李 樂，趙君博，嚴 慧，鄧虹霄，范先煜，劉萬卉，向 平

(1.煙臺大學藥學院，山東 煙臺 264005；2.司法鑒定科學研究院，上海市法醫(yī)學重點實驗室，上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063)

圖1 二氯西泮(a)和4′-氯地西泮(b)的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of diclazepam (a) and 4′-chlorodiazepam (b)

肝微粒體體外溫孵法可以較好地模擬人體內(nèi)的代謝過程，肝臟血流量豐富而且含有大部分代謝酶，其中細胞色素P450(CytochromeP450, CYP450)酶是藥物Ⅰ相代謝的重要酶系，在生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著至關重要的作用[13]。藥物代謝可分為2類：Ⅰ相(氧化、還原和水解)和Ⅱ相(共軛)。該模型已經(jīng)在醫(yī)藥學領域內(nèi)廣泛應用，具有簡便、代謝過程快、重現(xiàn)性好、易大量操作等優(yōu)勢，在法庭科學領域?qū)π滦投酒反x物的研究方面具有良好的應用前景。目前，美國國家科學技術研究院(National Institute of Standard and Technology, NIST)GC-MS質(zhì)譜庫(2017版)中缺乏二氯西泮的信息，關于這2種化合物代謝物的詳細信息更是鮮有報道[14-15]。

本工作擬采用液相色譜-Q-Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜(LC-Q-Exactive-Orbitrap-MS)技術分離并檢測4′-氯地西泮和二氯西泮在體外肝微粒體孵育體系中的代謝產(chǎn)物，結(jié)合二級質(zhì)譜(MS/MS)鑒定代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并推測其代謝途徑，旨為建立生物樣品中該類物質(zhì)的檢驗方法提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Thermo Fisher Ultimate 3000液相色譜儀，配備LC-Q-Exactive Orbitrap MS：美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源(HESI)及Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；DK-S22電熱恒溫水浴鍋：上海精宏試驗設備有限公司產(chǎn)品；Minspin高速離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；XW-80A渦旋混合器：上海醫(yī)大儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)：美國Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

二氯西泮、4′-氯地西泮: 美國Cerilliant公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸銨(色譜純): 瑞士Fluk公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲酸(色譜純)：上海安譜實驗科技有限公司產(chǎn)品；Wistar大鼠肝微粒體(雄性，20 g/L)，NADPH再生系統(tǒng)(1.3 mmol/L NADP+、3.3 mmol/L 6-磷酸葡萄糖、3.3 mmol/L氯化鎂、0.4 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶、0.05 mmol/L檸檬酸鈉)：北京匯智泰康醫(yī)藥技術有限公司產(chǎn)品。

肝微粒體送達后在室溫下解凍、分裝，儲存于-80 ℃冰箱中。

1.3 實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse plus C18柱(100 mm×2.1 mm×5 μm)，Zorbax C18保護柱(12.5 mm×2.1 mm×5 μm)；流動相：A為20 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸-5%乙腈，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min(98%A),0.5～10 min(98%～2%A),10～15 min(2%A),15～16 min(98%A)；柱溫25 ℃；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子模式，鞘氣流速35 L/h，輔助氣流速15 L/h，噴霧電壓3.5 kV，毛細管溫度325 ℃，輔助氣溫度300 ℃，使用的氣體均為高純氮氣，采用一級全掃描和自動觸發(fā)二級(Full scan-ddMS2)的數(shù)據(jù)采集模式。

Full scan-ddMS2參數(shù)設置如下：Full MS分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500，自動增益控制為3×106，最大注入時間為200 ms，質(zhì)量掃描范圍為m/z70～1 050，歸一化碰撞能量設置為20、40、60 eV。

