李婕，馬思齊，許駿堯，鄭亞威，王藝璇，李海濤

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

高血壓是影響全世界10億多人的重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn),是造成全球發(fā)病率和死亡率的主要因素之一[1]。2012年至2015年的調(diào)查顯示,23.2%的18歲以上的中國人(即約2.445億人)患有高血壓,而41.3%的人(即約4.353億人)處于高血壓前期狀態(tài)[2]。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看,高血壓會(huì)增加心力衰竭、腦卒中、視力喪失和慢性腎臟病等的風(fēng)險(xiǎn)[3]。腎臟是高血壓損傷的主要靶器官之一,在血壓長(zhǎng)期控制不良的情況下,可逐漸發(fā)生廣泛的腎小動(dòng)脈與腎小球硬化,導(dǎo)致腎功能損害,最終進(jìn)展為終末期腎病[4]。

足細(xì)胞,又稱為腎小球上皮細(xì)胞,位于腎小球外側(cè)并覆蓋毛細(xì)血管壁,在腎臟的腎小球?yàn)V過中起重要作用[5]。高血壓的發(fā)生激活了局部組織血管緊張素系統(tǒng),從而增加了血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)的產(chǎn)生,導(dǎo)致足細(xì)胞損傷等不良反應(yīng)[6]。研究表明,足細(xì)胞損傷在高血壓腎損害進(jìn)展中起著重要作用。

在高血壓腎損害的治療中,中醫(yī)藥具有多靶點(diǎn)、多層次、多環(huán)節(jié)的優(yōu)勢(shì),在實(shí)現(xiàn)降壓效果的同時(shí)保護(hù)腎臟。潛陽育陰顆粒(QYYY)針對(duì)高血壓腎損害“肝陽亢盛、肝腎陰虛、瘀阻腎絡(luò)”的病機(jī)特點(diǎn),由鬼針草、制何首烏、酒萸肉、玄參、川牛膝、澤瀉6味藥物制成[7],具有清肝補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)作用,已作為江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑廣泛應(yīng)用于臨床20余年,療效確著。前期研究發(fā)現(xiàn),QYYY可以輔助降壓并改善陰虛陽亢型高血壓的炎癥反應(yīng),改善尿蛋白、尿微量白蛋白等早期腎損害指標(biāo)[8-9]。本研究主要探究QYYY對(duì)高血壓足細(xì)胞損傷的改善作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)50只,8～9周齡;SPF級(jí)Wistar Kyoto(WKY)雄性大鼠10只,8～9周齡。均購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006。SPF級(jí)SD雄性大鼠42只,8～9周齡,購于杭州醫(yī)學(xué)院,許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于江蘇省中醫(yī)院制劑部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)溫度23～25 ℃,濕度40%～70%。所有動(dòng)物均適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，倫理批號(hào)：2019 DW-07-02。

1.2 細(xì)胞

大鼠足細(xì)胞ZY-907,購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.3 藥物與試劑

QYYY,由江蘇省中醫(yī)院制劑部生產(chǎn),批號(hào):2103010。纈沙坦膠囊,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):X2998。

Ang Ⅱ(貨號(hào)：A9525),購自美國Sigma。Anti-TRPC6 antibody(貨號(hào)：ab101622)、Anti-Nephrin antibody(貨號(hào)：ab216341)購自Abcam。Anti-Desmin Antibody(貨號(hào)：16520-1-AP)、Anti-NPHS2 Antibody(貨號(hào)：20384-1-AP)、Anti-GAPDH Antibody(貨號(hào)：60004-1-Ig),購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分為6組,分別是空白組、模型組、潛陽育陰低劑量組(QYYYL)、潛陽育陰中劑量組(QYYYM)、潛陽育陰高劑量組(QYYYH)、陽性藥組?？瞻捉M為10只WKY大鼠,將SHR隨機(jī)分為5組,每組10只,各組大鼠均自由攝食攝水。QYYYL、QYYYM、QYYYH分別以1.6、3.2、6.4 g·kg-1·d-1灌以QYYY混懸液,陽性藥組以8.5 mg·kg-1·d-1灌以纈沙坦混懸液。空白組和模型組每日灌胃生理鹽水,每日1次,持續(xù)8周。根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，大鼠藥物干預(yù)1 h后，腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，于后腹腔切取兩側(cè)腎臟組織。將一側(cè)腎臟皮質(zhì)分成兩份，分別用錫箔紙包好置于凍存管中，-80 ℃保存。另切取約10 mm×10 mm×2 mm大小的腎臟組織，置于多聚甲醛固定液中固定，用于后續(xù)制作切片進(jìn)行HE染色和Masson染色。

