馮子芳， 楊瑞賓

(興義市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州 興義 562400)

結(jié)腸癌是一種全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高，發(fā)展極為迅速的惡性腫瘤之一。根據(jù)2000至2014年全球癌癥生存趨勢監(jiān)測計劃(CONCORD計劃)第三階段的調(diào)查數(shù)據(jù)[1]顯示，我國結(jié)腸癌發(fā)病率高居所有癌癥第3位，其5年生存率僅有 57.6%，遠(yuǎn)低于韓國、日本等亞洲其他國家。機(jī)體免疫系統(tǒng)在調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答，改變腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞因機(jī)體免疫功能低下而逃逸免疫監(jiān)控，最終表現(xiàn)出“免疫逃逸”的現(xiàn)象，這也是導(dǎo)致放化療后腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[2]。因此，增強機(jī)體免疫功能將有助于提高機(jī)體的抗腫瘤效果。隨著中醫(yī)藥臨床價值逐漸被世界認(rèn)可，傳統(tǒng)中藥因其顯著的藥理作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中備受關(guān)注。白術(shù)多糖是中藥白術(shù)的主要藥效成分之一，其具有抗氧化、保肝、抗炎、抗過敏、抗血栓、抗病毒、抗癌等多種藥理作用[3]。并且有研究顯示[4-5]，白術(shù)多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用，能提高機(jī)體免疫功能。然而，白術(shù)多糖是否通過調(diào)控機(jī)體免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用，目前鮮有報道。本研究采用結(jié)腸癌CT26細(xì)胞荷瘤小鼠模型，探討白術(shù)多糖干預(yù)對荷瘤小鼠腫瘤生長、免疫調(diào)節(jié)的影響及其可能機(jī)制，以期為白術(shù)多糖的臨床應(yīng)用提供更多的藥效研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與動物 小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)級雌性BALB/c小鼠30 只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2014-0011。在溫度22～24 ℃，相對濕度40%～70%，通風(fēng)良好，晝夜12 h光照條件下自由飼養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 白術(shù)多糖(純度≥98%，批號CY181005)及香菇多糖(純度≥98%，批號CY181203)均購自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司。小鼠腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α；批號190201)ELISA試劑盒、小鼠白介素-2(Interleukin-2，IL-2；批號190111)ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；別藻藍(lán)蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的CD3e抗體(批號561042)、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)標(biāo)記的CD4抗體(批號553653)、PE-CD8a抗體(批號553032)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的CD11b抗體(批號557396)和PE標(biāo)記的淋巴細(xì)胞抗原6復(fù)合物G位點(Ly-6G/Gr-1)抗體(批號561104)均購自美國BD公司；兔抗小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor，TLR4)單克隆抗體(批號14358)、兔抗人髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)單克隆抗體(批號4283)、兔抗人核因子-κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB p65)單克隆抗體(批號8242)和兔抗人GAPDH單克隆抗體(批號5174)購自美國Cell Signaling Technology公司；小鼠抗人TNF受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)單克隆抗體(批號sc-8409)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 方法

1.3.1 建模及分組 取對數(shù)生長期的小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×107/mL，接種于小鼠右前肢背部皮下，每只小鼠接種0.2 mL細(xì)胞懸液。待接種7 d左右，接種處可見平均直徑約5 mm腫瘤時視為造模成功[6]。選擇腫瘤體積無差異的荷瘤小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只，即模型組，給予等量生理鹽水灌胃處理；陽性對照香菇多糖組，150 mg/kg香菇多糖灌胃處理；白術(shù)多糖低劑量組，125 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；白術(shù)多糖中劑量組，250 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；白術(shù)多糖高劑量組，500 mg/kg白術(shù)多糖灌胃處理；另選取6只正常的BALB/c小鼠作為空白對照組，給予等量生理鹽水灌胃處理，每天1次，給藥周期為21 d。給藥期間，每4 d用游標(biāo)卡尺測量一次腫瘤長徑(a)和短徑(b)，按照V=ab2/2計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。

1.3.2 免疫器官指數(shù)及抑瘤率測定 末次給藥24 h后，斷頸處死小鼠，稱定體質(zhì)量，在無菌條件下剝離腫瘤、脾、胸腺等組織，稱定質(zhì)量，按照以下公式計算抑瘤率、胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)[7]：抑瘤率=[(模型組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型組平均瘤重]×100%、胸腺(脾)指數(shù)=胸腺(脾)質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量。