1.4 肝微粒體實驗

將4′-氯地西泮和二氯西泮溶解于甲醇中，制成1 g/L溶液，取2 μL加入新配制的NADPH再生系統(tǒng)溶液(終體積200 μL：0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4)，1.3 mmol/L NADPH+,3.3 mmol/L 6-磷酸葡萄糖，3.3 mmol/L氯化鎂，0.05 mmol/L檸檬酸鈉，0.4 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，Wistar大鼠雌雄混合混合肝微粒體)中混合，將該混合溶液置于37 ℃水浴鍋中孵育4 h，再加入10 μL葡萄糖醛酸(UDPGA)，孵育1 h，最后向反應體系中加入200 μL冰乙腈終止反應，渦旋3 min，13 500 r/min離心5 min，取100 μL上清液至玻璃進樣瓶中，進樣量為10 μL，進行LC-HRMS分析。

用相同的方法設置了3個對照組，分別是：對照組1(不添加肝微粒體)、對照組2(不添加NADPH)、對照組3(不添加底物)。

2 結(jié)果與討論

2.1 4′-氯地西泮的質(zhì)譜分析

在正離子模式下，4′-氯地西泮的保留時間為9.09 min，準分子離子峰[M+H]+為m/z319。在ESI離子源下，m/z319經(jīng)碰撞誘導解離后產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z291、256、227、154。其中m/z291是丟失了1個中性碎片CO形成的，裂解產(chǎn)生的m/z256碎片離子峰比m/z291碎片離子小35 u，表明丟失了1個氯原子，m/z256斷裂失去1個中性碎片CH2NH形成碎片子離子m/z227，在此基礎上斷裂5位上的苯環(huán)，從而產(chǎn)生了特征峰強度最高的碎片離子m/z154，詳細的裂解途徑示于圖2。

圖2 在正離子模式下，4′-氯地西泮的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Fragmentation pathways of 4′-chlorodiazepam in positive ion mode

2.2 4′-氯地西泮的代謝產(chǎn)物分析

采用LC-Q-Exactive Orbitrap MS進行分析，通過對比實驗組和空白組的質(zhì)譜圖，結(jié)合碎片離子信息和4′-氯地西泮的裂解規(guī)律，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級質(zhì)譜圖特征碎片離子等信息，對可能的代謝物進行定性分析，從樣品的總離子流圖中共鑒定出5種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和2種Ⅱ相代謝產(chǎn)物，對應的提取離子流圖示于圖3。4′-氯地西泮的主要生物轉(zhuǎn)化途徑包括羥基化、脫烷基化以及與葡萄糖醛酸結(jié)合。4′-氯地西泮經(jīng)肝微粒體體外代謝產(chǎn)物的反應類型、化學結(jié)構(gòu)式、保留時間、質(zhì)子化分子離子[M+H]+質(zhì)量數(shù)(m/z)及質(zhì)量偏差列于表1。4′-氯地西泮 (M0)及其代謝產(chǎn)物(M1～M7)的二級質(zhì)譜圖示于圖4。

圖3 4′-氯地西泮(a)、 二氯西泮(b)及其代謝產(chǎn)物的LC-MS提取離子流圖Fig.3 Extracted ion chromatograms (EIC) of 4′-chlorodiazepam (a), diclazepam (b) and its metabolites

表1 4′-氯地西泮和二氯西泮經(jīng)肝微粒體體外代謝的代謝產(chǎn)物信息Table 1 Data of metabolism of 4′-chlorodiazepam and diclazepam in liver microsomes in vitro

圖4 4′-氯地西泮及其代謝產(chǎn)物經(jīng)碰撞誘導解離后的MS2圖Fig.4 MS2 spectra of 4′-chlorodiazepam and its metabolites by collision induced dissociation

