楊志華，畢穎斐，毛靜遠，王賢良，李金哲，任曉宇

冠心病是指由于冠狀動脈粥樣硬化使管腔狹窄或閉塞導(dǎo)致心肌缺血、缺氧或壞死而引發(fā)的心臟病[1-2]。中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹”“心悸”“水腫”“喘證”等范疇[3]。隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，血瘀、痰濁等冠心病標實證素較前明顯增多，且常郁而化熱，痰熱瘀結(jié)已成為冠心病較常見的中醫(yī)證候表現(xiàn)[4]。清痰化瘀方為天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院毛靜遠教授臨床治療冠心病痰熱瘀結(jié)證的經(jīng)驗方劑，主要由半夏、瓜蔞(皮)、茯苓、陳皮、丹參、黃連、枳殼組成，方中陳皮、半夏、茯苓是二陳湯的核心藥物組成，具有燥濕化痰、理氣和中的功效，黃連、半夏、瓜蔞(皮)是小陷胸湯的藥物組成，具有清熱化痰、寬胸散結(jié)的功效，丹參活血化瘀、通經(jīng)止痛，枳殼理氣寬中，全方共奏清熱化痰、活血化瘀、理氣寬胸的功效。臨床實踐提示，清痰化瘀方可有效緩解冠心病痰熱瘀結(jié)證病人臨床癥狀，提高運動耐量和生活質(zhì)量。由于中藥及其復(fù)方具有多成分特點，這種復(fù)雜性使其作用機制難以明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)整合在一起，分析藥物在此網(wǎng)絡(luò)中與特定節(jié)點或模塊的相互作用關(guān)系，從而理解藥物和機體相互作用的科學(xué)[5]，從整體觀角度認識藥物與疾病間的相互作用[6]。本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對清痰化瘀方治療冠心病的化學(xué)成分、作用靶點、生物學(xué)過程、信號通路等方面進行分析，旨在揭示清痰化瘀方治療冠心病痰熱瘀結(jié)證可能的作用機制，為其臨床合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 清痰化瘀方化學(xué)成分的篩選 運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，篩選清痰化瘀方中陳皮、半夏、茯苓、黃連、丹參、瓜蔞(皮)、枳殼的活性成分。藥物在人體內(nèi)要經(jīng)過吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過程才能到達靶器官發(fā)揮其治療作用，基于口服生物利用度(orlbioavailability，OB)、類藥性(drug-likeness，DL)是篩選藥物的關(guān)鍵參數(shù)，以ADME參數(shù)中的OB≥30%、DL≥0.18[7-8]為限制條件進行初步篩選，匯總結(jié)果，去除重復(fù)、刪除沒有相關(guān)信息的化學(xué)成分，即為清痰化瘀方治療冠心病相關(guān)的化學(xué)成分。

1.2 清痰化瘀方潛在靶點的收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)已篩選的清痰化瘀方中藥的化學(xué)成分，通過TCMSP平臺檢索與化學(xué)成分相關(guān)的潛在靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫將預(yù)測出的靶點名轉(zhuǎn)換為基因名。將篩選的潛在靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 冠心病相關(guān)靶點的篩選 以coronary heart disease為關(guān)鍵詞，利用DrugBank、治療靶點數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)、DisGeNET、美國國家生物技術(shù)信息中心(Center for Biotechnology Information，NCBI)數(shù)據(jù)庫，篩選與冠心病相關(guān)的基因，刪除重復(fù)基因，共收集到1 104個與冠心病相關(guān)的靶點基因。

1.4 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將冠心病靶點與清痰化瘀方靶點進行Venn分析，篩選出二者共同靶點，將共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，將物種設(shè)置為“Homo sapiens”，為確保數(shù)據(jù)的可靠性，蛋白最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”(>0.9)，對蛋白相互作用進行篩選，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，分析PPI網(wǎng)絡(luò)并對網(wǎng)絡(luò)進行渲染。在網(wǎng)絡(luò)中，1個節(jié)點的度(degree)表示在PPI網(wǎng)絡(luò)中與該節(jié)點直接相互作用的節(jié)點的數(shù)目，節(jié)點越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強。設(shè)置節(jié)點大小和顏色深度反映度的大小，節(jié)點越大、顏色越深，說明節(jié)點的自由度越大。

