朱延松，張亞飛，程莉，楊勝男，趙婉彤,2，江東,2

利用Target SSR-seq技術(shù)鑒定60份柑橘種質(zhì)資源

朱延松1，張亞飛1，程莉1，楊勝男1，趙婉彤1,2，江東1,2

1西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712

【背景】芽變是植物分生組織體細(xì)胞所發(fā)生的DNA突變，從而引起枝、葉、花、果及物候期、成熟期等系列表型特征的改變，其變異性狀可遺傳。然而由于環(huán)境條件、栽培技術(shù)等，植物可能產(chǎn)生彷徨變異，這種變異不可遺傳?！灸康摹坷酶咄繙y(cè)序技術(shù)建立一套適用于柑橘芽變資源鑒定的方法，為柑橘種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定提供技術(shù)支撐?！痉椒ā繛樘岣哐孔儾牧系姆肿予b定能力，本研究通過(guò)對(duì)‘克里曼丁’以及‘溫州蜜柑’全基因組數(shù)據(jù)以及‘溫州蜜柑’GSS、EST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、比對(duì)，篩選出多態(tài)性高的位點(diǎn)用于深度測(cè)序。根據(jù)引物互補(bǔ)結(jié)構(gòu)對(duì)引物進(jìn)行分組后用于多重?cái)U(kuò)增檢測(cè)及構(gòu)建雙端測(cè)序文庫(kù)，構(gòu)建好的文庫(kù)通過(guò)Miniseq平臺(tái)完成高通量測(cè)序，使用生物信息學(xué)方法對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析?！窘Y(jié)果】通過(guò)對(duì)大量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析、比對(duì)，本研究共設(shè)計(jì)出77對(duì)用于柑橘芽變鑒定的SSR引物，根據(jù)引物互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，將引物分成18個(gè)組合。通過(guò)對(duì)60份柑橘材料進(jìn)行Target SSR-seq分析，所設(shè)計(jì)引物可以將所測(cè)試的柑橘種質(zhì)資源分為甜橙和寬皮柑橘，在寬皮柑橘中可細(xì)分為‘沃柑’‘椪柑’以及雜柑等栽培種，對(duì)于栽培種內(nèi)芽變資源也具有較好的鑒別能力。在7個(gè)‘塔羅科’血橙芽變中發(fā)現(xiàn)11個(gè)SSR變異位點(diǎn)，2個(gè)‘五月紅’芽變中發(fā)現(xiàn)8個(gè)SSR變異位點(diǎn)，5個(gè)臍橙樣品中發(fā)現(xiàn)8個(gè)SSR變異位點(diǎn)，9個(gè)‘冰糖橙’品種中發(fā)現(xiàn)16個(gè)SSR變異位點(diǎn)，2個(gè)‘砂糖橘’芽變中發(fā)現(xiàn)9個(gè)SSR變異位點(diǎn)，4個(gè)‘溫州蜜柑’芽變中發(fā)現(xiàn)15個(gè)芽變位點(diǎn)，8個(gè)‘沃柑’芽變中發(fā)現(xiàn)21個(gè)SSR變異位點(diǎn)，‘沃柑’雜交品種中發(fā)現(xiàn)11個(gè)SSR變異位點(diǎn)，在‘椪柑’中發(fā)現(xiàn)14個(gè)SSR變異位點(diǎn)。在SSR位點(diǎn)變異中，‘塔羅科’血橙以ATT基序最多，‘五月紅’以TAA基序最多，臍橙以TAA基序最多，‘冰糖橙’以GA基序最多，‘砂糖橘’以AAT基序最多，‘溫州蜜柑’以AAT基序最多，‘沃柑’芽變資源以AAT基序最多，‘沃柑’雜交資源以TAA、GA基序最多。【結(jié)論】使用Target SSR-seq技術(shù)建立了一套高效的柑橘芽變鑒定方法。對(duì)所試驗(yàn)的60份柑橘資源具有鑒別能力，SSR基因分型信息準(zhǔn)確、可靠，可用于柑橘種質(zhì)資源管理和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)。

