韋玥吟， 蔣怡萱， 黃盼玲， 吳超權(quán)， 李宇清， 夏 星*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 南寧 530000)

功能失調(diào)性子宮出血癥(dysfunctional uterine bleeding, DUB)在中醫(yī)屬于“崩漏”的范疇，即經(jīng)血非時(shí)暴下或淋漓不止[1]，其基本病理生理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)下丘腦-垂體-卵巢軸神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控異常，子宮肌層局部調(diào)節(jié)功能異?；?yàn)槁殉病⒆訉m內(nèi)膜不規(guī)則脫落[2]。壯藥婦血康以滇桂艾納香單獨(dú)成藥，有活血化瘀、止血調(diào)經(jīng)功效[3]，其來源于菊科植物假東風(fēng)草Blumeariparia(Bl.) DC 的干燥全草，《中華藥?！酚小笆諗恐寡?，具有活血不傷血、止血不留瘀之功，可用于各種出血癥”的描述[4]，主要用于通火路龍路，用于發(fā)旺(風(fēng)濕骨痛)、林得叮相(跌打腫痛)、兵淋勒(崩漏)、月經(jīng)不調(diào)、狠尹(瘡)等癥[5]，臨床廣泛用于經(jīng)血過多與產(chǎn)后惡露不止的治療，但是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制都尚未明晰。

研究表明，婦血康對(duì)產(chǎn)后出血的治療作用主要通過影響凝血、促進(jìn)子宮收縮2條途徑產(chǎn)生[6]，介導(dǎo)其治療作用的藥效物質(zhì)可能主要在于其水溶性提取部位，尤其是有機(jī)酸和多糖[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以反映化合物與靶點(diǎn)之間復(fù)雜的相互作用，預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制[8]。本研究從婦血康中有機(jī)酸的化學(xué)物質(zhì)出發(fā)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段尋找到其作用于功能失調(diào)性子宮出血的靶點(diǎn)，分析可能的作用通路，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步驗(yàn)證，為該壯藥臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 婦血康有機(jī)酸部位化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及作用靶點(diǎn)篩選 利用中國(guó)知網(wǎng)、維普、Pubmed等數(shù)據(jù)庫(kù)，以婦血康的唯一原料滇桂艾納香、假東風(fēng)草或其拉丁文名稱Blumeariparia(Bl.) DC.為檢索詞，檢索從滇桂艾納香中分離的主要有機(jī)酸類化合物；利用數(shù)據(jù)庫(kù)PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索滇桂艾納香有機(jī)酸化合物的2D、3D化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用數(shù)據(jù)庫(kù)PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)，通過導(dǎo)入化合物3D化學(xué)結(jié)構(gòu)獲取可能的藥效團(tuán)模型靶點(diǎn)，此外利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)搜索化合物的作用靶點(diǎn)，匯總PharmMapper及TCMSP的預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建婦血康有機(jī)酸化學(xué)成分作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.1.2 DUB疾病-靶點(diǎn)的篩選 通過OMIM(https://omim.org/)、Gene Cards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)，以 “功能失調(diào)性子宮出血(dysfunctional uterine bleeding)、子宮出血(uterine bleeding)、子宮收縮(uterine contraction)、平滑肌收縮(smooth muscle contraction)”等為關(guān)鍵詞，建立疾病靶點(diǎn)集。

1.1.3 婦血康有機(jī)酸部位靶點(diǎn)-DUB疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步了解婦血康有機(jī)酸成分與DUB疾病的直接作用關(guān)系，取“1.1.1”項(xiàng)下的藥物靶點(diǎn)及“1.1.2”項(xiàng)下疾病靶點(diǎn)交集，得到藥物-疾病交集靶點(diǎn)。將婦血康有機(jī)酸物質(zhì)靶點(diǎn)與藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。將藥物-DUB交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String(version 11.0)數(shù)據(jù)庫(kù)，分析和預(yù)測(cè)婦血康有機(jī)酸部位-DUB的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，獲得蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network, PPI)。將從String數(shù)據(jù)庫(kù)中所獲取得到的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的tsv文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，尋找靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系，找出PPI網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)。

