張麗蓉 樓燁亮 王 可 朱美曉

肺癌是目前最為常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌的85%以上，且轉(zhuǎn)移率和死亡率極高[1-2]。臨床治療肺癌多采用手術(shù)切除及化療手段，但患者生存質(zhì)量較低。中醫(yī)辨證治療在干預(yù)癌前病變、預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移、預(yù)防多藥耐藥等方面發(fā)揮重要作用[3]。澤漆（euphorbia helioscopia L.）為大戟科大戟屬植物，研究表明，澤漆可通過抑制腫瘤細(xì)胞生長增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及腫瘤血管形成等機(jī)制，在肺癌、肝癌、乳腺癌等多種癌癥中發(fā)揮抗腫瘤活性[4-6]。澤漆化學(xué)成分以萜類成分為主且表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[7]。但澤漆萜類成分抗腫瘤作用靶點及機(jī)制未明確。因此本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接工具，對澤漆萜類成分抗NSCLC 的作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為澤漆的臨床使用和進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1澤漆活性成分篩選及靶點預(yù)測 文獻(xiàn)中檢索澤漆的萜類成分，并檢索其SMILES 編碼上傳至Swiss ADME（http://www.swissadme.ch/）平臺進(jìn)行篩選，以胃腸道吸收程度（GI absorption）=“high”、Druglikeness項下多于2 個“Yes”為篩選條件即得澤漆活性成分合集。將上述篩選得到的活性成分上傳至Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺進(jìn)行靶點預(yù)測，以“Probability*＞0”為條件進(jìn)行篩選即得澤漆活性成分靶點合集

1.2NSCLC 相關(guān)靶基因的獲取 以“None-small cell Lung cancer”為關(guān)鍵詞分別在Gene cards 和CTD 中檢索肺癌相關(guān)靶基因。將從Gene cards 中獲得的NSCLC 靶基因按“Relevance score＞10”進(jìn)行篩選；CTD中獲得的NSCLC靶基因按“Inference Score”從大到小進(jìn)行排序，選取排名前200 位的靶基因[8]。將兩個數(shù)據(jù)庫所得到的靶基因進(jìn)行歸納整理，即得NSCLC 靶基因合集。將活性成分靶基因合集點與NSCLC 靶基因進(jìn)行相互映射，獲得澤漆活性成分-NSCLC 共同作用靶基因，并繪制Venn 圖，即得澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點及潛在作用成分。

1.3活性成分-肺癌靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點及潛在作用成分，歸納整理，所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.6.1 軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，建立澤漆萜類活性成分-NSCLC 靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?將澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING（https://string-db.org/）平臺進(jìn)行蛋白互作分析，設(shè)置參數(shù)：物種“Homo sapiens”，相互作用閾值=0.400，其余參數(shù)默認(rèn)。將獲得的相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)出，并應(yīng)用Cytoscape 3.6.1 軟件中進(jìn)行拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)分析，并繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5GO 分類與KEGG 通路富集分析 將PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龅玫降暮诵陌械鞍讓?dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）中，進(jìn)行基因本體（GO）分類富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 分類富集分析包括分子功能分析、生物學(xué)過程分析、細(xì)胞組分分析，研究藥物靶點主要信號通路，物種均設(shè)為“Homo sapiens（人類）”。以P＞0.05 為條件進(jìn)行篩選，并各選取前20 條繪制氣泡圖（不足20 條的全部選?。?，最后，將分析得到的靶點、信號通路相對應(yīng)，運用Cytoscape 3.6.1 軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)模型。

1.6分子對接驗證 整理PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的核心靶蛋白，利用autodock vina 對上述基因與可作用于這些基因的活性成分進(jìn)行半柔性分子對接。Vina半柔性分子對接后的結(jié)合能越低，表明活性成分與靶點存在相互作用的可能性越大，通常以結(jié)合能小于-5.0kJ/mol 為標(biāo)準(zhǔn)，選取結(jié)合能最高和最低的對接結(jié)果進(jìn)行展示。

2 結(jié)果

2.1澤漆抗肺癌活性成分篩選 在文獻(xiàn)中檢索澤漆萜類成分，共獲得85 個萜類成分，包括71 個二萜酯類、10 個三萜類及4 個倍半萜類。Swiss ADME 平臺中預(yù)測后得澤漆萜類活性成分共49 個，包括45 個二萜酯類及4 個倍半萜類（見表1）。

