于雅勤 沈加熙 張 虹

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)、最致命的惡性腫瘤之一[1]。由于缺乏早期癥狀和有效的篩查策略，患者診斷時(shí)通常為晚期[2]。雖然CRC 分子靶向治療和免疫治療已取得重大進(jìn)展[3]，但患者的預(yù)后仍較差。因此，尋找一種有效的CRC 治療方式并探索其潛在的調(diào)控機(jī)制十分必要。從藥用植物或草藥中提取的天然產(chǎn)物是治療CRC的重要補(bǔ)充療法[4]。梔子苷（geniposide，GEN）是一種類(lèi)環(huán)烷苷，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種生物活性[5-6]。研究表明，GEN 通過(guò)阻斷HepG2 和HuH7 細(xì)胞Wnt/β-catenin 和AKT 級(jí)聯(lián)通路抑制細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。然而，GEN對(duì)CRC 的影響和作用機(jī)制仍不清楚。因此，本研究旨在探討GEN 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試 劑 GEN（批號(hào)YRZ005，純度：≥98%）購(gòu)自儀睿生物科技有限公司，胎牛血清（批號(hào)10099141C）、Dulbecco 改良Eagle’s 培養(yǎng)基（DMEM，批號(hào)11965092）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，四甲基偶氮唑鹽（MTT，批號(hào)11465007001）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)276855）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，Annexin V-FITC/PI 雙染試劑盒（批號(hào)556419）購(gòu)自BD Biosciences 公司，一抗p-Akt（sc-271964）、Akt（sc-81434）、p-MDM2（sc-53368）、p-p53（sc-135772）、p53（sc-393031）、MDM2（sc-5304）、cyclin B1（sc-7393）、Bcl-2（sc-7382）和β-actin（sc-47778）購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology 公司。

1.2細(xì)胞來(lái)源及培養(yǎng) 人CRC 細(xì)胞系（HCT-8、SW-480、HT-29、DLD-1）和人永生化健康結(jié)腸細(xì)胞CCD-18Co 來(lái)自中國(guó)科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞系置于含10%胎牛血清、1U/mL 青霉素G、1μg/mL 鏈霉素的DMEM，在37℃和5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)和維持。

1.3細(xì)胞活力測(cè)定 CRC 細(xì)胞（2×105細(xì)胞）和CCD-18Co 細(xì)胞（5×104細(xì)胞）接種于96 孔板中，用不同濃度（0～200μM）的GEN 孵育24h 或48h 后每孔加入30μL 的5mg/mL 四甲基偶氮唑鹽（MTT）溶液，37℃孵育4h，去掉培養(yǎng)液，加入150μL DMSO 溶解甲醛晶體。使用微板閱讀器在540nm 處讀取每個(gè)樣品的吸光度。計(jì)算所有細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度（IC50），其中一株細(xì)胞在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中被用來(lái)闡明GEN 的作用機(jī)制。

1.4流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡與周期 收集SW480 細(xì)胞經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）GEN處理48h 后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，用PBS 洗滌，并在20℃的70%乙醇中固定過(guò)夜，然后與RNase（1mg/mL）孵育并用碘化丙錠（PI）（50μg/mL）染色。使用BD FACS Calibur 儀器通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)確定DNA 含量。測(cè)定細(xì)胞凋亡時(shí)，用冰冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，在含有Annexin V-FITC 和PI 的300μL 溶液中，室溫黑暗中染色15min。隨后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)熒光信號(hào)。Annexin V-FITC/PI 圖上象限定位用于區(qū)分活細(xì)胞（FITC-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（FITC+/PI-）和晚期凋亡或壞死細(xì)胞（FITC+/PI+）。

1.5Western blot 分析 SW480 細(xì)胞經(jīng)GEN 處理48h 后，在裂解緩沖液中裂解30min。變性蛋白樣品（20μg）裝入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中。電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含10%脫脂牛奶的封閉液封閉后，用含0.1%（v/v）吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBS-T）洗滌，然后與一抗（1∶1000）在4℃孵育2h。用PBS-T 洗滌后，用與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1h，最后，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑（GE Healthcare）可視化蛋白質(zhì)條帶。