1.1.4 GO富集分析與KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Clue GO，對(duì)化合物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的所有基因進(jìn)行GO分析，并通過DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG功能注釋富集分析。通過GO分析找到靶蛋白可能發(fā)生的主要生物進(jìn)程，通過KEGG分析找到靶蛋白可能參與的信號(hào)通路。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證 課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，婦血康有顯著促進(jìn)DUB大鼠子宮收縮的效果。由于婦血康中絕大多數(shù)有機(jī)酸存在于其70%乙醇總提取物的乙酸乙酯萃取部位中[9]，且離體子宮收縮實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物對(duì)子宮收縮作用的經(jīng)典方法[10]，因此，本研究進(jìn)一步純化乙酸乙酯萃取部位，采用正常大鼠離體子宮，初步驗(yàn)證婦血康的作用途徑。

1.2.1 動(dòng)物 9周齡性成熟未孕雌性SD大鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量220～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(桂)2014-0002。

1.2.2 試劑與藥物 婦血康有機(jī)酸成分段的制備：將滇桂艾納香生藥材粉碎后用70%乙醇浸提，濃縮后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)總提取物進(jìn)行萃取，乙酸乙酯萃取部位用D101大孔樹脂吸附，依次用30%、50%、75%、95%乙醇洗脫，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，取乙酸乙酯萃取部位的50%乙醇洗脫物用于驗(yàn)證婦血康的作用靶點(diǎn)。經(jīng)初步分析，該提取物中含有咖啡酸、原兒茶酸、丁香酸、沒食子酸、香草酸等有機(jī)酸成分。

戊酸雌二醇片(批號(hào)362A，拜爾醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司)；硫酸阿托品(批號(hào)PS060，紹興民生醫(yī)藥股份有限公司)；乙二胺四乙酸二鈉(批號(hào)20180614，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；水合氯醛、鹽酸利托君(批號(hào)B1826028、F1503113，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。其他試劑均為分析純。

1.2.3 儀器 BSA224S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；CD-UPT-Ⅱ超純水制造系統(tǒng)(成都越純科技有限公司)；BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HW-400E恒溫平滑肌槽(成都泰盟軟件有限公司)。

1.2.4 含藥血清制備 取性成熟未受孕的雌性SD大鼠10只，隨機(jī)分為空白血清組、婦血康提取物組(40 mg/kg)，婦血康提取物的用藥劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。婦血康提取物組大鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)7 d；空白血清組大鼠每天灌胃等量純水，末次灌胃給藥后腹主動(dòng)脈取血，靜置后離心，取上層血清，即得空白血清、婦血康提取物含藥血清。

1.2.5 婦血康對(duì)大鼠離體子宮收縮的影響 實(shí)驗(yàn)前3 d大鼠每天灌胃給予戊酸雌二醇(0.4 mg/只)，末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取子宮置于盛有洛氏液的培養(yǎng)皿中，固定于恒溫浴槽中，一端連接至張力換能器，設(shè)置溫度為37 ℃。待子宮收縮平穩(wěn)后，向浴槽中分別加入空白血清、婦血康含藥血清，血清體積不斷疊加，檢測(cè)兩者對(duì)離體子宮平滑肌收縮的影響，以最大收縮力作為藥物作用的最大效應(yīng)(Emax)。此外，分別利用M受體抑制劑硫酸阿托品(0.2 mol/L)、鈣離子螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA·2Na，0.075 3 mol/L)、β2受體抑制劑鹽酸利托君(0.002×10-3mol/L)作為工具藥，與婦血康含藥血清共同孵育，觀察子宮收縮Emax的變化，以驗(yàn)證婦血康含藥血清的作用途徑。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1.1 成分篩選 通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)，找到滇桂艾納香(婦血康)有機(jī)酸組成主要為原兒茶酸、咖啡酸、丁香酸、沒食子酸、香草酸、呋喃甲酸、水楊酸、2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸、綠原酸，共檢索到2 225個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，其中原兒茶酸有241個(gè)，咖啡酸有248個(gè)，丁香酸有246個(gè)，沒食子酸有252個(gè)，香草酸有238個(gè)，呋喃甲酸有176個(gè)，水楊酸有226個(gè)，2,4-二甲基-6-甲基苯甲酸有299個(gè)，綠原酸有299個(gè)，去除重合靶點(diǎn)后，總靶點(diǎn)數(shù)為321個(gè)。

2.1.2 DUB疾病-靶點(diǎn)篩選 OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)搜索得到624個(gè)DUB疾病相關(guān)靶點(diǎn)，Gene Cards搜索得到9 610個(gè)DUB疾病相關(guān)靶點(diǎn)，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)進(jìn)行合并、去重，選取相關(guān)系數(shù)大于等于10者，整合得到DUB疾病相關(guān)靶點(diǎn)共1 673個(gè)。

