艾尼·沙塔爾， 張建慶， 丁 偉， 劉思吟， 蘇鵬程， 波拉提·沙依提*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院乳腺甲狀腺科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院放療科，新疆 烏魯木齊 830000)

甲狀腺癌是人類最主要的內(nèi)分泌腫瘤，其發(fā)病率逐年上升[1]，且因甲狀腺瘤細(xì)胞對放射線具有抗性，從而導(dǎo)致患者放療效果欠佳[2-3]，如何提高甲狀腺瘤細(xì)胞對射線的敏感性成為了甲狀腺癌研究的主要方向。白藜蘆醇(resveratrol)[4]是從天然植物提取物中發(fā)現(xiàn)的一種具有廣泛藥理性質(zhì)的天然抗毒素，具有抗氧化效能[5]，且能夠阻止低密度脂蛋白的氧化，因而具有潛在的預(yù)防心血管疾病、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)以及預(yù)防癌癥的作用。已經(jīng)有研究證實(shí)白藜蘆醇在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要功能[6]，如白藜蘆醇可抑制癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞周期進(jìn)程、干擾信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抑制癌基因表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等。近些年來，有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可提高多種腫瘤細(xì)胞對放射治療的敏感性，如在人咽鱗癌細(xì)胞[7]和食管腺癌細(xì)胞[8]中具有放射增敏作用，但關(guān)于白藜蘆醇對甲狀腺癌細(xì)胞的增敏性研究仍較少。本研究擬檢測白藜蘆醇對甲狀腺癌SW579細(xì)胞增殖、凋亡、放射增敏性的影響，并深入探討其分子機(jī)制，為相關(guān)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器 白藜蘆醇(純度≥98%)購于美國Sigma公司。胎牛血清購于美國Gibco公司；L-15培養(yǎng)基購于武漢博士德生物工程有限公司；MTT、DMSO購于美國Ameserco公司；青霉素-鏈霉素溶液購于美國賽默飛公司；SDS-PAGE試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn)中所用的一抗和羊抗鼠二抗均購于美國Santa Cruz公司。常用試劑(甲醇、吉姆薩等)均購于廣州豪凱生物科技有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶購于美國康寧公司；23EX醫(yī)用直線加速器購于美國Varian公司；ELX800酶標(biāo)儀購于美國Bio-Tek公司；FACS CantoⅡ流式細(xì)胞儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 放射處理?xiàng)l件 室溫照射；源皮距(SSD)100 cm；照射視野面積15 cm×15 cm；劑量率3 Gy/min；板底面覆蓋1.5 cm厚的等效組織填充物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) SW579細(xì)胞購于上海紀(jì)寧生物科技有限公司，將SW579細(xì)胞培養(yǎng)于L-15完全培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素)，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞分組 將對數(shù)生長的SW579細(xì)胞，用胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，設(shè)為對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組。加藥組用25 μmol/L白藜蘆醇處理，對照組細(xì)胞不做任何處理；照射組用2 Gy X射線照射細(xì)胞；聯(lián)合組用25 μmol/L白藜蘆醇和2 Gy X射線照射處理。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)檢測白藜蘆醇對SW579細(xì)胞的毒性 取對數(shù)生長期SW579細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理，用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，制備細(xì)胞懸液，密度為3×104/mL，以每孔100 μL接種至96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為0、12.5、25、50、100 μmol/L白藜蘆醇，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT溶液10 μL，然后每孔加入Formanzan溶解液，37 ℃振蕩15 min，使結(jié)晶紫溶解，在570 nm波長處酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組細(xì)胞按上述方法檢測細(xì)胞存活率。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測白藜蘆醇對SW579細(xì)胞輻射增敏作用 取對數(shù)生長期的SW579細(xì)胞，胰蛋白酶消化處理，用含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，制備細(xì)胞懸液，密度為3×104/mL，以每孔100 μL接種至96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，將各孔用濃度為0、25 μmol/L白藜蘆醇處理細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，24 h后給予0、1、2、4 Gy X射線照射，繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，更換新鮮培養(yǎng)基，置于上述培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，每隔3 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，直至生成肉眼可見的細(xì)胞克隆為止。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，2 mL甲醇室溫固定10 min，棄去甲醇，等量吉姆薩染色液染色 30 min，在低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)>50個(gè)細(xì)胞的集落?？寺⌒纬陕?planting efficiency，PE)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%，存活分?jǐn)?shù)(survial fraction，SF)=照射劑量組的集落數(shù)/(該組細(xì)胞接種數(shù)×未照射組PE)。采用單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線，SF=1-[(1-e-D/D0)×N]，Dq=D0×lnN。其中D為照射劑量(Gy)，D0為平均致死劑量，Dq為準(zhǔn)閾劑量(代表存活的寬肩度)，N為外推值。放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)=單純照射組D0/聯(lián)合照射組D0。