2.2.1M1和M2代謝物分析 代謝物M1和M2的準分子離子均為m/z335[M+H]+，保留時間分別為6.63、8.30 min，比4′-氯地西泮準分子離子大16 u，推測是單羥基化代謝產(chǎn)物。4′-氯地西泮分子中含有2個氯原子，因此，M1和M2也應含有2個氯原子，且出現(xiàn)同位素峰[M+H+2]+(m/z337)和[M+H+4]+(m/z339)，同時出現(xiàn)峰強度比值[M+H]+(m/z335)∶[M+H+2]+(m/z337)∶[M+H+4]+(m/z339)=9∶6∶1，推測M1和M2可能是4′-氯地西泮的氧化代謝產(chǎn)物，屬于同分異構(gòu)體。此外，M1準分子離子峰m/z335的二級碎片離子m/z289是在分子離子峰的基礎上同時脫去1分子CO和H2O形成的，繼續(xù)脫去CH2NH形成離子m/z260，推測可能是代謝產(chǎn)物M1-1或M1-2。而M2是4′-氯地西泮主要的代謝產(chǎn)物之一，其特征碎片是m/z317和m/z289，準分子離子[M+H]+m/z335首先脫掉1分子水形成碎片離子m/z317，在此基礎上脫去1分子CO后形成m/z289，與4′-氯地西泮的裂解方式一致。結(jié)果表明，M2為3位上的羥基取代的代謝產(chǎn)物(氯甲西泮)，主要碎片離子與相關文獻[14]報道一致。

2.2.2M3代謝物分析 代謝物M3的準分子離子峰m/z305[M+H]+，保留時間為8.42 min，與4′-氯地西泮的準分子離子m/z319相差14 u，因此，推測丟失了CH2，即M3是在4′-氯地西泮的基礎上N-脫烷基化得到的代謝產(chǎn)物(地洛西泮)。代謝產(chǎn)物M3也含有2個氯原子，且符合同位素峰[M+H]+(m/z305)：[M+H+2]+(m/z307)：[M+H+4]+(m/z309)=9∶6∶1，準分子離子m/z305的特征碎片為m/z277和242，與4′-氯地西泮的特征碎片m/z291和256分別相差14 u，可參考原藥4′-氯地西泮的斷裂方式，苯二氮環(huán)上脫去1分子CO形成碎片離子m/z277，在此基礎上C—Cl鍵斷裂形成m/z242。

2.2.3M4代謝物分析 代謝物M4的準分子離子峰[M+H]+m/z321，保留時間為7.66 min，與4′-氯地西泮的準分子離子相差2 u，去甲基后的相對分子質(zhì)量減少了14 u，氧原子的相對原子質(zhì)量為16 u，推測M4′是經(jīng)過N-脫烷基和單羥基化得到的代謝產(chǎn)物(勞拉西泮)。代謝產(chǎn)物M4中含有2個氯原子，同樣符合同位素峰[M+H]+(m/z321)∶[M+H+2]+(m/z323)∶[M+H+4]+(m/z325)=9∶6∶1，進一步證實了該推測。準分子離子[M+H]+m/z321的主要碎片離子為m/z303、275和138，其中碎片離子m/z321脫去1分子水后形成m/z303，在此基礎上失去1分子CO形成碎片離子m/z275。

2.2.4M5代謝物分析 代謝物M5的準分子離子峰[M+H]+m/z351，保留時間為6.39 min，與4′-氯地西泮的準分子離子相差32 u，氧原子的相對原子質(zhì)量為16 u，推測該化合物為4′-氯地西泮的雙氧化代謝產(chǎn)物，同時符合同位素峰[M+H]+(m/z351)：[M+H+2]+(m/z353)∶[M+H+4]+(m/z355)=9∶6∶1，進一步證實了推測。但因為該代謝產(chǎn)物的濃度較低，沒有得到相應的二級質(zhì)譜圖，故推測M5為雙羥基化代謝產(chǎn)物。

2.2.5M6和M7代謝物分析 代謝物M6的準分子離子峰[M+H]+m/z511，保留時間為5.97 min，與4′-氯地西泮的準分子離子相差192 u，葡萄糖醛酸苷的相對分子質(zhì)量為176 u，同時符合同位素峰[M+H]+(m/z511)∶[M+H+2]+(m/z513)∶[M+H+4]+(m/z515)=9∶6∶1，推測其為Ⅰ相代謝物M1或者M2的葡萄糖醛酸結(jié)合物。根據(jù)圖4可知，代謝物M6在裂解過程中還形成了碎片離子m/z317、239和180，進一步驗證了該化合物為M2的葡萄糖醛酸結(jié)合物。