表1 澤漆萜類活性成分

2.2澤漆抗肺癌靶點篩選 將篩選得到的49 個活性成分上傳至Swiss Target Prediction 平臺中進(jìn)行預(yù)測，刪除重復(fù)靶基因后共得中配對得到484 個靶基因。Gene Cards 和CTD 中獲得的NSCLC 靶基因篩選整理共得到1071 個靶基因。將澤漆活性成分靶基因與肺癌靶基因相互映射共得到107 個基因（見圖1），表明澤漆可能通過這107 個靶基因起到治療NSCLC 的作用。

圖1 澤漆萜類成分-NSCLC 交集靶基因VENN 圖

2.3澤漆萜類成分-NSCLC 靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)篩選到的107 個澤漆萜類成分治療NSCLC 靶點以及靶點與成分之間的關(guān)系，建立活性成分-抗肺癌靶點網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2）。該網(wǎng)絡(luò)中包含154 個節(jié)點及600 條邊，包含47 個活性成分節(jié)點及107 個靶點節(jié)點，節(jié)點越大表示度值越大；600 條邊代表了活性成分與NSCLC 靶點間的相互作用。由Fig 2 可知，澤漆47種萜類活性成分作用于相同或不同的靶點，體現(xiàn)了澤漆多成分、多靶點治療NSCLC 的特點；根據(jù)節(jié)點的大小以及度值的高低，度值排名靠前的成分分別是euphohelioscopin B（degree=36）、euphornin K（degree=35）、euphornin A（degree=35）、euphoscopin A（degree=35）及euphoscopin E（degree=34），構(gòu)建這5種活性成分與靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)（見圖3），表明這5 種成分可能是澤漆萜類成分中治療NSCLC 的關(guān)鍵成分。

圖2 澤漆萜類成分-NSCLC 靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 澤漆萜類成分-NSCLC 靶點核心網(wǎng)絡(luò)

2.4PPI 網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 應(yīng)用STRING平臺對澤漆治療NSCLC 的靶蛋白進(jìn)行蛋白互作分析并應(yīng)用Cytoscape 初步構(gòu)建了一個包含107 個節(jié)點和1584 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)A。應(yīng)用CytoNCA（Version 2.1.6）插件，以Degree＞45 進(jìn)行第一次篩選后構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)B，以Betweenness＞16 進(jìn)行第二次篩選后構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)C，其過程見圖4。第二次篩選后得到的網(wǎng)絡(luò)圖中度值較大的靶蛋白分別是STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，度值均為15，這些靶點與其他靶點關(guān)聯(lián)密切，可能在治療NSCLC 的重要靶點。

圖4 PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

2.5GO 分類及KEGG 信號通路富集分析 將PPI網(wǎng)絡(luò)第二次篩選后得到的16 個蛋白靶點上傳至DAVID 6.8 平臺進(jìn)行富集分析，共得到211 條GO條目，包括155 條BP（生物過程），19 條CC（細(xì)胞組分）及37 條MF（分子功能）。以P 值排序，選取排名分別選取前20 條繪制氣泡圖（見圖5）。結(jié)果顯示，生物過程主要涉及PI3K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化及基因表達(dá)的正向調(diào)控等；細(xì)胞組分主要涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、細(xì)胞核漿、蛋白質(zhì)復(fù)合體及質(zhì)膜等；分子功能主要涉及酶結(jié)合、激酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白結(jié)合及MAP 激酶活性等，GO 分類富集結(jié)果表明澤漆萜類成分是通過多種生物學(xué)過程而發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

圖5 GO 功能富集結(jié)果

KEGG 富集共得到84 條信號通路，以P 值排序，選取排名分別選取前20 條繪制桑吉氣泡圖（見圖6）。主要涉及的信號通路主要有ErbB 信號通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路及多種癌癥通路等，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲及凋亡等過程，表明澤漆萜類成分可通過多條信號通路發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

圖6 KEGG 信號通路富集結(jié)果

2.6靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò) 將排名前20 位的信號通路與靶點相對應(yīng)，歸納整理，導(dǎo)入Cytoscape 中構(gòu)建“靶點-信號通路”網(wǎng)絡(luò)（見圖7），網(wǎng)絡(luò)中共包括36 個節(jié)點和164 條邊，其中20 個橙色三角形為信號通路節(jié)點，16 個綠色圓形為靶點節(jié)點，表明澤漆萜類成分可能通過多靶點、多信號通路而發(fā)揮治療NSCLC 的作用。網(wǎng)絡(luò)中，靶點節(jié)點中排名前5 的靶點分別是MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，分別調(diào)控了多條信號通路，表明這5 個靶點可能是澤漆萜類成分中發(fā)揮治療NSCLC 作用的關(guān)鍵成分。

圖7 澤漆萜類成分抗NSCLC 靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)