1.7 蛋白免疫印記實(shí)驗(yàn) 將對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組細(xì)胞離心，取細(xì)胞沉淀置于冰上，加適量細(xì)胞裂解液(1 mL RIPA裂解液加10 μL蛋白酶抑制劑，現(xiàn)配現(xiàn)用)冰上裂解30 min，4 ℃離心取上清，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定，取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE的凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉于4 ℃條件下過夜封閉，PBST洗滌3次，加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，PBST洗滌3次，37 ℃孵育二抗1 h，PBST洗滌3次，將配置好的ECL顯色液加至膜上，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中顯影，PVDF膜再利用，用一抗、二抗去除液將PVDF膜上的抗體去除，重新封閉、孵育新的一抗、二抗，檢測其他蛋白。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，并制備單細(xì)胞懸液，加入3 mL預(yù)冷的70%乙醇固定，用緩沖液洗滌后加入核糖核酸酶A(RNase A)于37 ℃水浴30 min，加入碘化啶(PI)，避光30 min，上機(jī)檢測，重復(fù)3次。用流式細(xì)胞儀和DNA細(xì)胞周期分析軟件對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測分析。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μL結(jié)合緩沖液混勻。先加入10 μL Annexin V-FITC，再加入5 μL PI，混勻后避光孵育10 min。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對SW579細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測 用不同濃度(0、12.5、25、50、100 μmol/L)的白藜蘆醇處理SW579細(xì)胞，于24、48、72 h時(shí)用MTT法檢測SW579細(xì)胞的存活率，結(jié)果見表1。由此可知，25 μmol/L白藜蘆醇在72 h內(nèi)是對SW549細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的最大濃度，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用該濃度白藜蘆醇作為輻射增敏實(shí)驗(yàn)的最佳藥物濃度。

表1 不同濃度白藜蘆醇作用不同時(shí)間對SW579細(xì)胞存活率的影響

2.2 白藜蘆醇對SW579細(xì)胞的輻射增敏作用 用不同劑量(0、1、2、4 Gy)的X射線照射及25 μmol/L白藜蘆醇處理SW579細(xì)胞，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)研究白藜蘆醇對SW549細(xì)胞的輻射增敏作用，見圖1，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇處理SW579細(xì)胞后，2、4 Gy劑量射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)降低(P<0.01)；與對照組比較，加藥組細(xì)胞用0、1、2、4 Gy X射線照射后，2、4 Gy劑量射線照射后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低(P<0.01)，表明白藜蘆醇對SW579細(xì)胞有明顯的輻射增敏作用,見表2。最終，選擇2 Gy劑量射線進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：與0 μmol/L白藜蘆醇組比較，**P<0.01。圖1 白藜蘆醇對SW579細(xì)胞克隆形成的影響

