張雨沐，李 鑫，于大偉，孫鈺菲，劉興華，王文艷

(1.煙臺(tái)大學(xué)藥學(xué)院，新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，分子藥理和藥物評(píng)價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264010；2.山東綠葉制藥有限公司長(zhǎng)效和靶向制劑國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 煙臺(tái) 264010)

纈苯那嗪(VBZ)是突觸囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體2(VMAT2)抑制劑，通過(guò)阻斷VMAT2發(fā)生作用，抑制其活性，從而減少單胺類物質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)到突觸前囊泡中的攝取和儲(chǔ)存，使單胺類物質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中被單胺氧化酶代謝，導(dǎo)致釋放到突觸中的單胺類物質(zhì)濃度降低，抵消多巴胺系統(tǒng)活性增強(qiáng)[1-2]。VBZ于2017年4月11日獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)在美國(guó)上市，商品名為 Ingrezza，是首個(gè)用于遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙成年患者的藥物[3-4]。VBZ是丁苯那嗪代謝產(chǎn)物中活性最強(qiáng)的(+)-α-DHTBZ的纈氨酸酯(前藥)[5-7]，其在口服后經(jīng)水解代謝為(+)-α-DHTBZ，是主要的活性物質(zhì)[8]。VBZ在體內(nèi)主要經(jīng)氧化代謝為單氧化纈苯那嗪，活性降低；另外形成脫甲基代謝產(chǎn)物失去活性[9-10]。

P109是VBZ結(jié)構(gòu)改造產(chǎn)物，其在9位進(jìn)行了環(huán)丙烷甲基取代，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為活性化合物P105，結(jié)構(gòu)示于圖1，其具有與(+)-α-DHTBZ相似的藥理活性。

圖1 P109、P105結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagrams of P109 and P105

在早期的藥物-藥物相互作用確定中，體外肝微粒體孵育體系是研究藥物代謝的重要模型[11-12]，雖然與體內(nèi)樣品相比，體外孵化樣品中藥物代謝物的譜圖通常較簡(jiǎn)單[13]，但適宜條件下，體內(nèi)外代謝產(chǎn)物具有較好的相關(guān)性[14]。高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)聯(lián)用技術(shù)具有靈敏度高、檢測(cè)速度快和質(zhì)量準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，是藥物代謝產(chǎn)物分析的有力手段[15-16]。本研究擬采用人肝微粒體體外孵育模型，利用超高效液相色譜-高性能臺(tái)式四極桿-軌道阱質(zhì)譜(UHPLC-Q ExactiveTMOrbitrap MS)技術(shù)，在正離子模式下研究P109在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物，利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)研究P109代謝酶表型，旨為新藥的開發(fā)和可能的藥物相互作用研究提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Vanquish Flex高效液相色譜儀與Q ExactiveTMOrbitrap質(zhì)譜儀(配有加熱電噴霧離子化源(HESI)和Xcalibur4.2工作站)、Ultimate 3000高效液相色譜儀與TSQ Quantum Access 質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子化源(ESI)，Xcalibur4.1工作站)、Legend Micro 21R微量臺(tái)式離心機(jī)：美國(guó)Thermo Scientific公司產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；HSC-24A型氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；XS105型電子分析天平(十萬(wàn)分之一)：德國(guó)Mettler-Toledo公司產(chǎn)品；MDF-U4186S型醫(yī)用低溫箱：日本三洋公司產(chǎn)品； DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

P109、P105：純度大于99%，由山東綠葉制藥有限公司合成；7-OH香豆素(批號(hào)BCBZ4431，純度99%)、甲酸(批號(hào)SHBJ0951，規(guī)格500 mL，96%)：美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈：色譜級(jí)，德國(guó)Meker公司產(chǎn)品；還原型輔酶Ⅱ(NADPH)(批號(hào)36554423，規(guī)格100 mg，98%)：美國(guó)Rocheroche Diagnositics GmbH公司產(chǎn)品；磷酸緩沖鹽(批號(hào)SLBX1022)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；人肝微粒體(批號(hào)JPXY，規(guī)格 20 g/L)：瑞德肝臟疾病研究所(上海)有限公司產(chǎn)品；娃哈哈純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：Waters Eclipse Plus-C18柱(150 mm×2.1 mm×3.5 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～1.0 min(95%A)，1.0～5.0 min(90%A)，5.0～8.0 min(80%A)，8.0～12.0 min(70%A)，12.0～15.0 min(5%A)，15.0～20.0 min(95%A)；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2Q ExactiveTMOrbitrap質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(HESI)，正離子模式檢測(cè)；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣壓力206.85 kPa，輔助氣壓力68.95 kPa。樣品采用高分辨全掃描(Full MS/dd-MS2)，一級(jí)掃描分辨率70 000，二級(jí)掃描分辨率17 500，碰撞電壓(NCE)分別為20、40、60 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000。

