金東成,趙 野,吳蓉慧,宋丹丹,趙天奇,朱明姬*

(1.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院第一臨床醫(yī)院,吉林 長春130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 皮膚科,吉林 長春130033)

光熱效應(yīng)選擇性作用于皮脂腺，抑制皮脂腺增生、抑制皮脂分泌，作為一種新的潛在的治療痤瘡的方法備受關(guān)注。Au-Ag@PDA納米顆粒吸收近紅外后具有良好的光熱轉(zhuǎn)換效率。本課題組首次發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞膜載Au-Ag@PDA納米顆粒，在808 nm激光照射后顯著縮小金黃地鼠皮脂腺斑大小并減少皮脂分泌[1]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法，分析光熱作用于皮脂腺后蛋白質(zhì)譜的變化，進(jìn)一步探討機(jī)制。為新型光敏劑治療痤瘡提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本為課題組前期工作時(shí)制作的石蠟標(biāo)本[1],標(biāo)本均為金黃地鼠背部皮脂腺斑，金黃地鼠購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。本文重點(diǎn)分析兩組石蠟標(biāo)本：(A)空白組、(C)接菌并用 Au-Ag @ PDA NPs(40 μg/ml)處理后808 nm激光(0.5 W/cm2)照射3 min組。激光照射后第20天的皮脂腺斑組織石蠟標(biāo)本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蛋白提取 樣品脫蠟處理后，轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，分別加入4被體積裂解緩沖液(1%SDS,1%蛋白酶抑制劑)，超聲裂解。4℃12 000 g 離心10 min，去除細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管。

1.2.2胰酶酶解 各樣品蛋白取等量進(jìn)行酶解，用裂解液將體積調(diào)整至一致。加入4被倍體積的預(yù)冷丙酮，渦旋混勻后加入4倍體積的預(yù)冷丙酮，-20℃沉淀2 h。4 500 g，離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的丙酮洗滌沉淀2次。曬干沉淀后加入終濃度200 mM的TEAB，超聲打散沉淀，以1∶50的比例(蛋白酶：蛋白，m/m)加入胰蛋白酶，酶解過夜。加入二硫蘇糖醇(DTT)使其終濃度為5 mM，56℃還原30 min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其終濃度為11 mM，常溫避光孵育15 min。

1.2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析 肽段用液相色譜流動(dòng)相A相溶解后使用NanoElute超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸和2%乙腈的水溶液；流動(dòng)相B為含0.1%甲酸和100%乙腈溶液。液相梯度設(shè)置：0-70 min，6%-24%B，70-84 min，24%-35%B；84-87 min，35%-80%B；87-90 min，80%B，流速維持在450.00 nL/min。肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)被注入Capillary離子源中進(jìn)行電離然后進(jìn)tims-TOF Pro質(zhì)譜進(jìn)行分析。離子源電壓設(shè)置2.0 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的TOF進(jìn)行檢測和分析。二級質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為100-1700。數(shù)據(jù)采集模式使用平行累積串行碎裂(PASEF)模式。一張以級質(zhì)譜采集后進(jìn)行10次PASEF模式采集母離子電荷數(shù)在0-5范圍內(nèi)的二級譜圖，串聯(lián)質(zhì)譜掃描的動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為30 s秒避免母離子的重復(fù)掃描。

1.2.4數(shù)據(jù)庫搜索 二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Maxquant 1.6.6.0進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置：數(shù)據(jù)庫為Mesocricetus_auratus-10036(31693條序列)，添加了反庫以計(jì)算隨機(jī)匹配造成的假陽性率(FDR),并且在數(shù)據(jù)庫中加入了常見的污染庫，用于消除鑒定結(jié)果中污染蛋白的影響；酶切方式設(shè)置為Trypsin/P；漏切位點(diǎn)數(shù)設(shè)為2；肽段最小長度設(shè)置為7個(gè)氨基酸殘基；肽段最大修飾數(shù)設(shè)為5；First search和Main search一級母離子質(zhì)量誤差容忍度分別為20.0 ppm和20 ppm，二級碎片離子的質(zhì)量誤差容忍度為20.0 ppm。將半胱氨酸烷基化Carbamidomethyl(C)設(shè)置為固定修飾，可變修飾為[′Acetyl (Protein N-term)′,′Oxidation (M)′]，定量方法設(shè)置為LFQ，蛋白鑒定，PSM鑒定的FDR都設(shè)置為1%。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析 所有實(shí)驗(yàn)均為3個(gè)重復(fù)。數(shù)據(jù)以平均SD表示。圖表使用Graph Pad Prism 7.0和Excel Software 2007制作。采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析方法檢驗(yàn)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.6免疫組化及結(jié)果分析 Anti-RNF20抗體(Affinity)，免疫組化方法按試劑盒說明書操作。