2.1.3 有機(jī)酸靶點(diǎn)-DUB疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 藥物-疾病交集靶點(diǎn)共79個(gè)，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。其中，節(jié)點(diǎn)(node)代表婦血康有機(jī)酸部位-DUB疾病存在交集的潛在作用靶點(diǎn)，邊(edge)代表婦血康與有機(jī)酸、婦血康有機(jī)酸成分與潛在靶點(diǎn)、DUB與潛在靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

圖1 有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將婦血康有機(jī)酸作用靶點(diǎn)-DUB疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String(version11.0)數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2，其中節(jié)點(diǎn)(node)代表蛋白，邊(edge)為節(jié)點(diǎn)之間的連線，表示相連的兩個(gè)蛋白之間具有相互作用。將從String數(shù)據(jù)庫(kù)中所獲取得到的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的tsv文本導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，利用插件Network Analyzer對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，結(jié)果見圖3。PPI網(wǎng)絡(luò)中共包含45個(gè)節(jié)點(diǎn)、220條邊，ALB、AKT1、MAPK1、SRC、CASP3、EGFR、HSP90AA1、MAPK8、MMP9、ESR1、MAP2K1、RHOA、PIK3R1等靶點(diǎn)可能在婦血康有機(jī)酸部位-功能失調(diào)性子宮出血網(wǎng)絡(luò)中具有重要意義。

圖2 藥物-疾病蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 拓?fù)鋵傩苑治鰣D

2.1.4 GO功能分析、KEGG通路分析 利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Clue GO，對(duì)中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的所有基因進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果顯示，P<0.05的基因共108個(gè)，主要涉及類固醇激素受體活性、絲氨酸肽酶活性、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、絲氨酸水解酶活性、有機(jī)酸結(jié)合、跨膜受體蛋白激酶活性、G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-3-激酶結(jié)合等，見表1。通過DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG通路分析，共富集到P<0.05的婦血康有機(jī)酸部位作用靶點(diǎn)相關(guān)通路42條，包括VEGF信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路等，見表2。

表1 GO功能分析結(jié)果

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 工具藥對(duì)離體子宮收縮的影響 與空白平衡狀態(tài)下的離體子宮比較，阿托品、EDTA·2Na及利托君均能顯著抑制離體子宮的收縮，3種藥物的最大效應(yīng)均低于空白平衡狀態(tài)(P<0.01)，見表3。

2.2.2 工具藥對(duì)婦血康含藥血清調(diào)節(jié)子宮收縮作用的影響 與空白血清組比較，婦血康含藥血清組離體子宮收縮力增強(qiáng)(P<0.01)；與婦血康含藥血清組比較，添加阿托品后子宮收縮下降至最大效應(yīng)的0.67(P<0.01)，但子宮仍呈現(xiàn)弱的興奮狀態(tài)，與空白血清組比較，阿托品未出現(xiàn)抑制子宮收縮的作用(P>0.05)；與婦血康含藥血清組比較，婦血康含藥血清與EDTA·2Na共同孵育下的離體子宮收縮也被抑制(P<0.05)，而婦血康含藥血清與利托君共同孵育時(shí)，離體子宮收縮能力略有下降，但仍能達(dá)到最大效應(yīng)的0.72，利托君松弛子宮的效應(yīng)并不顯著(P>0.05)。見表4。

表2 KEGG通路富集分析結(jié)果

表3 工具藥對(duì)子宮收縮的影響

表4 工具藥對(duì)婦血康含藥血清調(diào)節(jié)子宮收縮作用的影響

3 討論

功能失調(diào)性子宮出血是由于下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic-pituitary-ovarian axis, HPO)功能失常，機(jī)體排卵功能受到抑制，從而使子宮內(nèi)膜喪失對(duì)雌孕激素的周期性調(diào)節(jié)作用而導(dǎo)致的疾病[11]，與年齡、HPO軸、子宮血管結(jié)構(gòu)功能異常[12]、纖維蛋白溶酶激活物質(zhì)釋放增多有關(guān)[13]。目前以壯藥滇桂艾納香為單味成藥的婦血康顆粒，已廣泛用于DUB的治療上，但其作用機(jī)制的研究較少。