柑橘；芽變；Target SSR-seq

0 引言

【研究意義】芽變是植物芽的體細(xì)胞分生組織所發(fā)生的DNA突變，從而引起枝、葉、花、果及成熟期等系列表型特征的改變，其變異性狀可遺傳。在柑橘及果樹(shù)的選育過(guò)程中，通常選擇發(fā)生芽變的枝條進(jìn)行無(wú)性繁殖，可以創(chuàng)造出新品種。然而由于環(huán)境條件、栽培技術(shù)等，植物可能產(chǎn)生彷徨變異，這種變異不可遺傳，對(duì)芽變選種造成了干擾。因此通過(guò)分子生物技術(shù)對(duì)變異植株進(jìn)行遺傳變異研究，尤其是開(kāi)發(fā)高效的辨別芽變材料的方法，對(duì)芽變選種、種質(zhì)創(chuàng)新具有較大意義。【前人研究進(jìn)展】芽變選種是柑橘育種的重要手段，近些年來(lái)通過(guò)芽變選種育成了大量果皮顏色迥異、熟期差異的芽變品種，但要尋找芽變材料之間的分子差異卻困難較大。近幾年，學(xué)者常使用SSR[1-3]、LTR[1]、SNP[4]、S-SAP[5]、SRAP[6]等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)芽變品種在內(nèi)的柑橘種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)及進(jìn)化研究，取得了一些成果。SSR、LTR等標(biāo)記在柑橘種屬水平的鑒定區(qū)分能力較強(qiáng)，但對(duì)于芽變品種的鑒定能力不盡如人意[1]；S-SAP、SRAP等標(biāo)記對(duì)柑橘芽變具有一定的鑒別能力，但需要通過(guò)篩選大量的引物才能獲得鑒定目標(biāo)；SNP標(biāo)記數(shù)量多，常用于芽變材料的鑒定，但多需要進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）廣泛存在于真核細(xì)胞中[7]，由于其在全基因組中分布廣、密度高，具有較高的突變率，SSR標(biāo)記已被作為第二代分子標(biāo)記，廣泛應(yīng)用于資源鑒定和分子標(biāo)記輔助育種中[8]。由于部分在SSR重復(fù)序列內(nèi)的插入/缺失序列短，以及一些發(fā)生在側(cè)翼序列的突變影響，使通過(guò)長(zhǎng)度判斷特異條帶的方法存在假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)SSR基因座的測(cè)序成為基因型鑒定的一種有效方法，能夠檢測(cè)種內(nèi)和種間水平的變異[8-9]。高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使短時(shí)間內(nèi)對(duì)大批量SSR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型成為可能。AmpSeq-SSR[10]、Target SSR[8]等技術(shù)是基于二代測(cè)序技術(shù)的SSR分型方法，可同時(shí)對(duì)數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的SSR位點(diǎn)進(jìn)行高通量測(cè)序，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)利用電泳技術(shù)分辨率低、通量小、難以獲得準(zhǔn)確基因型的缺陷。將SSR標(biāo)記與二代測(cè)序技術(shù)結(jié)合的方法已運(yùn)用于水稻[10]、黃瓜[8]、大戟[11]等物種的種質(zhì)資源研究，胡冬梅等[12]通過(guò)Target SSR技術(shù)成功鑒定兩個(gè)‘溫州蜜柑’芽變品種并檢測(cè)到SSR基序差異位點(diǎn)。【本研究切入點(diǎn)】為提高柑橘種質(zhì)資源中芽變材料的鑒定效率，基于目前在柑橘種質(zhì)資源的芽變材料鑒定中缺乏高通量的SSR鑒定技術(shù)方法，本研究在二代測(cè)序基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一套用于鑒別柑橘芽變的Target SSR-seq分析方法和技術(shù)流程?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)二代測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)用于柑橘資源及芽變材料鑒定的SSR引物，借助MiniSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)60份柑橘材料進(jìn)行Target SSR-seq分析，找到能夠高效區(qū)分芽變材料的引物以及變異位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及DNA提取

供試材料來(lái)自于重慶北碚國(guó)家果樹(shù)種質(zhì)重慶柑橘資源圃（表1）。于2020年8月初采集芽變品種幼嫩葉片，同時(shí)采集普通品種作為對(duì)照。葉片樣品使用75%酒精擦拭清洗，殘余酒精自然揮發(fā)；通過(guò)改良CTAB法提取植物組織DNA[13]，使用NanodropND-1000核酸濃度檢測(cè)儀和1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA濃度與純度。

表1 60個(gè)測(cè)序樣品信息

1.2 SSR分子標(biāo)記引物設(shè)計(jì)及電泳檢測(cè)

為設(shè)計(jì)出具有高效鑒別芽變資源能力的SSR引物，本研究通過(guò)GMATA[14]軟件掃描預(yù)測(cè)‘克里曼丁’‘溫州蜜柑’全基因組中SSR位點(diǎn)并提取側(cè)翼15 bp序列，使用cd-hit（https://github.com/Y-Lammers/ CD- HIT-Filter）去除冗余重復(fù)序列。以相同方式對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中不同地區(qū)、不同栽培品種的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR預(yù)測(cè)。通過(guò)cd-hit對(duì)二者序列聚類(lèi)，編寫(xiě)python3.8程序（源代碼見(jiàn)附錄）選取聚類(lèi)數(shù)較高的位點(diǎn)用于引物設(shè)計(jì)。這些位點(diǎn)被認(rèn)為是柑橘中易突變的SSR位點(diǎn)。設(shè)計(jì)流程見(jiàn)圖1。

