盛?，?，王秋銳，尉 靜，關(guān)秀娟，趙利霞，左艷萍*

(1.北京市通州區(qū)新華醫(yī)院口腔正畸科，北京 101100；2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院口腔正畸科，河北 石家莊 050031)

功能性下頜前伸后髁突后部軟骨細(xì)胞增殖，但軟骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚不明確。已證實(shí)下頜骨髁狀突骨改建受多種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子的影響，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白、X型膠原Sox-9、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、核因子κB 受體活化因子配基、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP) -2 、MMP-9、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1、整合素β等[1-3]。這些調(diào)控因子并不是獨(dú)立存在的，而是與組織細(xì)胞內(nèi)許多相關(guān)因子聯(lián)合發(fā)揮作用，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2)是細(xì)胞膜上的大分子跨膜蛋白，能接收外界信號(hào)，其下游的信號(hào)因子磷脂酶C-γ1(phospholipase C-γ1，PLC-γ1)在腫瘤細(xì)胞、卵母細(xì)胞、牙周膜細(xì)胞等細(xì)胞的分裂增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,因此，PLC-γ1在許多疾病臨床治療中成為重要靶點(diǎn)[4-8]。那么PLC-γ1是否對(duì)軟骨細(xì)胞分裂、增殖有調(diào)控作用呢？其在下頜功能性前伸后髁突軟骨骨化過(guò)程中扮演了一個(gè)什么角色？本研究采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)PLC-γ1在大鼠功能性下頜前伸前后髁突軟骨后部表達(dá)水平的變化，探討 PLC-γ1在功能性下頜前伸后大鼠髁突后部軟骨骨化過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 60只4周齡健康雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，平均體重90 g。于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室(室溫約26 ℃)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)等量分為2組，實(shí)驗(yàn)組大鼠24 h/d佩戴自制斜面導(dǎo)板矯治器，對(duì)照組不作任何處理。于實(shí)驗(yàn)第1、3、7、14、21、28 天時(shí)2組采用斷頸法各處死5只。

1.2組織處理 大鼠處死后，盡快取出雙側(cè)整塊顳下頜關(guān)節(jié)，注意避免損傷關(guān)節(jié)囊。4%多聚甲醛 (0.1 mol/L PBS，pH 7.0～7.6，含0.1%焦磷酸二乙酯)固定24 h，10%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)室溫脫鈣2周(用大頭針針刺組織無(wú)阻力進(jìn)入表示脫鈣成功)，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，包埋時(shí)盡量保證髁突矢狀面與蠟塊表面平行。髁突縱向切片，厚度約5 μm，將組織切片附于經(jīng)多聚賴氨酸附膜的載玻片上，60 ℃過(guò)夜。

1.2.1HE染色 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精下行水化，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，1/500氨水中返藍(lán)，0.5%伊紅染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.2免疫組織化學(xué)分析 切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇置換二甲苯，1%甲醇過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液,室溫20 min。棄去多余液體,不洗。滴加一抗 (anti-PhosPho-PLC-γ1，兔多抗，assay公司，美國(guó))，4 ℃過(guò)夜。按免疫組織化學(xué)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)要求滴加生物素化第二抗體(IgG)， 37 ℃ 20 min。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS沖洗。3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。空白對(duì)照：PBS代替一抗。

1.3圖像分析 應(yīng)用光學(xué)顯微鏡(BX51TPHD-J11，奧林巴斯公司，日本)多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)采集40倍及400倍HE染色切片圖像，對(duì)髁突軟骨后部免疫組織化學(xué)染色切片，隨機(jī)選擇3個(gè)視野，采集400倍圖像，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和著色強(qiáng)度，取平均值，結(jié)果用強(qiáng)度-色調(diào)-飽和度(intensity-hue-saturation，IHS)值表示，計(jì)算公式為IHS=A×B。其中A表示陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取值范圍：0為0%，1為1%～10%,2為11%～50%，3為51%～80%，4為81%～100%；B表示著色強(qiáng)度，0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為陽(yáng)性，3為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，時(shí)點(diǎn)間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1HE染色結(jié)果 髁突軟骨厚度由后向前逐漸變薄，從軟骨表面向內(nèi)部分為5層，分別是表面纖維層、增殖層、過(guò)渡層、肥大層、鈣化軟骨層，各層細(xì)胞形態(tài)特征不同，層帶之間相互延續(xù)，軟骨下方為骨小梁，與軟骨的鈣化軟骨層相延續(xù)(圖1，2)。