分別以細(xì)胞核、細(xì)胞漿(或細(xì)胞外)出現(xiàn)黑褐色或棕褐色顆粒為強(qiáng)陽性表達(dá),棕黃色顆粒為陽性染色,淺黃色為弱陽性,無色為陰性表達(dá),隨機(jī)觀察5個(gè)具有代表性的高倍鏡視野,陽性細(xì)胞(強(qiáng)陽性+陽性)百分比為5 個(gè)視野陽性細(xì)胞百分比的平均數(shù)。采用S PSS19.0 版本,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Au-Ag

@ PDA NPs(40 μg /ml)處理后808 nm激光(0.5 W/cm2)照射3分鐘組與空白對照組間蛋白質(zhì)組學(xué)的變化中發(fā)現(xiàn)RNF20表達(dá)增加1.624倍。Akr1b1表達(dá)增加1.6145倍，CDKN1B、Marc1表達(dá)分別降低0.4367、0.4057倍(見表1)。

表1 Au-Ag @ PDA NPs處理后808 nm激光照射組與空白對照組間蛋白質(zhì)組學(xué)的變化

2.2 免疫組化

Au-Ag @ PDA NPs(40 μg /ml)處理后808 nm激光(0.5 W/cm2)照射3 min后20天與空白對照組間石蠟標(biāo)本免疫組化RNF20表達(dá)增加(見圖1)

A：空白對照組；B：外用Au-Ag-PDA @ STCM納米顆粒后808 nm激光照射20天后皮脂腺細(xì)胞明顯縮小。免疫組化：RNF20核膜++

3 討論

近年來，具有光熱效應(yīng)的納米顆粒備受關(guān)注，在癌癥的診斷和治療中取得了很大的進(jìn)步[2]。眾所周知，銀具有抗菌活性。金和銀的組合具有良好的導(dǎo)熱性，所以成為常見的光熱治療組合[3]。多巴胺具有良好的組織相容性，廣泛用于各種疾病的診斷和治療[4]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Au-Ag@PDA納米顆粒，在808 nm激光照射后顯著縮小金黃地鼠皮脂腺斑大小并減少皮脂分泌，并且808 nm激光在3 min的照射時(shí)間，0.5 W/cm2的強(qiáng)度下對皮脂腺的抑制增生作用最理想[1]。

光熱效應(yīng)選擇性作用于皮脂腺，抑制皮脂腺增生、抑制皮脂分泌，作為一種新的潛在的治療痤瘡的方法備受關(guān)注。但由于毛囊皮脂腺單位中的皮脂腺，對近紅光的吸收較低，迄今為止未取得滿意的方法[5-6]。

5-ALA光動(dòng)力療法已廣泛用于治療痤瘡，其作用機(jī)制為光熱作用，但5-ALA的親水性限制其在組織和細(xì)胞膜間的通透性，影響光動(dòng)力療法的治療效果。納米金是粒徑1-100 nm的金顆粒分散體系，具有生物相容性和良好的光熱轉(zhuǎn)換作用，即在一定光照下，納米金能夠吸收光，將光能轉(zhuǎn)化為熱能，傳遞給周圍組織，使附近的物質(zhì)溫度升高[7]，引起細(xì)胞死亡。然而，如何增加靶組織的選擇性光熱作用，減少靶組織外的熱損傷一直是研究熱點(diǎn)。2015年Dilip Paithankar等[8]報(bào)道了利用超聲導(dǎo)入一個(gè)聚乙二醇(PEG)涂層的二氧化硅核心(直徑120 nm)，被15 nm厚的金殼包圍的金顆粒的方法增加了金顆粒富集在毛囊皮脂腺單位，增加了金顆粒滲透到皮脂腺部位，近紅外光照射后，84%的漏斗部和47%的皮脂腺淺表部分發(fā)生了局部熱損傷。推測的作用機(jī)制是，由于金微粒對光線的吸收，帶有漏斗和皮脂腺的毛囊皮脂腺單位被加熱，導(dǎo)致局部熱損傷，使毛囊內(nèi)容物汽化，并損傷皮脂腺，導(dǎo)致皮脂分泌減少。然而，有關(guān)金殼與二氧化硅的大小、厚度、比例的調(diào)整及超聲參數(shù)的調(diào)整，需要進(jìn)一步的研究。