1.5 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 采用DAVID(Version 6.8，http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)在線分析數(shù)據(jù)工具對共同靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。以錯誤風(fēng)險率(FDR)<0.01及P<0.01為篩選條件，取P值最小的前20個生物學(xué)過程；以P<0.01為篩選條件，篩選富集最顯著的前20條信號通路，并將通路上的靶點基因以及涉及的化合物、中藥導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，闡明清痰化瘀方治療冠心病的作用機制。其中的節(jié)點代表化合物、靶點或疾病，邊代表這些節(jié)點之間的相互關(guān)系，即某個化學(xué)成分與靶點或靶點與疾病之間的聯(lián)系。

2 結(jié) 果

2.1 清痰化瘀方的化學(xué)成分 本研究從TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選清痰化瘀方的化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為篩選條件，篩選結(jié)果：陳皮5個、半夏13個、茯苓15個、黃連14個、丹參65個、瓜蔞(皮)11個、枳殼5個，刪除重復(fù)成分4個，剔除沒有相關(guān)信息成分23個，共有101個化學(xué)成分。部分化學(xué)成分信息詳見表1。

表1 清痰化瘀方部分化學(xué)成分基本信息

(續(xù)表)

2.2 清痰化瘀方“中藥-化學(xué)成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過 Cytoscape 軟件中 network analyzer 插件進行拓撲分析，得到清痰化瘀方“中藥-化學(xué)成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖1)。圖中共包括361節(jié)點，其中，7個中藥節(jié)點，101個化學(xué)成分節(jié)點，253個靶點節(jié)點和1 501條邊。紅色三角形代表7味中藥的節(jié)點，綠色矩形代表靶點節(jié)點，櫻桃紅、淡紅色、綠色、黃色、藍色、深藍色、淺綠色菱形分別代表枳殼、陳皮、茯苓、半夏、丹參、瓜蔞(皮)、黃連的化學(xué)成分節(jié)點，MOL004328和MOL005828是陳皮、枳殼兩味中藥的化學(xué)成分，MOL000358、MOL002776分別是半夏和枳殼、半夏和丹參共有的化學(xué)成分。分子MOL000098(quercetin)有 141個潛在靶標，其次是MOL007154(tanshinone ⅡA)有39個靶標，MOL000358(beta-sitosterol)有37個靶標、MOL000006(luteolin)有 36個潛在靶標，MOL002174(baicalein)有34個。這些度值較高的藥物分子有可能在清痰化瘀方的藥理功能中發(fā)揮相對重要的作用。在253個靶點節(jié)點中有142個靶標至少與2個化合物連接，網(wǎng)絡(luò)中絕大多數(shù)候選化合物與 2 個蛋白質(zhì)靶點連接，也說明清痰化瘀方中含有的候選化合物分子可能作用于整個生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，體現(xiàn)了清痰化瘀方多成分與多靶點之間共同作用的機制，同時也符合中藥復(fù)方的特點。

圖1 清痰化瘀方中藥-化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1 104個冠心病靶點與254個藥物靶點輸入Venny 2.1軟件得到112個共同靶點。將112個共同靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，去除無相互作用的靶點，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.5.1軟件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析。該網(wǎng)絡(luò)由96個節(jié)點、300條邊組成，平均節(jié)點長度為6.25，其中，節(jié)點的大小由自由度決定，自由度越大，節(jié)點越大，節(jié)點顏色越深。詳見圖2。