2.2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)PLC-γ1表現(xiàn)為陽(yáng)性著色，DAB顯色棕黃色，著色水平明顯高于背景水平，主要表達(dá)于髁突軟骨的增殖層和過(guò)渡層。實(shí)驗(yàn)組第14天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)(圖3～6)。 空白對(duì)照組：PBS代替一抗組細(xì)胞質(zhì)未見(jiàn)陽(yáng)性著色顆粒(圖7)。

2.3IHS值統(tǒng)計(jì)結(jié)果 第7、14、21、28 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)的IHS值高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2組不同時(shí)間點(diǎn)PLC-γ1表達(dá)的IHS值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組大鼠髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)情況(IHS值)比較Table 1 The PLC-γ1 expression(IHS value) in the posterior condylar cartilage between two groups

Figure 2 The morphological characteristics of condyle cartilage of rats (×400)

3 討 論

本研究HE染色結(jié)果顯示，髁突軟骨后部增厚明顯，由后向前髁突軟骨厚度逐漸變薄，提示髁突后部發(fā)生了較為明顯的骨改建，與前人實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[9-10]，因此選擇髁突軟骨后部進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色研究。

目前研究發(fā)現(xiàn)，PLC-γ1上游信號(hào)因子之一是VEGF及其受體VEGFR-2，早期研究發(fā)現(xiàn)VEGF是一種內(nèi)皮系統(tǒng)組織細(xì)胞的特異性因子，在動(dòng)物胚胎期血管發(fā)生過(guò)程中起著重要作用[11]?，F(xiàn)研究證實(shí)，非內(nèi)皮系統(tǒng)組織中也廣泛存在VEGF，VEGF與骨形成蛋白具有相似的功能，在軟骨成骨過(guò)程中協(xié)調(diào)著軟骨細(xì)胞增殖與骨形成之間的關(guān)系，在軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)換為骨細(xì)胞的過(guò)程中起著重要作用[12-14]。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在小鼠軟骨骨化的早期和晚期都發(fā)揮了重要作用，將小鼠VEGF基因敲除后其軟骨骨化過(guò)程受阻[15]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，VEGF及其受體VEGFR-2在髁突軟骨的骨改建過(guò)程中同樣發(fā)揮著不可或缺的作，有學(xué)者在大鼠髁突和顳骨關(guān)節(jié)窩中檢測(cè)到了VEGF，提出骨取代軟骨的標(biāo)志是軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF刺激新生血管形成，VEGF是連接血管和新骨形成的重要因子[16]。將生長(zhǎng)發(fā)育期SD大鼠采用功能矯治器導(dǎo)致下頜前伸后可刺激髁突軟骨發(fā)生適應(yīng)性改建，增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖活性，使其分化加速，VEGFR-2作為 VEGF 的特異性受體，介導(dǎo)了 VEGF生物學(xué)作用，參與了大鼠髁突軟骨的骨改建[17]。髁突軟骨細(xì)胞分泌VEGF有的通過(guò)自分泌方式，有的通過(guò)旁分泌方式，VEGF與其受體VEGFR-2作用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大層內(nèi)的血管化進(jìn)程，促進(jìn)軟骨骨化[18]。

哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在PLC-γ1，其一般位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)PLC-γ1通常維持在一定水平，而當(dāng)機(jī)體組織接收到外界刺激，例如細(xì)胞內(nèi)的大分子調(diào)控因子VEGF將外界刺激信號(hào)進(jìn)一步傳遞到細(xì)胞內(nèi)，接收到上一級(jí)信號(hào)刺激后，PLC-γ1的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)被激活，從而促進(jìn)組織細(xì)胞的分裂、增殖、分化等過(guò)程[14，19]。其具體過(guò)程如下：VEGF接收到外界信號(hào)刺激后，進(jìn)一步作用于細(xì)胞膜上的受體VEGFR-2，將細(xì)胞膜上受體蛋白的酪氨酸殘基激活，而這些受體又具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)PLC-γ1 與活化的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合后，受體本身的蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)發(fā)生自動(dòng)磷酸化后被激活，與胞內(nèi)PLC-γ1的SH2、SH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合并將其酪氨酸殘基激活，從而進(jìn)一步激活細(xì)胞內(nèi)一系列下游信號(hào)傳導(dǎo)通路。PLC-γ1的SH2與PTK結(jié)合后，作用于細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇4，5二磷酸并將其分解為二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)。DAG可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，IP3可引起細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放鈣離子，最終完成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的傳遞，引發(fā)細(xì)胞的增殖與分化[20]。VEGFR2是VEGF的主要功能受體,已有5個(gè)主要的磷酸化位點(diǎn)被證實(shí)，其中Tyr-1175、Tyr-801是PLC-γ1結(jié)合位點(diǎn)[21]。PLC-γ1-Tyr783的磷酸化激活PLC-γ1的活性，在調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管新生方面發(fā)揮了重要作用。胚胎期動(dòng)脈血管的發(fā)生即通過(guò)VEGFR2的Tyr-1175被激活后,進(jìn)一步激活胞內(nèi)的PLC-γ1來(lái)完成[22]。Husain等[23]研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR-2能夠通過(guò)PLC-γ1 信號(hào)的活化促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖效應(yīng)。

VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1信號(hào)鏈在血管生成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用,那么該信號(hào)鏈?zhǔn)欠裨谙骂M髁突前伸后軟骨骨化過(guò)程中同樣發(fā)揮作用？本研究結(jié)果顯示，第7、14、21、28 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨后部PLC-γ1表達(dá)的IHS值高于對(duì)照組，與前人關(guān)于VEGF及其受體VEGFR-2在大鼠功能性下頜前伸后髁突軟骨后部的表達(dá)變化規(guī)律具有一致性[24]。已經(jīng)證實(shí)VEGF在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨后部軟骨成骨過(guò)程中發(fā)揮了一定作用[25]，因此，推測(cè)VEGF-VEGFR-2-PLC-γ1這條信號(hào)通路在功能性下頜前伸大鼠髁突軟骨骨化過(guò)程中發(fā)揮了一定作用。

下頜功能前伸后髁突軟骨改建是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，PLC-γ1和VEGF在軟骨骨化過(guò)程中具體機(jī)制尚未明確，本研究?jī)H通過(guò)PLC-γ1的表達(dá)情況與前人關(guān)于VEGF及其受體VEGFR-2的表達(dá)具有一致性來(lái)推測(cè)該信號(hào)鏈在大鼠下頜功能前伸后髁突軟骨骨化過(guò)程中發(fā)揮作用尚不全面，這是本研究的不足之處，如引入PLC-γ1及VEGF的抑制劑從對(duì)立面進(jìn)一步證實(shí)則可信度更高。但可以肯定的是PLC-γ1是眾多細(xì)胞因子信號(hào)途徑的交匯，在組織反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，PLC-γ1可能參與了下頜功能性前伸大鼠髁突軟骨骨化的過(guò)程，對(duì)其水平進(jìn)行檢測(cè)對(duì)髁突部軟骨骨化的研究具有重要參考價(jià)值，相信其在口腔領(lǐng)域也將會(huì)為功能矯治骨骼改建靶點(diǎn)選擇提供參考。