目前金銀納米顆粒介導(dǎo)的光熱療法做為一種非侵入性治療方法在腫瘤方面的研究日益增多[9]。然而，其穿透深度不足，腫瘤缺氧和單一治療方法嚴(yán)重限制了治療的有效性。我們發(fā)現(xiàn)Au-Ag@PDA納米顆粒被干細(xì)胞膜微粒包裹后，可以促進(jìn)細(xì)胞對納米顆粒的攝取，提高納米粒子分散性和生物相容性，進(jìn)一步優(yōu)化其光熱治療效率，光熱作用效果更持久[1]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞膜納米載藥系統(tǒng)載Au-Ag@PDA(Au-Ag-PDA @ STCM)納米顆粒做為新型低濃度光敏劑在808 nm激光功率密度0.5 w/cm2、3 min照射時(shí)間下皮脂腺體積顯著縮小，減少皮脂分泌，但仍見到完整的表皮[1]，光熱作用較Au-Ag@PDA更持久。Au-Ag-PDA @ STCM 納米顆粒處理SZ95細(xì)胞后808 nm激光照射[1]。我們研究發(fā)現(xiàn)[10]干細(xì)胞膜納米載藥系統(tǒng)載異維A酸通過提高cavolin-1的表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)吞作用加強(qiáng)干細(xì)胞膜載藥的透皮能力，促進(jìn)藥物到達(dá)靶部位。推測，Au-Ag@PDA納米顆粒被干細(xì)胞膜微粒包裹后，可以促進(jìn)細(xì)胞對納米顆粒的攝取，提高納米粒子分散性和生物相容性，進(jìn)一步優(yōu)化其光熱治療效率，光熱作用效果更持久。干細(xì)胞膜載金銀納米顆粒在808 nm激光照射后的光熱轉(zhuǎn)換對皮脂腺的抑制增生作用對痤瘡的治療領(lǐng)域?qū)?huì)提供非常有意義的治療手段。

雄激素通過抑制皮脂腺細(xì)胞自噬、阻斷皮脂降解，促進(jìn)痤瘡的發(fā)生發(fā)展。抑制雄激素的分泌，可以解除自噬抑制，減少皮脂腺的分泌。皮膚科常用于治療痤瘡的抗雄激素類藥物能下調(diào)皮脂腺細(xì)胞的mTORC1，可促進(jìn)自噬，從而起著治療痤瘡的作用[11]。

我們發(fā)現(xiàn)，Au-Ag-PDA @ STCM 納米顆粒涂抹金黃地鼠兩側(cè)背部皮脂腺斑后808 nm近紅外激光照射時(shí)，組織中Cdkn1b蛋白表達(dá)下調(diào)，Rnf20蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Cdkn1b蛋白是一種磷酸激酶的抑制劑，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道Cdkn1b蛋白與自噬相關(guān)；Rnf20蛋白是一種E3連接酶，會(huì)影響蛋白的降解；在Cdkn1b蛋白表達(dá)下調(diào)過程中，會(huì)增加蛋白質(zhì)的磷酸化，從而促進(jìn)ATP到ADP的過程；而這個(gè)過程的促進(jìn)，會(huì)增加E1激活酶的活性，從而促進(jìn)E2連接酶，以及最終使得E3連接酶的表達(dá)增加，而Rnf20正是在這個(gè)過程中增加的。Rnf20的增加會(huì)影響蛋白質(zhì)的泛素化，使得泛素化水平增加，從而使蛋白更容易發(fā)生降解。