2.2 HE染色觀察QYYY對(duì)SHR腎臟的影響

取大鼠腎臟組織，用4%的多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片,二甲苯脫蠟,再經(jīng)由高濃度到低濃度乙醇,最后入蒸餾水,切片放入蘇木素水溶液中染色5 min,分化液分化20 s,雙蒸水沖洗,伊紅染色液染色3 min,雙蒸水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明2次,最后中性樹膠封固。

2.3 Masson染色觀察QYYY對(duì)SHR腎臟的影響

將各組織的石蠟切片脫蠟脫水,用配置好的Weigert鐵蘇木素染液染色5 min,酸性乙醇分化液分化10 s,雙蒸水沖洗,Masson藍(lán)化液返藍(lán)5 min,雙蒸水沖洗,麗春紅品紅染色液染色5 min,弱酸工作液(蒸餾水∶弱酸溶液=2∶1)清洗1 min,磷鉬酸溶液洗1 min,再用弱酸工作液清洗1 min,直接放入苯胺藍(lán)色液中染色2 min,弱酸工作液洗1 min,95%乙醇脫水二甲苯透明3次,每次1 min,中性樹膠封固。

2.4 MTT法測(cè)定不同濃度Ang Ⅱ?qū)Υ笫笞慵?xì)胞的損傷程度

將大鼠足細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),使用不同濃度(1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9mol·L-1)Ang Ⅱ的培養(yǎng)基干預(yù)足細(xì)胞24 h。每孔加20 μL MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h,離心,吸去上清,每孔加150 μL DMSO,搖晃均勻,于570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以空白組為“1”，進(jìn)行歸一化處理。

2.5 制備QYYY含藥血清

SPF級(jí)8～9周齡SD雄性大鼠共42只。共分為3個(gè)組,分別是空白組、QYYYH、纈沙坦組,每組14只。QYYYH:以臨床劑量的5倍給予QYYY熬制的水劑灌胃;纈沙坦組:以臨床劑量的5倍給予纈沙坦灌胃;空白組:以每100 g灌胃1 mL純水。連續(xù)灌胃7 d,以人體質(zhì)量為60 kg計(jì)算,藥物劑量換算為人臨床劑量的6.4倍。末次灌胃前1 d,完成灌胃后禁食不禁水,末次灌胃1 h后麻醉,腹主動(dòng)脈取血,采血管收集,靜置2 h后,3 000 r·min-1離心10 min,吸取上層血清,將同一組別的大鼠血清混合,于0.22 μm過濾器過濾后,56 ℃水浴滅活30 min,-20 ℃保存。

2.6 QYYY含藥血清對(duì)大鼠足細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)分為6組,空白組(10%正常組大鼠血清)、模型組(10%正常組大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYL組(2.5% QYYYH大鼠含藥血清+7.5%正常大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYM組(5% QYYYH大鼠含藥血清+5%正常大鼠血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、QYYYH組(10% QYYYH大鼠含藥血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)、陽性對(duì)照組(10%纈沙坦組含藥血清+1×10-6mol·L-1Ang Ⅱ)。

2.7 Western blot檢測(cè)

取大鼠腎臟組織,加RIPA裂解液裂解,研磨勻漿,冰上超聲裂解,4 ℃ 12 000 r·min-1離心20 min,吸取上清液,BCA法測(cè)定蛋白濃度,加上樣緩沖液,100 ℃煮蛋白10 min,放置-80 ℃冰箱保存。按BCA測(cè)定的上樣量加樣,每組20 μg,SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉1 h,4 ℃孵育一抗過夜,加入二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光液顯影,凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。提取經(jīng)QYYY含藥血清處理的大鼠足細(xì)胞總蛋白,超聲裂解,其余步驟同上,顯影采集圖像。

2.8 免疫熒光

將細(xì)胞接種于12孔板,加藥孵育24 h后,倒掉細(xì)胞上清液,用預(yù)熱的PBS洗滌3遍,滴加4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌3遍,用PBST(0.2% triton-100PBS)配置的5%的BSA封閉液室溫封閉1 h。滴加用免疫熒光一抗稀釋液稀釋的一抗,置于4 ℃過夜。PBS洗3遍,滴加用PBS配置的二抗,室溫避光孵育1 h。PBS洗滌3遍后,滴加用水配置的DAPI,用于染細(xì)胞核,室溫避光孵育10 min,PBS洗滌3遍后,抗淬滅劑封片,正置熒光顯微鏡選擇488 nm波長(zhǎng)拍照。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 HE染色觀察QYYY對(duì)SHR腎臟的影響