1.3.3 ELISA法檢測小鼠血清TNF-α及IL-2表達(dá) 采用摘眼球取血法收集各組小鼠外周血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，按照試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度，并按照說明書提供的公式計算血清TNF-α及IL-2水平。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群 取各組小鼠外周血，加入紅細(xì)胞裂解液，600 r/min離心5 min，棄上清。PBS重懸細(xì)胞，加入APC-CD3e、PE-CD4和PE-CD8a抗體，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。以CD3e+CD4+雙陽性細(xì)胞亞群百分比表示CD4+T細(xì)胞所占比例，以CD3e+CD8+雙陽性細(xì)胞亞群表示CD8+T細(xì)胞所占比例，并計算CD4+/CD8+比值。

1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測腫瘤組織髓來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid derived suppressor cells，MDSCs)水平 取各組小鼠新鮮腫瘤組織，制備成單細(xì)胞懸液，加入FITC-CD11b和PE-Gr-1抗體，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2次后重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。以Gr-1+CD11b+雙陽性細(xì)胞亞群百分比代表MDSC細(xì)胞所占比例。

1.3.6 Western blot檢測脾臟組織中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取約20 mg各組小鼠脾臟組織，加入組織裂解液充分裂解，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，PBS洗滌3次，分別加入TLR4抗體(1∶1 000)、MyD88抗體(1∶1 000)、NF-κB p65抗體(1∶1 000)、TRAF6抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。第2天，PBS洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG(1∶10 000)室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，避光孵育1 min，顯影。相對蛋白表達(dá)量以目的蛋白光密度值/內(nèi)參蛋白光密度值表示。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠腫瘤生長的影響 各組小鼠腫瘤生長曲線如圖1A所示，與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠腫瘤生長速度相對緩慢；從接種第20天起，白術(shù)多糖高劑量組和香菇多糖組小鼠腫瘤體積均小于模型組(P<0.05)；從接種第24天起，白術(shù)多糖中劑量組小鼠腫瘤體積均小于模型組(P<0.05)。CT26細(xì)胞接種28 d后，各組小鼠腫瘤如圖1B所示，結(jié)果如表1所示，可知白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠瘤質(zhì)量均小于模型組(P<0.05)。

表1 各組CT26荷瘤小鼠瘤重及抑瘤率比較

2.2 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均增加(P<0.05)，但白術(shù)多糖低劑量組無顯著性差異(P>0.05)，如表2所示。

注：A為各組CT26荷瘤小鼠腫瘤生長曲線，B為接種CT26細(xì)胞28 d后各組荷瘤小鼠腫瘤實物圖。相同時間點與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 白術(shù)多糖抑制CT26荷瘤小鼠腫瘤生長

2.3 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群及腫瘤組織中MDSCs細(xì)胞水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞比例以及CD4+T/CD8+T比值降低(P<0.05)，而CD8+T細(xì)胞比例升高(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠外周血CD4+T細(xì)胞比例以及CD4+T/CD8+T比值升高(P<0.05)，而CD8+T細(xì)胞比例以及腫瘤組織中MDSCs細(xì)胞比例降低(P<0.05)。同時，白術(shù)多糖低劑量組與模型組比較以上指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05)。如表3所示。

2.4 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2水平的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-2水平降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組以及香菇多糖組小鼠血清中TNF-α、IL-2水平增加(P<0.05)，而白術(shù)多糖低劑量組兩者水平無顯著性差異(P>0.05)。如表4所示。

表2 各組CT26荷瘤小鼠脾臟和胸腺指數(shù)比較

表3 各組CT26荷瘤小鼠外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞及腫瘤組織中MDSCs水平比較

表4 各組CT26荷瘤小鼠血清TNF-α及IL-2水平比較

2.5 白術(shù)多糖對CT26荷瘤小鼠脾臟中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖2所示，與空白對照組比較，模型組小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組比較，白術(shù)多糖中、高劑量組荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)，而香菇多糖組、白術(shù)多糖低劑量組上述蛋白表達(dá)無明顯變化(P>0.05)。

3 討論

注：與空白對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 各組CT26荷瘤小鼠脾臟中TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)