1.3.3TSQ Quantum Access質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子模式檢測(cè)；噴霧電壓4.0 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣壓力206.85 kPa，輔助氣壓力34.475 kPa。樣品采用全掃描(Full scan)、二級(jí)離子全掃描(MS2scan)。根據(jù)代謝產(chǎn)物鑒定所得的質(zhì)譜圖確定監(jiān)測(cè)離子對(duì)，列于表1。

表1 HPLC-MS/MS監(jiān)測(cè)P109/P105代謝產(chǎn)物離子對(duì)Table 1 Ion pairs of P109/P105 metabolites in human liver microsomes detected by HPLC-MS/MS

1.4 人肝微粒體溫孵體系

實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組3組(n=3)。實(shí)驗(yàn)組為含P109的孵育體系；陽(yáng)性對(duì)照組為含陽(yáng)性探針底物(非那西丁、安非他酮、阿莫地奎、雙氯芬酸、S-美芬妥英、右美沙芬和咪達(dá)唑侖)孵育體系，確定孵育體系活性；陰性對(duì)照組孵育體系中不含NADPH，確定P109在體系中的穩(wěn)定性。

1.4.1代謝產(chǎn)物鑒定溫孵體系 溫孵管中先加入P109，氮?dú)獯蹈?，然后加入肝微粒體混合體系，渦旋30 s，置于37 ℃水浴預(yù)孵育5 min，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，孵育體系中各成分終濃度為：P109為10 μmol/L，肝微粒體為1 g/L，NADPH為1 mmol/L，總孵育體積為200 μL。分別于加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)后0和1 h，加入400 μL乙腈溶液終止反應(yīng)。將終止反應(yīng)的孵育樣品渦旋振蕩2 min，4 ℃下以13 000 r/min離心10 min，將上清液全部移取至1.5 mL離心管，氮?dú)獯蹈桑?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，即為待檢樣品。

1.4.2代謝產(chǎn)物酶表型研究溫孵體系 在溫孵管中先加入P109/P105和抑制劑(α-萘黃酮、鹽酸噻氯匹定、孟魯斯特納、磺胺苯吡唑、S-(+)-N-3芐基苯乙基內(nèi)酰脲、奎尼丁、酮康唑)，氮?dú)獯蹈?，加入肝微粒體混合體系，渦旋30 s，置于37 ℃水浴預(yù)孵育5 min，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)，孵育體系中各成分終濃度為：P109/P105為1 μmol/L，肝微粒體為0.2 g/L，NADPH 為1 mmol/L，總孵育體積為100 μL。分別于加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)后0和20 min，加入400 μL乙腈溶液終止反應(yīng)。后續(xù)同1.4.1節(jié)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.5.1代謝產(chǎn)物鑒定 質(zhì)譜掃描得到總離子流色譜圖(TIC)，利用Xcaliber4.2工作站，先用精確分子質(zhì)量推測(cè)可能的元素組成，再結(jié)合質(zhì)譜裂解碎片信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，通過(guò)分子式預(yù)測(cè)模塊，預(yù)測(cè)母離子和碎片離子的分子式，鑒定P109的體外代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，質(zhì)量精度誤差在5×10-6以內(nèi)。

1.5.2代謝產(chǎn)物酶表型研究 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel軟件，用以下公式進(jìn)行計(jì)算：代謝產(chǎn)物產(chǎn)量=20 min的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量-0 min的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；抑制率%=(1-含有抑制劑的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量/不含抑制劑的代謝產(chǎn)物產(chǎn)量)×100%，根據(jù)計(jì)算結(jié)果繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 P109裂解規(guī)律推斷