代謝物M7的準分子離子峰[M+H]+m/z497，保留時間為5.72 min，與4′-氯地西泮的準分子離子相差178 u，其中葡萄糖醛酸苷的相對分子質(zhì)量為176 u，去甲基后的相對分子質(zhì)量減少了14 u，符合同位素峰[M+H]+(m/z497)∶[M+H+2]+(m/z499)∶[M+H+4]+(m/z501)=9∶6∶1，推測M7先發(fā)生了去甲基化和羥基化反應生成代謝產(chǎn)物，在此基礎上與葡萄糖醛酸苷結(jié)合形成代謝物M7。同時根據(jù)圖4可得，代謝物M7在裂解過程中形成碎片離子m/z303和275，證實了代謝物M7是M4的葡萄糖醛酸結(jié)合物。

2.3 二氯西泮的代謝產(chǎn)物鑒定

采用LC-Q-Exactive Orbitrap MS得到了二氯西泮實驗組和空白組的總離子流圖。通過對比2組質(zhì)譜圖，結(jié)合碎片離子信息和二氯西泮的裂解規(guī)律，從樣品的總離子流圖中共鑒定出6種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和1種Ⅱ相代謝產(chǎn)物，對應的提取離子流圖示于圖3。根據(jù)二氯西泮的結(jié)構(gòu)特點和在肝微粒體中主要發(fā)生的代謝反應，總結(jié)了二氯西泮經(jīng)肝微粒體體外代謝產(chǎn)物的反應類型、化學結(jié)構(gòu)式、保留時間、質(zhì)子化分子離子[M+H]+質(zhì)量數(shù)(m/z)及質(zhì)量偏差，列于表1。二氯西泮(M0′)及其代謝產(chǎn)物(M1′～M7′)的二級質(zhì)譜圖示于圖5。

圖5 二氯西泮及其代謝產(chǎn)物經(jīng)碰撞誘導解離后的MS2圖Fig.5 MS2 spectra of diclazepam and its metabolites by collision induced dissociation

在正離子模式下，二氯西泮的保留時間為8.20 min，準分子離子峰為[M+H]+m/z319，在ESI離子源下，m/z319經(jīng)碰撞誘導解離后產(chǎn)生的主要碎片離子為m/z291、256、227、154、125。其中m/z291是丟失了1個中性碎片CO產(chǎn)生的，裂解產(chǎn)生的m/z256碎片離子比m/z291小35 u，表明丟失了1個氯原子，m/z256的碎片子離子斷裂失去1個中性碎片CH2NH產(chǎn)生碎片子離子m/z227，碎片離子m/z291繼續(xù)斷裂5位上的苯環(huán)，從而產(chǎn)生碎片離子m/z154，失去1分子CH2NH生成m/z125，裂解途徑可參考圖2。

代謝產(chǎn)物M1′、M2′、M3′、M4′的裂解途徑可參考4′-氯地西泮的代謝產(chǎn)物M1、M2、M3、M4的碎片裂解途徑，這里不再贅述。

代謝物M5′和M6′與二氯西泮的準分子離子相差32 u，推測該化合物為二氯西泮的雙氧化代謝產(chǎn)物，同時符合同位素峰[M+H]+(m/z351)∶[M+H+2]+(m/z353)∶[M+H+4]+(m/z355)=9∶6∶1，進一步證實了推測。代謝產(chǎn)物M5′、M6′的保留時間分別為6.28和6.53 min，表明都是在二氯西泮的基礎上發(fā)生了雙羥基化反應，主要碎片離子為m/z305，表明碎裂時首先失去了1分子水生成m/z333離子，失去1分子CO生成m/z305離子，但難以確定羥基化的具體位置，故推測M5′、M6′為雙羥基化代謝產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物M7′的準分子離子為m/z511，與m/z335相差176 u，推測為單羥基化Ⅰ相代謝產(chǎn)物的葡萄糖醛酸結(jié)合物，同時符合同位素峰[M+H]+(511)∶[M+H+2]+(513)∶[M+H+4]+(515)=9∶6∶1，進一步證實了推測。碎裂時首先失去葡萄糖醛酸苷，得到了代謝產(chǎn)物M2′，且M7′產(chǎn)生的特征碎片離子m/z317和289與M2′的碎片離子一致，故推測代謝物M7′為代謝產(chǎn)物M2′的葡萄糖醛酸結(jié)合物。