圖2 共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 “中藥-化學(xué)成分-共同靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 運用 Cytoscape 軟件構(gòu)建清痰化瘀方中藥-化學(xué)成分-共同靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)，圖中共216個節(jié)點，其中7味中藥(紅色節(jié)點)，96種化學(xué)成分(藍色節(jié)點)，112個共同靶點(綠色節(jié)點)，1種疾病(黃色節(jié)點)。結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、柚皮素(naringenin)、川陳皮素(nobiletin)、巴馬汀(palmatine)、4-甲亞基丹參新酮(4-methylene miltirone)、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮(2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione)、黃連素(berberine)等化學(xué)成分度值排名靠前，在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵化學(xué)成分。

圖3 “中藥-化合成分-共同靶點- 疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析 GO功能富集分析包括分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)和細胞組分(cellular component，CC)3 個分支。對共同靶點進行GO功能富集分析，得到640個GO功能富集條目，以FDR<0.01及P<0.01為篩選條件，前20個生物學(xué)過程見表2。結(jié)果顯示，有13個條目與生物過程有關(guān)，主要涉及細胞老化、低氧反應(yīng)、藥物反應(yīng)、NO生物合成過程正調(diào)控、炎癥反應(yīng)、正調(diào)控平滑肌細胞增殖，正調(diào)控RNA 聚合酶Ⅱ啟動子等過程；有3個條目與細胞組成有關(guān)，涉及細胞內(nèi)外間隙等過程；有4個條目與分子功能有關(guān)，涉及酶結(jié)合、類固醇激素受體活性、細胞因子活性等過程。

表2 GO功能富集分析結(jié)果

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID對112個共同靶點進行KEGG通路富集分析，共得到108條信號通路，以P<0.01為篩選條件，選取清痰化瘀方治療冠心病相關(guān)的前20條信號通路，見表3。并通過ImageGP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)對富集分析結(jié)果進行可視化處理(見圖 4)。其中，X 軸表示富集因子(rich factor，即背景基因集中這個通路所有基因的數(shù)量)，Y 軸代表通路，氣泡大小代表目標基因在這個通路的基因數(shù)量，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。

表3 20條信號通路富集分析結(jié)果

(續(xù)表)

圖4 KEGG 通路富集結(jié)果氣泡圖

3 討 論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出清痰化瘀方中藥的101個有效成分，同時通過構(gòu)建“中藥-化學(xué)成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，分析了中藥、化合物、作用靶點之間的相互關(guān)系，揭示了清痰化瘀方多成分-多靶點治療機制。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等化學(xué)成分在整個網(wǎng)絡(luò)中度值較高，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參具有保護心肌、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、改善微循環(huán)、抗凝血及抗血小板聚集、調(diào)血脂、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等作用[9]，丹參酮ⅡA和木犀草素是丹參的活性成分，丹參酮ⅡA具有保護心肌細胞、抗凝血、抗血小板聚集、降低高脂血癥大鼠肝臟中的脂質(zhì)沉積的作用[10-12]；木犀草素可以減輕心肌缺血再灌注導(dǎo)致的心肌細胞凋亡損害，其機制可能與減少促炎細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α 及白介素-6(IL-6)的產(chǎn)生，進而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[13]。黃連具有抗炎、降血糖、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗心律失常等藥理活性[14]，黃連的活性成分槲皮素可通過抗炎、抗氧化、降低血清三酰甘油和總膽固醇以及抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化等作用，降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險[15]。半夏和枳殼活性成分中均含有β-谷甾醇，研究表明β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、降血脂、抑制血小板聚集、抗動脈硬化、防治冠心病和高血壓等作用[16-17]。柚皮素、川陳皮素均是陳皮、枳殼的化學(xué)成分，柚皮素具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、清除自由基的作用[18-20]，對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護作用，其保護心肌的機制可能與減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)[21]，川陳皮素具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓形成等藥理作用[22]。