表2 不同劑量射線干預(yù)后各組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF)值

2.3 白藜蘆醇對X射線照射后SW579細(xì)胞增殖的影響 將細(xì)胞分為對照組、加藥組(25 μmol/L白藜蘆醇)、照射組(2 Gy X射線)、聯(lián)合組(25 μmol/L白藜蘆醇和2 Gy X射線)，分別于24、48、72 h用MTT法檢測SW579細(xì)胞的活力，見圖2A。結(jié)果顯示，與對照組比較，照射組和加藥組的細(xì)胞活力均降低(P<0.05)；與照射組比較，聯(lián)合組SW579細(xì)胞的存活率降低(P<0.01)。Western blot檢測48 h后對照組、加藥組、照射組和聯(lián)合組細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)，分別為1.00±0.05、0.46±0.03、0.51±0.04、0.13±0.01，與對照組比較，照射組和加藥組細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；與照射組比較，聯(lián)合組SW579細(xì)胞中Ki67蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，見圖2B。

注：與對照組比較，**P<0.01；與照射組比較，##P<0.01。圖2 白藜蘆醇對SW579細(xì)胞增殖的影響

2.4 白藜蘆醇對X射線照射后SW579細(xì)胞周期的影響 由表3可見，與對照組比較，加藥組和照射組的SW579細(xì)胞周期發(fā)生變化，G0/G1期細(xì)胞減少(P<0.01)，S期細(xì)胞增加(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞減少(P<0.01)；與照射組比較，聯(lián)合組細(xì)胞周期阻滯更顯著，G0/G1期細(xì)胞減少(P<0.01)，S期細(xì)胞增加(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞減少(P<0.01)，表明白藜蘆醇和X射線聯(lián)合作用抑制細(xì)胞周期行進(jìn)的作用更為顯著。

2.5 白藜蘆醇對X射線照射后SW579細(xì)胞凋亡的影響 由圖3可見，流式細(xì)胞術(shù)檢測對照組、加藥組、照射組和聯(lián)合組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率分別為(8.56±0.72)%、(14.24±1.06)%、(15.37±1.34)%、(20.14±1.85)%，與對照組比較，加藥組和照射組細(xì)胞凋亡率均增加(P<0.01)；與照射組比較，聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05)。

表3 白藜蘆醇聯(lián)合射線對細(xì)胞周期的影響

注：與對照組比較，**P<0.01；與照射組比較，##P<0.01。圖3 白藜蘆醇聯(lián)合X射線對SW579細(xì)胞凋亡的影響

2.6 白藜蘆醇對X射線照射后SW579細(xì)胞中Survivin、ATM和NBS1表達(dá)的影響 Western blot檢測48 h對照組、加藥組、照射組、聯(lián)合組細(xì)胞中Survivin、ATM和NBS1表達(dá)情況，見圖4。Survivin蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.02、0.67±0.04、0.54±0.02、0.39±0.02，ATM蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.05、0.63±0.03、0.55±0.05、0.41±0.04，NBS1蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.03、0.58±0.05、0.56±0.03、0.27±0.02。與對照組比較，加藥組和照射組中Survivin、ATM、NBS1蛋白表達(dá)均降低(P<0.01)；與照射組比較，聯(lián)合組中Survivin、ATM、NBS1蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，表明白藜蘆醇聯(lián)合X射線抑制SW579細(xì)胞Survivin、ATM和NBS1的表達(dá)。

注：對照組比較，**P<0.01；與照射組比較，##P<0.01。圖4 SW579細(xì)胞中Survivin、ATM和NBS1表達(dá)

3 討論

甲狀腺癌是一種重要的內(nèi)分泌腫瘤，單純使用放射治療方法不僅不能有效殺死癌細(xì)胞，還會(huì)對正常的組織和細(xì)胞造成一定危害。輻射增敏劑[9]可通過增加甲狀腺癌細(xì)胞的輻射敏感性進(jìn)而提高放射治療療效，從而達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的。但當(dāng)前的輻射增敏劑不僅造價(jià)高，且對正常組織細(xì)胞的毒副作用也較大，因此，研發(fā)和找到藥效強(qiáng)、造價(jià)低的輻射增敏劑對提高甲狀腺癌的放射治療療效具有重要意義。