2.4 討論

本研究通過大鼠肝微粒體體外孵育體系模擬人體內(nèi)的代謝，對4′-氯地西泮和二氯西泮的代謝物和代謝途徑進行了研究，利用LC-Q-Exactive-Orbitrap-MS聯(lián)用技術分析得到代謝產(chǎn)物。4′-氯地西泮在大鼠肝微粒體中經(jīng)代謝共產(chǎn)生5種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和2種葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，其中N-去甲基-4′-氯地西泮、3-羥基-4′-氯地西泮和N-去甲基-3-羥基-4′-氯地西泮有文獻[14]報道。二氯西泮在大鼠肝微粒體中經(jīng)過代謝共產(chǎn)生6種Ⅰ相代謝產(chǎn)物和1種葡萄糖醛酸化的Ⅱ相代謝產(chǎn)物，其中氯甲西泮、地洛西泮和勞拉西泮有文獻[14]報道，主要涉及的代謝途徑包括去甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化。根據(jù)鑒定所得的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)可以推斷出4′-氯地西泮和二氯西泮及其代謝產(chǎn)物之間的代謝途徑，分別示于圖6和圖7。4′-氯地西泮和二氯西泮原藥及其代謝產(chǎn)物的裂解途徑具有類似的裂解過程(脫掉CO、H2O、CH4等中性碎片)和相同的質(zhì)譜碎片，碎片離子的豐度存在差異，但根據(jù)保留時間可以進行較好區(qū)分。其中，雙羥基代謝產(chǎn)物為首次發(fā)現(xiàn)，4′-氯地西泮經(jīng)過肝微粒體體外孵育后共得到2個雙羥基代謝產(chǎn)物，而二氯西泮只獲得1種雙羥基代謝產(chǎn)物，推測可能是氯原子取代位置的不同使化合物的化學性質(zhì)發(fā)生改變，原因有待進一步研究。實驗發(fā)現(xiàn)，代謝物M2、M3、M4、M2′、M3′、M4′的含量較其他的代謝產(chǎn)物高，因此，M2、M3、M4可作為4′-氯地西泮臨床或濫用監(jiān)測的代謝標志物，M2′、M3′、M4′可作為二氯西泮濫用監(jiān)測的代謝標志物。今后研究可通過實際案件中收集到的陽性血、尿樣品加以證實。

圖6 4′-氯地西泮肝微粒體體外代謝的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of 4′-chlorodiazepam with liver microsome in vitro

圖7 二氯西泮肝微粒體體外代謝的代謝途徑Fig.7 Metabolic pathways of diclazepam with liver microsome in vitro

3 結(jié)論

本研究通過大鼠肝微粒體體外孵育體系結(jié)合LC-Q-Exactive-Orbitrap-MS聯(lián)用技術分析各代謝產(chǎn)物的色譜保留時間、高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及碎片離子信息等，共鑒定到7種4′-氯地西泮的代謝產(chǎn)物和7種二氯西泮的代謝產(chǎn)物，推測主要發(fā)生了脫烷基化、羥基化和葡萄糖醛酸結(jié)合等代謝反應，初步闡明了4′-氯地西泮和二氯西泮的Ⅰ相和Ⅱ相代謝途徑。該結(jié)果可為研究4′-氯地西泮和二氯西泮在人體內(nèi)的代謝行為提供借鑒，為臨床醫(yī)學及法醫(yī)學實驗室及相關案件的檢測提供參考。