1.6Akt 基因敲低和轉(zhuǎn)染 為建立穩(wěn)定的AKT 基因敲低細(xì)胞，將慢病毒質(zhì)粒（shAKT1 和shAKT2）與包裝載體（psPAX2 和PMD2.G）用轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞。用0.45μm 濾器過(guò)濾收集病毒顆粒，將病毒顆粒保存在-80℃中，用8μg/mL 聚乙烯胺（微孔）感染培養(yǎng)的CRC 細(xì)胞24h，然后用嘌呤霉素（1μg/mL）篩選36h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7免疫熒光法 用TBS 洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15min 后，用含0.1%Triton X-100 和1%牛血清白蛋白的1%牛血清白蛋白在37℃通透性封閉1h，然后與抗p53 抗體（1∶500）和MDM2 抗體（1∶500）共同孵育，在4℃輕度搖晃過(guò)夜。然后用PBS 洗滌細(xì)胞，分別與山羊抗兔（1∶500）和山羊抗鼠488（1∶500）二抗在室溫下孵育3h，最后用4’，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色細(xì)胞核5min。用Leica SP2 共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞并拍照。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)至少一式三份進(jìn)行，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）。利用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用單因素方差分析確定顯著性差異，然后進(jìn)行Dunnett’s 事后檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1GEN 對(duì)CRC 細(xì)胞株增殖的影響 以CRC 細(xì)胞株（HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1）和正常結(jié)腸細(xì)胞CCD-18Co 為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用MTT 法檢測(cè)GEN的抗癌作用。細(xì)胞中加入不同濃度（0、25、50、75、100、150 和200μM）的GEN，表1 顯示，與0μM GEN處理組比較，50、75、100、150 和200μM 的GEN 作用24h 和48h 后，CRC 細(xì)胞增殖受到抑制，并呈劑量依賴(lài)性（P 均＜0.05），25μM 的GEN 作用48h 后SW-480 和HT-29 細(xì)胞增殖抑制（P 均＜0.05）。此外，與處理24h 組比較，SW-480 和HT-29 細(xì)胞在75、100 和150μM 的GEN 處理48h 后細(xì)胞增殖抑制（P 均＜0.05），HCT-8 細(xì)胞在100 和150μM 的GEN 處理48h 后細(xì)胞增殖抑制（P 均＜0.05），DLD-1 在100 和200μM 的GEN 處理48h 后細(xì)胞增殖抑制（P 均＜0.05）。而在200μM 濃度范圍內(nèi)GEN 對(duì)正常細(xì)胞CCD-18Co 無(wú)顯著毒性。HCT-8、SW-480、HT-29 和DLD-1 細(xì)胞在24h 和48h 的IC50 見(jiàn)表2，GEN 對(duì)SW-480 細(xì)胞的IC50 最低（P＜0.05），故進(jìn)一步用于確定GEN 的作用機(jī)制，選擇濃度為0～150μM 的GEN 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 梔子苷（GEN）對(duì)SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 細(xì)胞活力的影響（n=3，）

表1 梔子苷（GEN）對(duì)SW-480、HCT-8、HT-29、DLD-1 和CCD-18Co 細(xì)胞活力的影響（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 為人結(jié)腸癌細(xì)胞；DLD-1 為人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞；CCD-18Co 為人結(jié)腸組織細(xì)胞；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05；與處理24h 組比較，bP<0.05

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半數(shù)抑制濃度（IC50）（n=3，）

表2 SW-480、HCT-8、HT-29 和DLD-1 24 和48h半數(shù)抑制濃度（IC50）（n=3，）

注：SW-480、HCT-8 和HT-29 為人結(jié)腸癌細(xì)胞；DLD-1 為人結(jié)直腸腺癌上皮細(xì)胞；與SW-480 細(xì)胞比較，aP<0.05

2.2GEN 對(duì)SW-480 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)GEN 對(duì)SW-480 細(xì)胞凋亡的影響，圖1A 和表3 顯示，GEN（50、100、150μM）處理48h 后，凋亡細(xì)胞百分率顯著增加，且呈劑量依賴(lài)性（P＜0.05）。此外，與0μM GEN 處理組比較，GEN 處理可以顯著增加凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2 表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖1B和表4。

2.3GEN 對(duì)SW-480 細(xì)胞周期的影響 GEN（100和150μM）作用48h 后，SW-480 細(xì)胞周期阻滯于G2-M 期（P＜0.05，見(jiàn)圖1C 和表3），細(xì)胞周期蛋白cyclin B1 表達(dá)下降（P＜0.05，見(jiàn)圖1D 和表4）。

圖1 梔子苷（GEN）對(duì)SW-480 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

表3 梔子苷（GEN）對(duì)SW-480 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響（n=3，）

表3 梔子苷（GEN）對(duì)SW-480 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響（n=3，）

注：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480 經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）的梔子苷（GEN）作用48h；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05

表4 SW480 細(xì)胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相對(duì)蛋白表達(dá)水平（n=3，）

表4 SW480 細(xì)胞Bax/Bcl-2、cyclin B1、p-Akt/Akt、p-MDM2/MDM2 和p-p53/p53 相對(duì)蛋白表達(dá)水平（n=3，）

注：人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480 經(jīng)不同濃度（0、50、100 和150μM）的梔子苷（GEN）作用48h；與0μM GEN 處理組比較，aP<0.05