根據(jù)獲得的SSRs側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)采用Primer 3軟件進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)引物77對(duì)，引物長(zhǎng)度為18—22 bp，引物Tm值為60—65℃。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括100 ng DNA模板、10 μL 2×Hieff Canace? Gold PCR Master Mix 高保真酶預(yù)混液和1 μL的SSR引物，PCR條件為：98℃ 5 min；98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min延伸。反應(yīng)產(chǎn)物利用10%聚丙烯凝膠電泳后，銀染顯色進(jìn)行觀測(cè)。

1.3 Multiplex PCR設(shè)計(jì)及Target SSR-seq文庫(kù)構(gòu)建

1.3.1 Multiplex PCR設(shè)計(jì) 通過(guò)在線(xiàn)工具M(jìn)ultiple Primer Analyzer分析引物間互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。分析時(shí)除調(diào)整參數(shù)“Value of the sensivity for dimmer detection”外，其余參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)。通過(guò)改變對(duì)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的敏感度，可以得到不同的引物分組情況。敏感度數(shù)值越小，對(duì)引物間互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)越靈敏，引物最少分組越多。使用python3.8程序，根據(jù)DFS算法[15]及貪心算法[16]原理設(shè)計(jì)腳本將不具有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的引物分為一組。

Multiplex PCR反應(yīng)體系中包括150 ng DNA模板、每種引物各1 μL、10 μL 2×Hieff Canace? Gold PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液、使用ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。PCR條件為：98℃ 3 min；98℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。

圖1 SSR引物設(shè)計(jì)流程圖

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建 通過(guò)Multiplex PCR對(duì)芽變資源進(jìn)行靶位點(diǎn)SSR的擴(kuò)增。使用PCR產(chǎn)物小量回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物使用MaxUp II DNA Library Prep Kit for Illumina建庫(kù)試劑盒建庫(kù)，主要步驟包括為PCR產(chǎn)物3′端添加A尾的末端修復(fù)反應(yīng)、為產(chǎn)物添加用于Illumina Miniseq平臺(tái)的測(cè)序接頭，DNA clean beads純化、為每個(gè)樣品添加特異標(biāo)簽的Index Primer PCR反應(yīng)，DNA clean beads純化，文庫(kù)定量。構(gòu)建完成的文庫(kù)在Illumina Miniseq測(cè)序儀上完成測(cè)序。

1.4 Target SSR-seq測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

下機(jī)數(shù)據(jù)通過(guò)bcl2fastq軟件按1.3.2添加的樣品標(biāo)簽分離并保存為fastq格式。原始的fastq序列通過(guò)fastp[17]（http://opengene.org/fastp/fastp）軟件進(jìn)行質(zhì)量控制得到clean reads。使用bwa[18]將clean reads比對(duì)至參考基因組Cclementina_182_v1（https://data.jgi.doe. gov/refine-download/phytozome?organism=Cclementina&expanded=182）得到sam文件。使用samtools[19]將sam文件轉(zhuǎn)為bam文件并排序。排序后的bam文件通過(guò)GATK4[20]執(zhí)行SNPcalling，得到vcf文件。使用GATK VariantFiltration對(duì)vcf文件過(guò)濾，過(guò)濾條件為QD<2.0、QUAL<30.0、FS>60.0、MQ<40.0。使用bcftools將所有過(guò)濾后的vcf文件合并后通過(guò)VCF2Dis工具（https://github.com/BGI-shenzhen/VCF2Dis）計(jì)算p-distance以獲取遺傳距離矩陣。使用R包ape[21]對(duì)p-distance矩陣進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果使用ggplot2[22]進(jìn)行可視化。

1.5 變異位點(diǎn)驗(yàn)證

在分析的結(jié)果中隨機(jī)選擇位點(diǎn)，在位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)巢式PCR[23]，PCR程序與SSR程序相同，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)10% PAGE電泳檢測(cè)。驗(yàn)證引物見(jiàn)表2。

表2 位點(diǎn)驗(yàn)證引物

2 結(jié)果

2.1 芽變資源的SSR檢測(cè)

