杭 婧

（淮安市食品藥品檢驗所，江蘇 223300）

鹽酸美他環(huán)素是一種半合成四環(huán)素，具有免疫抑制、抗炎、抗菌譜廣等特點，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有明顯的抗菌作用，對立克次體、支原體、衣原體也存在抑制作用。鹽酸美他環(huán)素片在臨床上通常用于治療斑疹傷寒、痤瘡、輸卵管炎、支原體屬衣原體屬導致的感染等。本品為口服非無菌化學藥品固體制劑，處方不含臟器提取物，目前還沒有關于本品《中國藥典》2020年版微生物限度適用性檢查的報道。

本試驗采用常規(guī)法、稀釋法、中和法、薄膜過濾法進行試驗。旨在消除供試品對試驗菌的抑菌作用，真實反映本品的微生物污染狀況。參考《中國藥典》2020年版四部通則1105、1106、1107，進行了微生物限度檢查方法適用性試驗。

1 儀器與材料

1.1 儀器 潔凈工作臺（BCM-1600A，蘇州安泰空氣技術有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（101-3，上海躍進有限公司）；SPX-350型生化培養(yǎng)箱；集菌儀（杭州泰林HTY-2000B）；高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3781L-PC型，松下）；生物安全柜（BSC-1304IIA2，蘇州安泰空氣技術有限公司）；電子天平（PL6001，梅特勒公司）。

1.2 供試品 鹽酸美他環(huán)素片（批號201002，規(guī)格：0.1 g，江蘇正大清江制藥有限公司）。

1.3 驗證用菌 枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單孢菌［CMCC（B）10104］、黑曲霉［CMCC（F）98003］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基與試劑 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批號1090522），來源于北京三藥科技開發(fā)公司。沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號191012）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號1096825）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號1103195）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號1083181）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（批號1091022），來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。以上培養(yǎng)基規(guī)格均為250 g。無菌氯化鈉注射液（250 ml∶2.25 g，批號200514 2C），江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責任公司。氯化鎂（AR，上海振興試劑廠，批號20210114）。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌氯化鈉注射液制成每1ml含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液備用；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20～25℃培養(yǎng)24～48 h，用無菌氯化鈉注射液制成每1 ml含菌數(shù)小于100 cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7 d，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的無菌氯化鈉注射液制成每1 ml含孢子數(shù)小于100 cfu的孢子懸液備用。

2.2 供試液制備 取供試品10 g，加稀釋液pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml（若加中和劑則含10 g氯化鎂），勻漿儀混勻，作為1∶10供試液。取1∶10供試液10 ml，加上述稀釋液90 ml，混勻，作為1∶100供試液。取1∶10供試液2 ml，加上述稀釋液98 ml（若加中和劑則每100 ml含10 g氯化鎂），混勻，作為1∶500供試液。

2.3 微生物計數(shù)方法適用性試驗

2.3.1 供試液與菌液先混合

2.3.1.1 試驗組 取“2.2”項下制備的供試液10 ml，加入“2.1”項下制備的試驗菌液0.1 ml，混勻，使每1 ml供試液中含菌量不大于100 cfu。每皿加1 ml含菌供試液，傾注相應培養(yǎng)基，分別按規(guī)定培養(yǎng)。

2.3.1.2 菌液組 取稀釋液（pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液）代替供試液，按“2.3.1.1”項下方法操作，加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.3.1.3 供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液（pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液）代替菌液同“2.3.1.1”項下方法操作。

2.3.1.4 試驗結果 根據(jù)《中國藥典》2020年版，各試驗菌回收比值在0.5～2，符合方法適用性試驗要求。若試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)的50%，可采用增加稀釋液或培養(yǎng)基體積；加入適宜的中和劑或滅活劑；薄膜過濾法等方法去除或滅活產品的抗菌活性［1］，結果見表1。由表1可知，需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的菌數(shù)回收率均低于0.5，故加入中和劑以及稀釋法再次進行試驗，結果見表2-3。由表2得出，中和劑對照組菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)比值在0.5～2范圍內。表2和表3得出，5種菌的試驗組菌數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值低于0.5，說明不適合用上述方法進行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。考慮到本品的強抑菌作用，考慮用加中和劑薄膜過濾法進行驗證，結果見表4-5。中和劑對照組菌落數(shù)與菌液。

表1 計數(shù)方法適用性試驗結果（平皿法，1∶10供試液）

表2 計數(shù)方法適用性試驗結果（加中和劑平皿法，1∶10供試液）

表3 計數(shù)方法適用性試驗結果（稀釋法，1∶100供試液）

表4 計數(shù)方法適用性試驗結果（加中和劑薄膜過濾法，1∶10供試液）

表5 計數(shù)方法適用性試驗結果（加中和劑薄膜過濾法，1∶500供試液）

對照組的菌落數(shù)比值在0.5～2范圍內。表4可以看出白色念珠菌、黑曲霉的試驗組菌數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值在0.5～2范圍內，說明可用該法進行該供試品的霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的試驗組菌數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值均小于0.5，說明不適合用上述方法進行需氧菌總數(shù)計數(shù)。

2.3.2 供試液與菌液后混合

2.3.2.1 試驗組 取“2.2”項下制備好的1∶500供試液10 ml，靜置10 min，取上清液1 ml至250 ml稀釋液中，混勻。經兩膜濾器過濾后，用無菌氯化鈉注射液沖洗濾膜，兩膜共沖洗1 750 ml，在最后一次沖洗時加入試驗菌（小于100 cfu）抽干后，取出濾膜，菌面朝上貼入規(guī)定培養(yǎng)基平板上，分別按規(guī)定培養(yǎng)。