HE染色發(fā)現(xiàn),空白組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)緊密,腎小球形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚,腎小管排列緊密,無明顯病理變化;模型組大鼠腎小球出現(xiàn)病理性皺縮,腎小管管腔擴(kuò)張明顯,細(xì)胞排列疏松紊亂,有明顯的空泡;QYYYL和QYYYM大鼠腎小球萎縮,腎小管結(jié)構(gòu)疏松;QYYYH大鼠腎臟腎小球無明顯萎縮,腎小管排列大致正常,細(xì)胞排列較為緊密;纈沙坦組大鼠腎小球無明顯萎縮,腎小管排列基本正常。見圖1。

圖1 各組大鼠腎臟HE染色(標(biāo)尺50 μm)Fig. 1 Comparison of renal HE staining in each group (The scale of 50 μm)

3.2 Masson染色觀察QYYY對(duì)SHR腎臟的影響

我們通過對(duì)Masson染色切片的觀察發(fā)現(xiàn),空白組大鼠無藍(lán)色膠原沉積;模型組大鼠有明顯的藍(lán)色膠原沉積且細(xì)胞排列疏松,有明顯的空泡;QYYY治療組藍(lán)色膠原沉積較模型組大鼠有明顯的減少,其中QYYYM和QYYYH大鼠腎臟與空白組大鼠腎臟Masson切片差異不明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟Masson染色(標(biāo)尺50 μm)Fig. 2 Comparison of renal Masson staining in each group (The scale of 50 μm)

3.3 Western blot檢測(cè)SHR腎臟TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白的表達(dá)水平

與空白組比較，模型組TRPC6、Desmin表達(dá)含量明顯升高(P<0.05,P<0.001),Podocin、Nephrin的蛋白含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比,QYYYL、QYYYM、QYYYH能明顯降低TRPC6、Desmin的表達(dá)水平(P<0.05,P<0.001),并且使Podocin、Nephrin表達(dá)升高(P<0.05,P<0.01),趨于空白組的各蛋白表達(dá)水平。見圖3。

注:與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖3 QYYY對(duì)SHR腎臟TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 3 Effects of QYYY on protein expression levels of TRPC6, Desmin, Nephrin and Podocin in SHR kidney

3.4 MTT法測(cè)定不同濃度Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞增殖的影響

通過不同濃度的Ang Ⅱ處理足細(xì)胞后,可以明顯看出1×10-6、1×10-5mol·L-1的Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞的增殖有明顯的抑制作用(P<0.05),因1×10-6mol·L-1和1×10-5mol·L-1的Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞抑制效果沒有差異,所以選擇1×10-6mol·L-1的Ang Ⅱ作為造模濃度。見圖4。

3.5 Western blot檢測(cè)足細(xì)胞TRPC6、Desmin、Nephrin、Podocin蛋白的表達(dá)水平

與空白組相比,模型組足細(xì)胞TRPC6、Desmin的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,P<0.001),Podocin、Nephrin的蛋白含量明顯降低(P<0.01,P<0.001)。與模型組相比,QYYYL、QYYYM、QYYYH及纈沙坦組能明顯降低TRPC6、Desmin的表達(dá)(P<0.05,P<0.01,P<0.001),并且使Podocin、Nephrin的蛋白表達(dá)升高(P<0.05,P<0.01)。見圖5。

注:與空白組比較,圖4 MTT法測(cè)定不同濃度Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞增殖的影響Fig. 4 The effects of different concentrations of Ang Ⅱ on podocyte proliferation by MTT assay

3.6 免疫熒光觀察QYYY含藥血清對(duì)足細(xì)胞TRPC6、Desmin表達(dá)水平的影響

免疫熒光觀察足細(xì)胞TRPC6、Desmin的蛋白表達(dá),TRPC6、Desmin在熒光顯微鏡下顯示綠光,DAPI核染顯示藍(lán)光。模型組足細(xì)胞綠光與正常組相比表達(dá)強(qiáng)烈,細(xì)胞核膜周圍熒光明顯,表明在Ang Ⅱ干預(yù)的足細(xì)胞中,TRPC6、Desmin表達(dá)明顯增加(P<0.001)。QYYYH綠光較模型組明顯減弱(P<0.001),與QYYYL、QYYYM相比有梯度變化的趨勢(shì)。QYYYH與纈沙坦組TRPC6、Desmin蛋白表達(dá)綠光更趨近于空白組。見圖6。