現(xiàn)有研究表明，婦血康顆粒有效成分滇桂艾納香的有機(jī)酸和多糖類物質(zhì)，可能是其發(fā)揮凝血和促子宮收縮作用的主要藥效物質(zhì)[7]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)婦血康有機(jī)酸對(duì)DUB的作用靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)它們可能是其治療DUB的藥效物質(zhì)，這與Huang等[7]報(bào)道是一致的。另外，有機(jī)酸類分布的婦血康活性段含藥血清在體外有促進(jìn)大鼠離體子宮收縮的效果。

調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮狀態(tài)可能是婦血康治療DUB的的主要作用途徑[6]。本研究通過GO富集分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，婦血康有機(jī)酸成分在DUB疾病中對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體有直接的作用，并且該受體下游的cAMP信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路顯著度排名均靠前。β腎上腺素受體正是一種G蛋白偶聯(lián)受體[14]，子宮平滑肌的β腎上腺素受體興奮程度決定著子宮的收縮能力。本研究利用作用于不同受體的工具藥，在離體子宮實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了婦血康通過β腎上腺素受體對(duì)子宮收縮的影響，發(fā)現(xiàn)分別將M受體阻斷劑阿托品、Ca2+螯合劑EDTA·2Na與婦血康活性段聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)其促進(jìn)子宮收縮影響并不顯著，但當(dāng)婦血康與β2受體激動(dòng)劑利托君共同使用時(shí)，利托君松弛子宮平滑肌的作用受到顯著抑制，提示婦血康可能是通過阻斷β腎上腺素受體從而影響子宮收縮，這驗(yàn)證了在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究部分的G蛋白偶聯(lián)受體參與婦血康有機(jī)酸成分治療DUB的預(yù)測(cè)。此外，那襲雪等[15]研究了滇桂艾納香的同科屬近緣種植物白花九里明治療產(chǎn)后出血的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其中的咖啡酸等有機(jī)酸物質(zhì)能顯著興奮小鼠離體子宮平滑肌，并認(rèn)為其可能是通過影響非選擇性β受體發(fā)揮作用，這與本研究結(jié)果相吻合。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G蛋白偶聯(lián)受體、cAMP信號(hào)通路及PI3K-Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵位點(diǎn)包括PRKACA、GPCR、RhoA、ROCK、Raf1、PI3K、Rac1、Akt等。抑制肌球蛋白輕鏈(myosinlight chain, MLC)活性可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞發(fā)生鈣增敏效應(yīng)，使得閾值水平[Ca2+]i能引起平滑肌超閾值水平收縮。小分子G蛋白R(shí)as同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member A, RhoA)在平滑肌收縮過程中的靶標(biāo)是Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)，受外界刺激時(shí)，游離于胞漿中的RhoA活化并向細(xì)胞膜聚集與膜結(jié)合，將信號(hào)傳給ROCK，使分子中854位絲氨酸和697位蘇氨酸磷酸化而激活，再將其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)磷酸化使之失活，失活的MLCP不能使MLC脫磷酸化，胞漿內(nèi)MLC磷酸化水平上升，導(dǎo)致平滑肌收縮[16]。激活β2受體可興奮G蛋白偶聯(lián)受體，使腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)活化，催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)生成環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)[17-19]，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的cAMP到達(dá)一定水平時(shí)，可激活蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)[20]，PKA發(fā)生磷酸化抑制RhoA水平，導(dǎo)致ROCK表達(dá)降低，ROCK磷酸化水平降低使蛋白磷酸酶1調(diào)節(jié)亞基12A(protein phosphatase 1 regulatory subunit 12A, MYPT1)水平生高，磷酸化MYPT1抑制MLC水平，使肌球蛋白ATP酶活性降低，最終導(dǎo)致平滑肌舒張，這一調(diào)控通路上的多個(gè)位點(diǎn)均顯示與婦血康有機(jī)酸成分高度相關(guān)。

綜上所述，婦血康作為在壯醫(yī)藥理論指導(dǎo)下開發(fā)的壯藥，能通過調(diào)節(jié)子宮平滑肌的收縮能力對(duì)功能失調(diào)性子宮出血發(fā)揮治療作用，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果提示，它可能是通過影響大鼠子宮平滑肌中的β2受體或(及)其所在通路從而發(fā)揮促進(jìn)子宮收縮的作用，具體還有待進(jìn)一步研究。