白術(shù)多糖是從白術(shù)根莖中提取的多糖類物質(zhì)，其主要包含甘露聚糖、果聚糖等成分，其最為顯著的藥理作用是促免疫作用。例如，Ji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)多糖可以通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥因子TNF-α、IFN-γ以及NO的釋放，進(jìn)而活化RAW264.7巨噬細(xì)胞。Kim等[5]研究顯示，白術(shù)多糖作為一種佐劑，可以顯著增加IgG滴度，促進(jìn)抗原特異性淋巴細(xì)胞增殖，從而增強胸膜肺炎放線桿菌感染小鼠機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。隨著人們對白術(shù)多糖藥理研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)白術(shù)多糖還具有抗腫瘤的作用，例如，F(xiàn)eng等[9]研究報道稱，白術(shù)多糖通過引起細(xì)胞周期S期阻滯，誘導(dǎo)肝癌H22細(xì)胞凋亡，并抑制H22細(xì)胞移植瘤的生長。然而，白術(shù)多糖是否通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用目前還鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，白術(shù)多糖可以抑制CT26荷瘤小鼠腫瘤的生長，其在250、500 mg/kg劑量下的抑瘤率分別達(dá)到40.85%和65.11%。同時，白術(shù)多糖可以通過活化TLR4信號通路，促進(jìn)炎癥因子TNF-α及IL-2釋放，提高CD4+/CD8+比值，降低腫瘤組織中MDSCs水平。因此，白術(shù)多糖有可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能發(fā)揮抗腫瘤作用。

眾所周知，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中常伴隨著機(jī)體免疫功能的降低，甚至逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控。胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，然而腫瘤的發(fā)生可引起機(jī)體免疫器官的萎縮[10]，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的高低在一定程度上可以反應(yīng)機(jī)體免疫功能的強弱。本研究結(jié)果表明，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可以提高CT26荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，說明白術(shù)多糖可以增強荷瘤小鼠的免疫功能。在機(jī)體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)中，T淋巴細(xì)胞發(fā)揮重要作用，其中輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞(CD3+CD4+)主要分泌TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，刺激或增強細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答；而抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CD3+CD8+)主要通過分泌抑制因子抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞活化，起負(fù)調(diào)控作用。臨床研究數(shù)據(jù)顯示[11]，腫瘤患者常出現(xiàn)CD3+CD4+細(xì)胞亞群明顯減少，CD3+CD8+細(xì)胞亞群明顯升高，以及CD4+/CD8+比值明顯降低的現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可提高荷瘤小鼠血液中CD3+CD4+細(xì)胞亞群比例，降低CD3+CD8+細(xì)胞亞群比例，從而提高CD4+/CD8+比值。與此同時，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)還可促進(jìn)荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)一步激活機(jī)體免疫功能。此外，MDSC是一種重要的免疫抑制細(xì)胞，腫瘤組織中存在大量的MDSCs，其可以通過多種途徑抑制T細(xì)胞的活化，并對腫瘤細(xì)胞適應(yīng)性生長起到促進(jìn)作用[12]。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖干預(yù)可以降低荷瘤小鼠腫瘤組織中MDSC細(xì)胞水平。說明，白術(shù)多糖可能通過降低MDSCs水平，減少其對T細(xì)胞的影響，并通過分泌TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子刺激T細(xì)胞的活化，以達(dá)到提高機(jī)體免疫力的功效，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類天然免疫模式識別受體，常表達(dá)于免疫細(xì)胞表面，能夠激活機(jī)體天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[13]。TLRs信號通路主要由MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑組成，而TRAF-6是這兩條途徑的交叉點，繼而激活NF-κB途徑，誘導(dǎo)促炎因子的釋放，最終促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖及活化。本研究結(jié)果顯示，中、高劑量白術(shù)多糖可上調(diào)荷瘤小鼠脾臟組織中TLR4、MyD88、TRAF-6以及NF-κB p65等蛋白表達(dá)，表明白術(shù)多糖能夠激活TLR4信號通路。提示，白術(shù)多糖發(fā)揮促免疫作用有可能是通過激活TLR4信號通路實現(xiàn)的。錢隆等[14]研究結(jié)果也顯示，白術(shù)多糖能夠激活TLR4信號通路，發(fā)揮增強免疫的作用。此外，作為陽性對照香菇多糖對TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)無顯著影響，可能是由于香菇多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用的機(jī)制不是通過該信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究證實白術(shù)多糖具有調(diào)節(jié)結(jié)腸癌CT26荷瘤小鼠免疫功能及抑制荷瘤小鼠腫瘤生長的作用，其作用機(jī)制可能與TLR4信號通路激活有關(guān)。然而，由于白術(shù)多糖具有多種藥理作用，在本研究中其是否還通過其他途徑發(fā)揮抗腫瘤作用？還需進(jìn)一步深入研究。