4 討論

腎小球是高血壓早期腎損害的作用靶點(diǎn)之一。持續(xù)的高血壓會(huì)導(dǎo)致腎損害,如腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化[10],會(huì)破壞腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、臟層上皮細(xì)胞的功能,從而影響腎小球基底膜的通透性,最終導(dǎo)致蛋白尿的形成[9]。本課題組使用HE染色和Masson染色方法,探究QYYY對(duì)于SHR腎損害病理的改善情況。HE染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎小球及腎小管有明顯的損傷,腎小球萎縮,腎小管管壁擴(kuò)張明顯,QYYY干預(yù)后腎小球結(jié)構(gòu)正常,腎小管細(xì)胞排列規(guī)整,其中QYYYH干預(yù)效果最為明顯。Masson染色發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎小管間質(zhì)出現(xiàn)了纖維化膠原的沉積,QYYY干預(yù)后有明顯的改善,QYYYL、QYYYM腎小管及腎小球形狀尚可,其中QYYYH干預(yù)效果最為明顯,腎小球及腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,QYYY能明顯改善腎小球萎縮及腎小管間質(zhì)纖維化從而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

足細(xì)胞作為無分裂增殖能力的終末分化細(xì)胞,其足突以規(guī)則間隔的交叉結(jié)構(gòu)附著在腎小球基底膜上,相鄰的足突所形成的一系列過濾縫隙成為裂孔隔膜(Slit diaphragms,SDs),參與維持腎小球?yàn)V過屏障的穩(wěn)定[11-13]。SDs通常由緊密連接和黏附連接的蛋白質(zhì)組成,例如Nephrin、Neph1和Podocin、緊密連接蛋白(ZO-1)和TRPC6等[14-15]。TRPC6是非選擇性的陽離子通道蛋白TRP家族的成員之一,Na+、K+、Ca2+都經(jīng)其通過,但其對(duì)Ca2+通透性最大,上調(diào)的TRPC6的表達(dá)使足細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高,不僅可以誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[16],減少足細(xì)胞數(shù)量,導(dǎo)致骨架蛋白排列紊亂,還可以促進(jìn)足突的消失及融合造成足細(xì)胞損傷[17]。相關(guān)文獻(xiàn)及前期研究均證實(shí),高血壓狀態(tài)下,腎臟內(nèi)Ang Ⅱ的濃度顯著升高,且遠(yuǎn)高于循環(huán)血水平[18-19]。Ang Ⅱ作為RAS中主要效應(yīng)分子,可誘導(dǎo)腎小球足細(xì)胞損傷,TRPC6表達(dá)水平升高[20]。Nephrin特異定位于足細(xì)胞足突SDs處,是構(gòu)成足細(xì)胞SDs的關(guān)鍵蛋白[21]。Nephrin具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和黏附分子的功能,在保持足細(xì)胞完整性方面起著重要作用,當(dāng)Nephrin表達(dá)減少或分布異常時(shí),會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞SDs結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,最終導(dǎo)致足細(xì)胞和腎小球損傷,它是判斷腎小球足細(xì)胞急性損傷的一個(gè)早期重要指標(biāo)[22-23]。

注:與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,圖5 QYYY含藥血清對(duì)足細(xì)胞TRPC6、Desmin、Nephrin、podocin蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 5 Effects of QYYY containing serum on protein expression levels of TRPC6, Desmin, Nephrin and Podocin in podocytes

注:與空白組比較,###P<0.001;與模型組比較,**P<0.01,***P<0.01。圖6 免疫熒光觀察QYYY含藥血清對(duì)足細(xì)胞TRPC6、Desmin蛋白表達(dá)水平的影響(標(biāo)尺50 μm)Fig. 6 Effects of QYYY containing serum on the expression levels of TRPC6 and Desmin proteins in podocytes were observed by immunofluorescence (The scale of 50 um)

Podocin是由基因NPSH2編碼的SDs蛋白,它和Nephrin同樣定位于SDs區(qū)域,Podocin和Nephrin在體外有直接的相互協(xié)同作用,Podocin在足突形成過程中吸附和穩(wěn)定Nephrin[21]。Podocin、Nephrin及其他相關(guān)蛋白之間相互作用形成蛋白復(fù)合體,在介導(dǎo)足細(xì)胞SDs與足突細(xì)胞骨架連接方面起重要作用[24],任一編碼足細(xì)胞標(biāo)志物的基因缺失或突變,足細(xì)胞結(jié)構(gòu)及腎小球正常濾過功能均會(huì)受到影響[25]。TRPC6與Nephrin、Podocin等其他足細(xì)胞標(biāo)記蛋白形成復(fù)合結(jié)構(gòu),可與足細(xì)胞其他骨架蛋白相互作用共同參與足細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞極化和穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)等生理功能[26-27]。