在正離子模式下，P109的保留時(shí)間為10.4 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z459.320 28，分子式為C27H42N2O4，經(jīng)碰撞裂解，母離子丟失C2位上的纈氨酸，形成碎片離子[M+H-VAL]+m/z342.241 46，后丟失C9位上的環(huán)丙烷甲基，形成基峰[M+H-VAL-C4H6]+m/z288.194 64。此外，還形成碎片離子m/z405.273 19(脫環(huán)丙烷甲基)、m/z360.252 41(VAL C—O鍵斷裂)、m/z232.132 19(脫3位2-甲基丙基)、m/z178.085 51(環(huán)裂解)、m/z151.074 83(環(huán)裂解)，參考異喹啉生物堿裂解途徑[17-19]，推斷其裂解途徑示于圖2。這些碎片離子信息可用于后續(xù)代謝產(chǎn)物的鑒定和分析。

圖2 P109可能的裂解規(guī)律Fig.2 Fragmentation pathways of compound P109

2.2 P109代謝產(chǎn)物分析與鑒定

在NADPH存在的體外人肝微粒體孵育體系中共篩選并鑒定出1個(gè)原型和8個(gè)代謝產(chǎn)物，離子流圖示于圖3，代謝產(chǎn)物信息列于表2。

表2 UHPLC-Q ExactiveTM Orbitrap MS檢測(cè)P109的肝微粒體代謝產(chǎn)物表征Table 2 Characteristic fragment ions of compound P109 metabolites in human liver microsomes by UHPLC-Q ExactiveTM Orbitrap MS

注：a.孵育0 h；b.孵育1 h

代謝產(chǎn)物1的保留時(shí)間為7.9 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z306.205 11(-1.26×10-6，C18H27NO3)，比P109低153 u，且產(chǎn)生的m/z288、178、151與P109二級(jí)碎片離子峰相同，推測(cè)為酯鍵水解為羥基(-99 u)且脫環(huán)丙烷甲基(-54 u)形成的產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物2和4的保留時(shí)間分別為9.1、9.6 min，準(zhǔn)分子離子峰分別為[M+H]+m/z475.315 31(-1.34×10-6，C27H42N2O5)、[M+H]+m/z475.315 64(-1.01×10-6，C27H42N2O5)，推測(cè)代謝產(chǎn)物2、4為單氧化(+16 u)產(chǎn)物。代謝產(chǎn)物2丟失1個(gè)水分子形成二級(jí)碎片離子m/z457，且具有二級(jí)碎片離子m/z304、286，推測(cè)氧化部位位于2-甲基丙基，脫去水分子使該部位質(zhì)荷比減小2 u，脫去該部位后形成的碎片離子m/z178、232與P109一致。代謝產(chǎn)物4具有二級(jí)碎片離子m/z288、342、360、178，與P109二級(jí)碎片離子相同，推測(cè)氧化部位位于纈氨酸酯，酯基水解為羥基時(shí)隨酯基一起脫去。

代謝產(chǎn)物3的保留時(shí)間為9.1 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z376.248 24(-0.90×10-6，C22H33NO4)，且生成二級(jí)碎片離子m/z358、304、178、151，與代謝產(chǎn)物2相同，為2-甲基丙基氧化后脫水形成一系列碎片離子，推測(cè)代謝產(chǎn)物3為酯基水解為羥基(-99 u)同時(shí)單氧化(+16 u)形成的產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物5的保留時(shí)間為10.4 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z405.273 90(-0.88×10-6，C23H36N2O4)，比P109低54 u，推測(cè)為脫環(huán)丙烷甲基(-54 u)產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物6的保留時(shí)間為10.4 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z459.320 28(-1.45×10-6，C27H42N2O4)，保留時(shí)間與碎片離子峰均與P109對(duì)照品一致，推測(cè)為P109。

代謝產(chǎn)物7的保留時(shí)間為11.6 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z358.235 75(-0.82×10-6，C22H31NO3)，比P109低101 u，推測(cè)為酯基水解(-99 u)后脫氫(-2 u)產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物8的保留時(shí)間為12.1 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z360.252 57(-0.75×10-6，C22H33NO3)，比P109低99 u，且保留時(shí)間和碎片離子峰均與化合物P105對(duì)照品一致，推測(cè)為酯基水解(-99 u)產(chǎn)物。

