6))，其產(chǎn)生機理示于附圖4，這些離子系前驅(qū)體[CuⅡ(M-H)]+的次級碎片，其互補離子是[terpy+H]+(m/z234.103 3)，表明質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)也是[CuⅡ(terpy)(M)]2+主要的氣相裂解反應(yīng)類型。

圖4 [CuⅡ(His)(A3)]2+(a), [CuⅡ(terpy)(A3)]2+(b), [CuⅡ(dien)(A3)]2+(c)和[CuⅡ(His)(A4)]2+(d), [CuⅡ(terpy)(A4)]2+(e), [CuⅡ(dien)(A4)]2+(f)的CID質(zhì)譜圖Fig.4 CID spectra of [CuⅡ(His)(A3)]2+ (a), [CuⅡ(terpy)(A3)]2+ (b),[CuⅡ(dien)(A3)]2+ (c), and [CuⅡ(His)(A4)]2+ (d), [CuⅡ(terpy)(A4)]2+ (e), [CuⅡ(dien)(A4)]2+ (f)

圖5 [CuⅡ(His)(A3)]2+, [CuⅡ(terpy)(A3)]2+, [CuⅡ(dien)(A3)]2+的氣相最穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(鍵長單位為?)Fig.5 Optimized gas-phase lowest-energy structures of [CuⅡ(His)(A3)]2+, [CuⅡ(terpy)(A3)]2+, [CuⅡ(dien)(A3)]2+

自由基離子的第二種制備方法是自由基引發(fā)劑法。Oh課題組將自由基引發(fā)劑o-TEMPO-Bz-NHS與多肽的氨基偶聯(lián)，通過斷裂TEMPO與鄰甲基苯甲酸之間的C—O鍵，將鄰甲基苯甲酰自由基(Bz·)引入多肽骨架，生成的自由基離子在氣相中發(fā)生自由基遷移，從而誘導(dǎo)多肽主鏈和側(cè)鏈鍵的斷裂[13,26]。對于含有分子內(nèi)二硫鍵的多肽，該方法可以實現(xiàn)C—S鍵和S—S鍵的優(yōu)先斷裂[27]。本研究采取同樣策略將非天然氨基酸二肽衍生物與o-TEMPO-Bz-NHS耦合，以制備相應(yīng)自由基離子。為便于區(qū)分A3和A4異構(gòu)體，合成了其結(jié)構(gòu)類似物B1和B2，以縮短側(cè)鏈與自由基初始中心的距離，使自由基更容易誘導(dǎo)側(cè)鏈丟失反應(yīng)，達到區(qū)分異構(gòu)體的目的。將o-TEMPO-Bz-NHS和異構(gòu)體(B1和B2，以下統(tǒng)稱M)通過一步法制備TEMPO-Bz-M，其結(jié)構(gòu)式示于圖6，[TEMPO-Bz-M+H]+、[Bz-M+H]·+以及[M+H]+的CID譜圖示于圖7。由圖7a、7d可知，[TEMPO-Bz-M+H]+可產(chǎn)生較強的碎片離子峰[Bz-M+H]·+(m/z390，RA 100%(M=B1)，RA 72%(M=B2))和[M+H]+(m/z273，RA 58%(M=B1)，RA 100%(M=B2))。[Bz-M+H]·+是斷裂[TEMPO-Bz-M+H]+中TEMPO與鄰甲基苯甲酸之間的C—O鍵，失去TEMPO自由基而形成的。TEMPO自由基的穩(wěn)定性降低了該自由基離子的反應(yīng)能壘。[Bz-M+H]·+屬于自由基離子，B1和B2顯示出相似度較高、但碎片離子[Bz·-a1]+豐度明顯不同的CID譜圖(m/z203，RA 40%(M=B1)，RA 60%(M=B2))，示于圖7b、7e。

注：圖中虛線內(nèi)為TEMPO-Bz基團

圖7 [TEMPO-Bz-B1+H]+(a)、[Bz-B1+H]·+(b)、[B1+H]+(c)和[TEMPO-Bz-B2+H]+(d)、[Bz-B2+H]·+(e)、[B2+H]+(f)的CID譜圖Fig.7 CID spectra of [TEMPO-Bz-B1+H]+ (a), [Bz-B1+H]·+ (b) ,[B1+H]+ (c) and [TEMPO-Bz-B2+H]+ (d), [Bz-B2+H]·+ (e), [B2+H]+ (f)

注：a.C-端酯基鍵斷裂；b.第2個酰胺鍵斷裂；c.第1個N-Cα鍵斷裂；圖中全箭頭表示親核進攻方向，半箭頭表示單電子轉(zhuǎn)移

3 結(jié)論

本研究使用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對一系列自合成多肽衍生物(A1～A6)進行結(jié)構(gòu)表征，使用TEMPO自由基引發(fā)劑法將鄰甲基苯甲酰自由基引入多肽分子，在氣相中成功制備出[Bz-M+H]·+自由基離子。通過串聯(lián)質(zhì)譜實驗發(fā)現(xiàn)，該離子相對于質(zhì)子化多肽分子([M+H]+)顯示出更高的反應(yīng)活性，具有更豐富的氣相解離反應(yīng)路徑，分別生成[Bz·-a1]+(m/z202.97)、[Bz·-b1]+(m/z231.03)、[Bz·-c1+H]+(m/z133.95)和[(Bz-M(H)-HCOOEt]·+(m/z316.18，RA 100%)等碎片離子；相比之下，[M+H]+的氣相解離途徑比較單一，只產(chǎn)生以斷裂酰胺鍵為主的碎片離子[y1+2H]+(m/z160.134 0，RA 100%)、a1+(m/z86.097 2，RA 74%)和[(M+H)-HCOOEt]+(m/z199.181 5，RA 52%)。其中，[(M+H)-HCOOEt]+的產(chǎn)生機理是由失去EtOH和CO兩步反應(yīng)完成。更重要的是，[Bz-M+H]·+自由基離子產(chǎn)生的[Bz·-a1]+和[(Bz-M(H)-HCOOEt]·+產(chǎn)物離子可成為異構(gòu)體區(qū)分和選擇性C—C鍵斷裂的靈敏探針，為質(zhì)譜區(qū)分多肽異構(gòu)體和選擇性C—C鍵斷裂提供了方法參考。

致謝感謝布魯克(北京)科技有限公司的儀器支持；感謝姚波教授合成多肽衍生物和TEMPO-Bz-多肽衍生物，以及富有啟發(fā)和幫助的討論；感謝陳世稆教授對量化計算給予的幫助和支持。