本研究結(jié)果顯示,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎臟皮質(zhì)組織中TRPC6較空白組蛋白表達(dá)明顯升高,Nephrin和Podocin較空白組表達(dá)明顯下降,而QYYYL、QYYYM、QYYYH組TRPC6較模型組表達(dá)下降,而Nephrin和Podocin表達(dá)明顯升高,并且隨著QYYY劑量的升高,該現(xiàn)象越顯著。體外實(shí)驗(yàn)中,Ang Ⅱ可使足細(xì)胞TRPC6蛋白表達(dá)升高,Nephrin和Podocin蛋白表達(dá)下降,提示Ang Ⅱ?qū)е麓笫笞慵?xì)胞損傷,而QYYYL、QYYYM、QYYYH能明顯下調(diào)TRPC6的表達(dá)以及上調(diào)Nephrin和Podocin的表達(dá)水平,提示QYYY可能通過上調(diào)TRPC6、下調(diào)Nephrin和Podocin的表達(dá)水平，從而改善Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。

足細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)、分布以及排列方式均與細(xì)胞的功能密切相關(guān),Desmin作為足細(xì)胞骨架的中間絲蛋白,正常情況下處于不表達(dá)或低表達(dá)水平,當(dāng)足細(xì)胞受損時(shí),骨架蛋白重新排列,Desmin會(huì)大量表達(dá)[28]。有研究發(fā)現(xiàn)Desmin的表達(dá)與足細(xì)胞損傷呈顯著正相關(guān),Desmin可以作為足細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[29]。

本研究結(jié)果顯示,在對(duì)以SHR為研究模型,QYYY為干預(yù)手段的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,本課題組發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎臟皮質(zhì)組織中Desmin表達(dá)含量顯著升高,說明腎臟足細(xì)胞發(fā)生了明顯的損傷。QYYYL、QYYYM、QYYYH中Desmin表達(dá)較模型組降低。這說明QYYY能改善SHR的腎臟足細(xì)胞損傷。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ可直接作用于足細(xì)胞,誘導(dǎo)其凋亡,破壞足細(xì)胞濾過屏障的完整性[30-31]。本研究體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ang Ⅱ可使足細(xì)胞Desmin表達(dá)升高,造成足細(xì)胞損傷,QYYYL、QYYYM、QYYYH能明顯下調(diào)Desmin的表達(dá)水平,從而改善足細(xì)胞損傷。

方祝元教授創(chuàng)新性地提出高血壓“病初即可及腎”,并認(rèn)為高血壓早期腎損害是“因?qū)嵵虏　钡膭?chuàng)新理論,并依據(jù)清肝補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)法創(chuàng)制了QYYY(鬼針草、制何首烏、酒山萸肉、玄參、川牛膝、澤瀉),主要治療高血壓腎損害的肝陽亢盛、肝腎陰虛、瘀阻腎絡(luò)證型。該組方著力以平肝潛陽為功,兼能清肝補(bǔ)腎、化瘀通絡(luò)。鬼針草、制首烏清肝瀉熱、化瘀通絡(luò)、滋補(bǔ)肝腎是為君藥,酒萸肉、玄參補(bǔ)益肝腎、收澀精氣是為臣藥,澤瀉、川牛膝利水瀉熱、化瘀利尿是為佐使。基于此方意,以中醫(yī)理論“肝陽亢盛、肝腎陰虛、瘀阻腎絡(luò)”是高血壓腎損害中心環(huán)節(jié)作為切入點(diǎn),在分子生物學(xué)水平可能表現(xiàn)為改善Ang Ⅱ造成的足細(xì)胞損傷,從而發(fā)揮腎保護(hù)作用。

綜上所述,SHR腎臟有明顯的病理變化,并且在腎臟皮質(zhì)組織中,TRPC6及Desmin表達(dá)升高,Nephrin、Podocin表達(dá)下降。QYYY能明顯改善SHR腎臟腎小球萎縮及腎小管間質(zhì)纖維化從而發(fā)揮腎保護(hù)作用,并且能下調(diào)TRPC6和Desmin的表達(dá),上調(diào)Nephrin和Podocin的表達(dá),改善足細(xì)胞損傷。體外實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了QYYY含藥血清能調(diào)節(jié)因Ang Ⅱ?qū)е碌淖慵?xì)胞標(biāo)志物蛋白異常的表達(dá),然而具體機(jī)制以及該方中調(diào)控足細(xì)胞損傷有效成分還有待進(jìn)一步研究。