GO富集分析結(jié)果顯示，清痰化瘀方治療冠心病主要涉及細胞增殖與凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、激素分泌、NO合成、物質(zhì)代謝等生物學(xué)過程；有酶、蛋白、細胞因子、受體、轉(zhuǎn)錄因子、激素等多種物質(zhì)參與，提示清痰化瘀方治療冠心病是一個十分復(fù)雜的生物學(xué)過程。通過對112個靶蛋白進行PPI分析發(fā)現(xiàn)，TNF、蛋白激酶1(AKT1)、IL-6、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)3、MAPK8、血管內(nèi)皮生長因子 A(VEGFA)、原癌基因蛋白(FOS)等靶蛋白度值較大，說明這些靶蛋白在此網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可能是清痰化瘀方治療冠心病的關(guān)鍵靶蛋白。例如，TNF-α和IL-6等細胞因子參與機體炎癥反應(yīng)，并且作為冠心病的獨立危險因素，其表達水平升高可增加心血管疾病的患病風(fēng)險[23]，血液中TNF-α、IL-6的含量增高可以增加冠心病或者非致死性心肌梗死病人的死亡率[24]。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，清痰化瘀方治療冠心病的較多靶點被富集在TNF、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)、Toll樣受體、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)等信號通路上。HIF-1信號通路與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切[25]，當(dāng)機體缺血缺氧時，HIF-1不僅可以促進糖酵解，加強無氧代謝途徑，使細胞在缺氧條件下獲得足夠的能量，維持細胞生存[26]，而且能夠促進炎癥中新血管生成[27]；此外，HIF-1可與缺血、缺氧下高表達的 P53 結(jié)合，增加其穩(wěn)定性，而 P53 是缺氧條件下誘導(dǎo)炎癥細胞凋亡的重要參與因子，加快炎癥細胞凋亡的發(fā)生[28]；HIF-1 還可誘導(dǎo)促紅細胞生成素(EPO)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等促紅細胞生成因子的表達，加快氧的運輸，提高氧的利用能力[29]，心肌細胞缺血缺氧時，可以通過調(diào)控HIF-1信號通路，促進血管新生，增加心肌血供，對保護心肌具有重要意義[30]?，F(xiàn)有的研究結(jié)果證明，cGMP-PKG信號通路對于調(diào)控心血管系統(tǒng)的正常功能起著重要的作用，在調(diào)節(jié)血壓、抑制動脈粥樣硬化和抗再狹窄、抗血管損傷、調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的收縮和舒張、抑制心肌細胞肥大等方面發(fā)揮重要作用[31-32]。PKG通路激活能夠通過引起血管舒張、抑制內(nèi)皮細胞通透性以及對心肌細胞的負性肌力作用而保護心血管系統(tǒng)[33]。PI3K-Akt 信號通路在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt 信號通路可通過調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞增殖、遷移及細胞凋亡等影響動脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展[34]。韓軍等[35]發(fā)現(xiàn)金絲桃苷激活可通過激活PI3K-Akt 信號通路，改善心室肌收縮與舒張功能，清除氧自由基，減少心肌酶釋放，減輕炎癥反應(yīng)，上調(diào) Bcl-2 蛋白表達，下調(diào) Bax 蛋白表達，抑制細胞凋亡對大鼠心肌缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護作用。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對清痰化瘀方治療冠心病的化學(xué)成分、關(guān)鍵靶點、生物過程及通路進行了初步探討。結(jié)果顯示，清痰化瘀方中的槲皮素、丹參酮ⅡA、β-谷甾醇、木犀草素、柚皮素、川陳皮素、巴馬汀、4-甲亞基丹參新酮、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、黃連素等有效化學(xué)成分，可能通過作用于TNF、AKT1、IL-6、MAPK3、MAPK8、VEGFA、FOS等關(guān)鍵靶點，調(diào)節(jié)PI3K-Akt、cGMP-PKG、TNF、HIF-1、Toll樣受體等多條信號通路治療冠心病。但本研究僅基于系統(tǒng)數(shù)據(jù)進行初步分析，存在一定的局限性，清痰化瘀方治療冠心病的具體作用機制仍需要開展實驗進一步驗證。