2.4GEN 對(duì)Akt/MDM2/p53 信號(hào)通路的影響 GEN下調(diào)CRC 細(xì)胞系A(chǔ)kt 和MDM2 蛋白表達(dá)，并激活p53 蛋白表達(dá)（P＜0.05，見(jiàn)圖2 和表4），為了研究GEN 對(duì)細(xì)胞增殖的抑制是否依賴(lài)于Akt 蛋白的表達(dá)，通過(guò)用含有pLKO 或shRNA-Akt1/2 的慢病毒載體感染細(xì)胞來(lái)進(jìn)行Akt 的敲低（見(jiàn)圖3A），CRC 細(xì)胞Akt1/2 的敲低導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少（見(jiàn)圖3B），而GEN處理無(wú)法進(jìn)一步抑制shRNA-Akt1/2 細(xì)胞中的增殖能力（見(jiàn)圖3C）。免疫熒光染色顯示，GEN 下調(diào)CRC細(xì)胞系MDM2 表達(dá)，并激活p53，與pLKO 組比較，Akt1/2 敲低后MDM2 被抑制，而p53 被激活（見(jiàn)圖3D）。

圖2 GEN 對(duì)Akt/MDM2/p53 信號(hào)通路的影響

3 討論

藥用植物天然產(chǎn)物具有高效低毒的特點(diǎn)，GEN是梔子的主要生物活性成分之一，具有抗炎和抗腫瘤等重要的治療作用。此外，GEN 有效發(fā)揮胃腸疾病保護(hù)劑的作用[8]，其通過(guò)抑制炎癥和黏膜損傷減輕結(jié)腸炎[9]，研究證明，GEN 可以預(yù)防和治療炎癥驅(qū)動(dòng)的疾病，包括癌癥[6，10]。據(jù)報(bào)道，GEN 能抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。在胃癌中，GEN 治療也對(duì)癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)GEN 可抑制CRC 細(xì)胞的增殖，而對(duì)Ccd-18Co 細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響。這與之前的研究一致，提示GEN 的抗腫瘤活性，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒且安全[7]。此外，我們發(fā)現(xiàn)GEN 可誘導(dǎo)CRC 細(xì)胞發(fā)生G2/M 期阻滯和凋亡。已有研究報(bào)道，GEN 對(duì)彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和凋亡抵抗具有抑制作用[12]。然而，尚不清楚GEN 如何參與CRC 中細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)。

Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，也稱(chēng)為蛋白激酶B（PKB），其抑制細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)糖原代謝，促進(jìn)癌癥進(jìn)展，磷酸化Akt 的過(guò)表達(dá)是惡性腫瘤治療的一個(gè)靶點(diǎn)[13]。以往的研究表明，Akt/MDM2/p53 信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡有相當(dāng)大的影響，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[14]。本研究中GEN 抑制CRC 細(xì)胞Akt/MDM2/p53 信號(hào)通路。據(jù)報(bào)道，Akt 信號(hào)通路的異常激活與CRC 的進(jìn)展密切相關(guān)，盡管一些Akt 抑制劑已經(jīng)用于治療CRC，然而Akt 作為CRC 靶點(diǎn)的報(bào)道很少。本研究中，Akt 敲低顯著抑制CRC 細(xì)胞的生長(zhǎng)，這與之前的報(bào)告一致[15]。此外，p53 在多細(xì)胞生物體中扮演著重要的腫瘤抑制因子的角色，在癌癥發(fā)展和其功能障礙可能有助于快速細(xì)胞增殖和減少DNA 修復(fù)能力[16]。本研究還證明，GEN 可以增加p53 和Bax蛋白的表達(dá)，并降低Bcl-2 蛋白的表達(dá)。

據(jù)報(bào)道，AKT 磷酸化可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子MDM2的穩(wěn)定和核易位，從而引發(fā)隨后的腫瘤抑制因子p53的泛素化和降解[17]。本研究中Akt1/2 基因敲除抑制MDM2 和p53 表達(dá)。因此，GEN 可能通過(guò)抑制Akt 介導(dǎo)的MDM2 磷酸化來(lái)激活p53 介導(dǎo)的通路，從而有助于抑制CRC 細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，GEN 抑制CRC 細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)G2/M 期阻滯和凋亡，其作用機(jī)制可能通過(guò)Akt/MDM2/p53 途徑，從而發(fā)揮抗癌作用，即GEN 抑制Akt 介導(dǎo)的MDM2 和p53 激活，從而抑制人CRC 細(xì)胞的增殖。但是目前研究尚缺乏在生物體內(nèi)的驗(yàn)證，希望能在后續(xù)研究中增加體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以充分評(píng)估GEN 對(duì)生物體的安全性和治療有效性。