敲除RNF20后，H2Bub顯著降低，H2Bub1主要由RAD6-RNF20泛素化機(jī)制催化，H2Bub1是調(diào)控自噬的表觀遺傳新途徑[12]。自噬與蛋白的泛素化在細(xì)胞內(nèi)是協(xié)同作用的，一些聚集的蛋白能夠通過自噬途徑降解，它們首先被多聚泛素化修飾，然后才被p62識別后運(yùn)送到自噬體內(nèi)降解[13]。

在生理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)錄因子HSF1仍然是細(xì)胞質(zhì)中的一個(gè)單體。在熱應(yīng)激過程中，HSF1被迅速轉(zhuǎn)化為活性形式，激活后啟動(dòng)Hsp70的轉(zhuǎn)錄和合成，熱休克蛋白70是HSF1的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)[13]。當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí)，熱休克蛋白大量表達(dá)，其作用是識別錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，并標(biāo)記他們以供蛋白酶體的降解[13]。Hsp70可以結(jié)合到錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)上，并引導(dǎo)E3泛素連接酶(如CHIP)將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)標(biāo)記上泛素，使得蛋白酶體能夠降解它們[14]。多種機(jī)制解釋了HSP27和HSP70的細(xì)胞保護(hù)作用。這兩種蛋白質(zhì)都是強(qiáng)大的伴侶。它們均在線粒體前后水平抑制凋亡機(jī)制的關(guān)鍵效應(yīng)因子[13]。在應(yīng)激條件下參與蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，從而促進(jìn)所謂的“蛋白質(zhì)分類”[14]。目前，已經(jīng)證實(shí)Hsp27和Hsp90具有提高泛素，蛋白酶體活性的功能。例如，Hsp27能夠直接與多聚泛素鏈和26s蛋白酶體相互作用[13]。中暑等熱應(yīng)激誘導(dǎo)HSP70的增加，進(jìn)一步誘導(dǎo)ATG5-ATG12復(fù)合物及LC3的增加，促進(jìn)自噬,上調(diào)HSP70促進(jìn)自噬[15]。

自噬長期以來被認(rèn)為是一種主要涉及膜相關(guān)融合事件的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞過程。然而，越來越多的研究表明，表觀遺傳修飾(如hMof-H4K16ac和G9a-H3K9me2軸)參與了自噬相關(guān)的細(xì)胞命運(yùn)的確定和自噬活性[4,16]。H2B單雙酯化(H2Bub1)是一種新的、關(guān)鍵的表觀遺傳開關(guān)，用于測定自噬活性[17]。這些研究為表觀遺傳調(diào)控因子可能在自噬調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用提供了直接支持。H2Bub1可能是對環(huán)境的一個(gè)即時(shí)反應(yīng)因子，通過營養(yǎng)變化來控制自噬的活性。組蛋白H2A和H2B以及腫瘤抑制因子p53依賴于RNF20的基因表達(dá)。RNF20抑制一些原癌基因的表達(dá)[18]。RNF20蛋白是一種E3連接酶,RAD6-RNF20泛素化復(fù)合體可能是唯一公認(rèn)的一種H2Bub1的泛素化酶[18]。有研究發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白ATG5通過轉(zhuǎn)錄控制RNF20調(diào)控組蛋白H2B單泛素化[19]。

Au-Ag@PDA NPs光熱作用于膀胱癌細(xì)胞后上調(diào)HSP70[20]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)金黃地鼠皮脂腺斑在干細(xì)胞膜載Au-Ag@PDA納米顆粒的光熱作用后RNF20表達(dá)增加。

我們推測，Au-Ag-PDA@做為新型光敏劑，它的光熱作用通過HSP70-RNf20-H2Bub1途經(jīng)誘導(dǎo)皮脂腺細(xì)胞自噬降解使皮脂腺細(xì)胞變小，抑制皮脂分泌達(dá)到治療痤瘡的目的。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)Au-Ag@PDA納米顆粒介導(dǎo)的光熱作用通過RNF20泛素化途徑引起皮脂腺細(xì)胞縮小，抑制皮脂分泌。為新型光敏劑治療痤瘡提供有價(jià)值的理論依據(jù)。相關(guān)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。