白藜蘆醇是從葡萄等植物中提取一種小分子化合物，具有防癌和抗癌的作用，可增加化學(xué)治療藥物的敏感性以及可增加輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[10-12]，因此白藜蘆醇可能具有輻射增敏作用，臨床研究表明正常使用富含白藜蘆醇的食物不僅能發(fā)揮其生理活性，而且具有一定安全性[13]，這也為白藜蘆醇成為潛在的輻射增敏劑提供了科學(xué)依據(jù)。本研究檢測了不同劑量的白藜蘆醇對甲狀腺癌細(xì)胞SW579的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在72 h內(nèi)，白藜蘆醇對甲狀腺癌細(xì)胞SW579的無毒性最高劑量為25 μmol/L。為了觀察白藜蘆醇對射線照射后甲狀腺癌細(xì)胞SW579增殖的影響，本研究首先用25 μmol/L白藜蘆醇及不同劑量的X射線照射處理SW579細(xì)胞，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，白藜蘆醇可降低照射組細(xì)胞的克隆形成率和細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。接著，采用25 μmol/L白藜蘆醇和2 Gy劑量射線處理SW579細(xì)胞，將其分為對照組、照射組、加藥組和聯(lián)合組，檢測細(xì)胞增殖狀況，MTT結(jié)果顯示，與放射組比較，白藜蘆醇和X射線聯(lián)合使用可降低細(xì)胞存活率。Ki67[14-15]是與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的蛋白，Western blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單純放射組比較，Ki67在聯(lián)合組SW579細(xì)胞中的表達(dá)降低，進(jìn)一步表明藜蘆醇可通過參與調(diào)控與細(xì)胞增殖相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)而抑制SW579細(xì)胞的增殖，白藜蘆醇對SW579細(xì)胞能夠發(fā)揮明顯的輻射增敏作用，具有成為輻射增敏劑的潛力。

放射增敏機(jī)制主要是通過影響細(xì)胞周期、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和增加射線對腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性損傷等生物學(xué)過程發(fā)揮作用的。細(xì)胞在接受射線照射后其細(xì)胞周期會(huì)發(fā)生改變，還可影響細(xì)胞凋亡[16]。為了研究白藜蘆醇的放射增敏機(jī)制，用流式細(xì)胞術(shù)分析SW579細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，照射組和加藥組SW579細(xì)胞周期發(fā)生變化，G0/G1期比例降低，S期比例增加，且細(xì)胞凋亡率增加；而與照射組比較，聯(lián)合組中差異更為顯著，表明白藜蘆醇可加強(qiáng)X射線對SW579細(xì)胞周期的調(diào)控作用，以及可增加X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明白藜蘆醇可通過改變細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加放射敏感性。Survivin[17]是一種作用極強(qiáng)的凋亡抑制蛋白，可抑制細(xì)胞凋亡，參與細(xì)胞周期調(diào)控[18]，NBS1[19]是DNA損傷修復(fù)蛋白，ATM[20]是與細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)密切相關(guān)的蛋白，可作為細(xì)胞“生存因子”降低細(xì)胞對放射線和類射線細(xì)胞毒藥物的敏感性。為了進(jìn)一步探討白藜蘆醇促進(jìn)細(xì)胞凋亡和改變細(xì)胞周期的機(jī)制。在后續(xù)研究中，通過Western blot檢測Survivin、NBS1和ATM的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，放射組和加藥組細(xì)胞中Survivin、NBS1和ATM表達(dá)均降低；與照射組比較，聯(lián)合組中蛋白表達(dá)差異更為顯著，白藜蘆醇加強(qiáng)了X射線對Survivin、NBS1和ATM表達(dá)的抑制作用。

綜上所述，本研究初步探討了白藜蘆醇作為甲狀腺瘤放射增敏劑的潛能，并進(jìn)一步分析了白藜蘆醇放射增敏的分子機(jī)制，白藜蘆醇可增加SW579細(xì)胞對射線的敏感性，為臨床上開發(fā)白藜蘆醇作為甲狀腺瘤放射增敏劑提供了科學(xué)依據(jù)。