代謝產(chǎn)物9的保留時(shí)間為12.4 min，準(zhǔn)分子離子峰為[M+H]+m/z491.310 70(-0.86×10-6，C27H42N2O6)，比P109高32 u，推測(cè)為雙氧化(+33 u)產(chǎn)物。

2.3 P109代謝途徑分析

根據(jù)原型化合物及代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解信息，推測(cè)P109的代謝途徑示于圖4。

圖4 P109經(jīng)人肝微粒體的代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of P109 in liver microsomal samples

P109體外主要經(jīng)歷3個(gè)代謝途徑：1) 發(fā)生氧化反應(yīng)生成化合物2、4和9，P109在2-甲基丙基或纈氨酸酯上發(fā)生單氧化形成代謝產(chǎn)物2和4，同時(shí)發(fā)生雙氧化反應(yīng)或代謝產(chǎn)物2、4進(jìn)一步氧化形成代謝產(chǎn)物9；2) 發(fā)生水解反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物1、3、7和8，P109纈氨酸酯水解為羥基生成代謝產(chǎn)物8，進(jìn)一步發(fā)生脫環(huán)丙烷甲基、單氧化、脫氫反應(yīng)，生成代謝產(chǎn)物1、3和7；3) 發(fā)生脫環(huán)丙烷甲基反應(yīng)生成代謝產(chǎn)物5。經(jīng)藥理研究發(fā)現(xiàn)，P109與VBZ相似，是前藥，其在體內(nèi)纈氨酸酯鍵斷裂形成的代謝產(chǎn)物8(P105)具有VMAT2抑制作用，且對(duì)VMAT2的親和力遠(yuǎn)高于前藥P109，是主要的活性物質(zhì)。

2.4 P109代謝產(chǎn)物酶表型研究

對(duì)P109溫孵樣品監(jiān)測(cè)代謝產(chǎn)物2、4、5、8(P105)，P105溫孵樣品監(jiān)測(cè)代謝產(chǎn)物1、3、7，雙氧化代謝產(chǎn)物因生成量過(guò)少不予監(jiān)測(cè)，計(jì)算各代謝產(chǎn)物不同亞型CYP酶抑制率，示于圖5。

圖5 特異性化學(xué)抑制劑對(duì)人肝微粒體中P109(a)和P105(b)代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of specific chemical inhibitors on metabolism of P109 (a) and P105 (b) in human liver microsomes

研究表明，CYP3A4參與50%以上臨床用藥的Ⅰ相代謝[20]；CYP2D6參與代謝的藥物占總P450代謝藥物的30%[21]；CYP2C8負(fù)責(zé)至少5%的臨床藥物代謝，主要包括紫杉醇6-α羥基化反應(yīng)和阿莫地喹N-脫烷基化反應(yīng)[22]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，氧化代謝產(chǎn)物2、3、4，脫氫代謝產(chǎn)物7主要經(jīng)CYP3A4代謝，CYP2C8為其次要代謝亞型酶；脫環(huán)丙烷甲基代謝產(chǎn)物1、5主要經(jīng)CYP2C8代謝，次要代謝亞型為CYP3A4和CYP2D6。水解代謝產(chǎn)物8涉及多種亞型酶，且在孵育體系中會(huì)發(fā)生進(jìn)一步代謝，主要代謝亞型暫時(shí)無(wú)法推斷，需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用UHPLC-Q ExactiveTMOrbitrap MS技術(shù)快速篩選并鑒定了P109經(jīng)人肝微粒體體外代謝的產(chǎn)物，對(duì)篩選出的8個(gè)代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒別，均為無(wú)明顯毒性結(jié)構(gòu)的Ⅰ相代謝產(chǎn)物，并闡述了P109的肝微粒體代謝規(guī)律以及各代謝產(chǎn)物的代謝酶表型。P109為前藥型新化合物，本研究有助于闡明藥物的體內(nèi)代謝途徑，對(duì)于藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)和藥物的安全性評(píng)價(jià)等研究具有重要意義，同時(shí)為體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果外推至體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供了理論支持。