2.7分子對接驗證結(jié)果 PPI 核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白為STAT3、ERBB2、MTOR、EGFR、MDM2、AR、CASP3、SRC、CCND1、MAPK3、ESR1 及MAPK1，靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中的核心基因為MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR，結(jié)合2.3 項下獲得的關(guān)鍵活性成分，利用autodock vina 對上述基因與可作用于這些基因的活性成分進(jìn)行半柔性分子對接，見表2，結(jié)果顯示活性成分與其對應(yīng)的靶點分子對接結(jié)合能均小于-5.0kJ/moL，表明活性成分與靶點具有較好的結(jié)合活性，證明本文的預(yù)測結(jié)果較為可靠。選取結(jié)合能最低（Mol30 與SRC）和最高（Mol37 與PIK3CA）的對接結(jié)果進(jìn)行展示，見圖8。

圖8 分子對接結(jié)果展示

表2 分子對接結(jié)果

3 討論

本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，整合多個數(shù)據(jù)平臺對澤漆萜類成分治療NSCLC 的可能作用機(jī)制進(jìn)行研究，通過構(gòu)建漆萜類活性成分-NSCLC 靶點網(wǎng)絡(luò)，明確澤漆萜類成分中的euphohelioscopin B、euphornin K、euphornin A、euphoscopin A 及euphoscopin E 為主要活性成分，但暫未檢索到目前有針對該幾種成分的藥理研究，缺乏實驗研究佐證，后續(xù)將主要對這5種成分的抗NSCLC 作用進(jìn)行深入研究。

PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治黾鞍悬c-信號通路網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR 可能是澤漆萜類成分發(fā)揮抗NSCLC 作用的關(guān)鍵靶點。MAPK3（ERK1）與MAPK1（ERK2）同屬于MAPK 通路下游中重要的靶標(biāo)[9]，目前基本認(rèn)為ERK1 與ERK2的生物學(xué)功能類似[10]。臨床檢測肺癌等多種腫瘤組織ERK1 高表達(dá)[11]，肺癌組織ERK1/2 通路失調(diào)，且在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[12-13]。EGFR 是NSCLC中最常見的驅(qū)動基因，EGFR 基因突變可增強(qiáng)TK 活性，且當(dāng)EGFR 與配體結(jié)合后可激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14-15]。臨床上已有多種EGFR 靶向抑制劑應(yīng)用于NSCLC 的治療[16]。PIK3CA 在肺癌組織中也存在突變及過度擴(kuò)增的現(xiàn)象[17]。EGFR 與PIK3CA 的突變往往導(dǎo)致AKT 的突變及過度活化，促進(jìn)肺癌進(jìn)一步惡化[18]。CCND1 在G1/S 期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換中起著重要的作用，當(dāng)其在NSCLC 腫瘤組織呈現(xiàn)高表達(dá)的狀態(tài)時，腫瘤細(xì)胞可加速細(xì)胞周期進(jìn)程引起細(xì)胞的快速增殖[19-20]。以上結(jié)果表明，MAPK1、MAPK3、PIK3CA、CCND1 及EGFR可能是澤漆萜類成分治療NSCLC 的潛在作用靶點。

GO 分類和KEGG 富集分析結(jié)果顯示，澤漆萜類成分抗NSCLC 作用的生物學(xué)過程主要涉及PI3K 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、序列特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化及基因表達(dá)的正向調(diào)控等，通過調(diào)控ErbB 信號通路、HIF-1信號通路、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、侵襲、凋亡及腫瘤組織血管生成等發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

最后對篩選得到的活性成分及靶點進(jìn)行分子對接驗證，結(jié)果顯示，澤漆萜類活性成分與相對應(yīng)的作用靶點均展現(xiàn)出較好的親和力，且結(jié)合位點均有穩(wěn)定的氫鍵，構(gòu)象穩(wěn)定，有強(qiáng)烈的結(jié)合能力，進(jìn)一步驗證了本研究預(yù)測的準(zhǔn)確性，也表明澤漆萜類成分可能通過多成分作用于多靶點發(fā)揮治療NSCLC 的作用。

綜上所述，本研究通過對澤漆萜類成分抗NSCLC 作用靶點的生物過程及信號通路進(jìn)行富集分析，明確了澤漆萜類成分抗NSCLC 作用的分子機(jī)制具有多成分、多靶點、多途徑的特點。這為后續(xù)實驗驗證提供了研究思路，而澤漆萜類成分研究較少，本研究所預(yù)測到的5 種主要活性成分均無藥理研究先例，后續(xù)將對此進(jìn)行深入研究。