2.3.2.2 菌液組 稀釋液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。

2.3.2.3 供試品對照組 取“2.2”項下供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

2.3.2.4 結果 采用后加菌薄膜過濾法試驗，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的試驗組菌數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內，說明可用該法進行該供試品的需氧菌總數(shù)計數(shù)。結果見表6。

表6 需氧菌總數(shù)計數(shù)方法適用性試驗結果（后加菌薄膜過濾法，1∶500供試液）

2.4 控制菌檢查檢查方法適用性試驗 本品為口服非無菌化學藥品固體制劑，處方不含臟器提取物，故其控制菌檢查大腸埃希菌。

2.4.1 常規(guī)法和稀釋法

2.4.1.1 試驗組 取“2.2”項下的1∶10供試液10 ml，分別接種至100 ml（常規(guī)法）和500 ml（稀釋法）胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入1 ml（＜100 cfu）的大腸埃希菌。

2.4.1.2 陽性對照組 用無菌氯化鈉注射液代替供試液，其余同試驗組操作。

2.4.1.3 陰性對照組 用無菌氯化鈉注射液代替供試液，不加菌液，其余同試驗組操作。

2.4.1.4 供試品組 不加菌液，其余同試驗組操作。

2.4.1.5 選擇和分離培養(yǎng) 按《中國藥典》2020年版規(guī)定，取上述培養(yǎng)物1 ml分別接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72 h。

2.4.1.6 試驗結果 試驗組未檢出大腸埃希菌，表明上述方法不適用于大腸埃希菌檢查。見表7-8。

表7 大腸埃希菌方法適用性試驗結果（常規(guī)法）

2.4.2 薄膜過濾法

2.4.2.1 試驗組 取“2.2”項下的1∶10供試液，靜置10 min后，取上清液10 ml，用240 ml無菌氯化鈉注射液稀釋，混勻。經濾器過濾后，用無菌氯化鈉注射液沖洗濾膜，共沖洗750 ml，在最后一次沖洗時加入試驗菌（小于100 cfu）抽干后，取出濾膜，至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，按規(guī)定培養(yǎng)。

2.4.2.2 陽性對照組 用無菌氯化鈉注射液代替供試液，其余同試驗組操作。

2.4.2.3 陰性對照組 用無菌氯化鈉注射液代替供試液，不加菌液，其余同試驗組操作。

2.4.2.4 供試品組 不加菌液，其余同試驗組操作。

2.4.2.5 選擇和分離培養(yǎng) 按《中國藥典》2020年版規(guī)定，取上述培養(yǎng)物1 ml分別接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，42～44℃培養(yǎng)24～48 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，30～35℃培養(yǎng)18～72 h。

2.4.2.6 結果 試驗組檢出大腸埃希菌，表明上述方法可用于大腸埃希菌檢查。結果見表9。

表8 大腸埃希菌方法適用性試驗結果（稀釋法）

表9 大腸埃希菌方法適用性試驗結果（薄膜過濾法）

2.5 結果 經驗證，取1∶500供試液10 ml經靜置10 min后，取上清液1 ml至250 ml無菌氯化鈉注射液（沖洗液）中，經薄膜過濾法（兩膜濾器，每膜每次沖洗約80 ml，總沖洗量1 750 ml）處理，用于需氧菌總數(shù)計數(shù)；取1∶10供試液1 ml至250 ml沖洗液中，經薄膜過濾法（每次沖洗約75 ml，總沖洗量750 ml）處理，用于霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；取1∶10供試液經靜置10 min后，取上清液10 ml至240 ml沖洗液中，經薄膜過濾法（每次沖洗約75 ml，總沖洗量750 ml）處理，用于大腸埃希菌檢查，依法檢查（《中國藥典》2020年版四部通則1105、1106、1107）。

3 討論

2005 年版《中國藥典》首次規(guī)定，在建立藥品的微生物限度檢查法或無菌檢查法時，應先進行檢查方法的驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的檢查。驗證的意義在于保證檢驗結果準確、可靠及檢驗方法的完整性。其在保證檢驗方法的科學性和檢驗結果的準確性方面大大縮短了《中國藥典》與國外藥典的差距，是促使我國藥品此類檢查方法更加合理、科學和嚴謹?shù)闹匾緩剑?］?！吨袊幍洹?015年版微生物限度檢查微生物計數(shù)法（通則1105）方法適用性試驗中規(guī)定，應首先在供試液環(huán)節(jié)加入驗證菌株進行回收率測定［3］。由需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌計數(shù)適用性試驗結果可知鹽酸美他環(huán)素片對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉很強的抑制作用，故本試驗在平皿法、稀釋法、中和劑法之后，回收比值仍小于0.5。

按照2020年版《中國藥典》，如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋 或薄膜過濾處理后再加入試驗菌懸液進行方法適用性試驗。本試驗中在選擇適用性方法時從平皿法到稀釋法逐步試驗，測定需氧菌總數(shù)時采用1∶10供試品平皿法，增加稀釋液體積，加中和劑以及前加菌薄膜過濾法均無法消除供試品的抑菌性。最后通過后加菌薄膜過濾法直接徹底消除抑菌作用，回收比值在0.5～2。因此藥品微生物試驗應綜合考慮試驗方法以及加菌方式對試驗結果的影響，通過方法學適用性試驗，嚴格按照實驗操作規(guī)程進行試驗。