根據(jù)‘溫州蜜柑’和‘克里曼丁’的易突變位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)出77對(duì)引物（表3）。通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)這些引物對(duì)‘溫州蜜柑’‘沃柑’‘冰糖橙’‘塔羅科血橙’以及‘椪柑’的芽變具有較好的鑒別能力。圖2所示為使用32號(hào)引物對(duì)11個(gè)‘沃柑’芽變及雜交資源的擴(kuò)增帶型，能夠有效區(qū)分‘沃柑’雜種和‘少核沃柑’。

2.2 Multiplex PCR優(yōu)化

為了直觀通過(guò)電泳圖譜來(lái)鑒定芽變資源，采用Multiplex PCR來(lái)提高芽變資源間的多態(tài)性，并為方便建庫(kù)，使用Multiple Primer Analyzer對(duì)引物間互補(bǔ)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敏感度設(shè)置為默認(rèn)值3時(shí)，可將77對(duì)引物分為9組；當(dāng)敏感度設(shè)置為2時(shí)，可將77對(duì)引物分為18組；當(dāng)敏感度設(shè)置為1時(shí)，可將77對(duì)引物分為43組。當(dāng)敏感的設(shè)為1時(shí)，由于分組數(shù)過(guò)多，失去了Multiplex PCR的意義。分別使用基于兩種靈敏度分組的引物對(duì)3個(gè)‘沃柑’進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)基于敏感度3進(jìn)行設(shè)計(jì)引物分組，擴(kuò)增條帶過(guò)多以至于無(wú)法看清條帶，其帶型如圖3所示。其中組合Ⅰ、組合Ⅱ基于敏感度3進(jìn)行分組，組合Ⅲ、組合Ⅳ基于敏感度2進(jìn)行分組（組合Ⅰ引物：20、22、31、37、38、39、51、58、69；組合Ⅱ引物：46、54、70；組合Ⅲ引物：20、31、39；組合Ⅳ引物：37、58、69）。當(dāng)引物分組基于敏感度2進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，PCR后可得到清晰的條帶。使用python腳本對(duì)77對(duì)引物進(jìn)行分組，最少可分為18組，每組包含3—6對(duì)引物。Multiplex PCR使傳統(tǒng)電泳方式鑒別柑橘芽變能力得到提升，如圖4所示，可將‘無(wú)核沃柑10號(hào)’與其他‘無(wú)核沃柑’區(qū)分開(kāi)，將‘有核沃柑’與‘少核沃柑’及‘無(wú)核沃柑’區(qū)分開(kāi)。

表3 本研究使用的SSR引物序列

續(xù)表3 Continued table 3

圖2 32號(hào)引物擴(kuò)增不同‘沃柑’品種帶型圖

圖3 基于兩種靈敏度分組的引物對(duì)3個(gè)‘沃柑’的擴(kuò)增效果

2.3 Target SSR-seq數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)選取6個(gè)類(lèi)群共計(jì)60個(gè)柑橘資源進(jìn)行Target SSR-seq測(cè)序（表1）。使用77對(duì)SSR引物進(jìn)行Multiplex PCR以構(gòu)建文庫(kù)，文庫(kù)在Illumina Miniseq平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序總數(shù)據(jù)量為2.72 G，平均每個(gè)資源45.33 M，共35.97 M條reads，Q20=90.90%，Q30= 88.79%，GC含量正常。使用fastp軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)過(guò)濾，去除低質(zhì)量reads。過(guò)濾后總數(shù)據(jù)2.52 G，平均每個(gè)資源42.00 M，共33.75 M條reads，Q20=92.68%，Q30=90.73%。

2.3.1 對(duì)不同柑橘芽變資源的鑒別能力 為了更加直觀地了解Target-SSR測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)不同柑橘種質(zhì)資源的區(qū)分能力，進(jìn)行PCoA分析。由結(jié)果可知，Target SSR-seq將60份柑橘材料分為甜橙與寬皮柑橘兩個(gè)園藝種，在寬皮柑橘中可細(xì)分為‘沃柑’‘椪柑’以及雜柑等栽培種，表明Target SSR-seq對(duì)柑橘屬中的園藝種具有良好的種間區(qū)分能力，與傳統(tǒng)SSR的分類(lèi)結(jié)果一致（圖5）。當(dāng)關(guān)注芽變資源時(shí)，可發(fā)現(xiàn)資源之間較為分散，表明該方法在種內(nèi)芽變資源間也具備一定的區(qū)分能力。

該Multiplex PCR所使用引物為mk16、mk23、mk53

圖5 不同組樣品的PCoA分析

2.3.2 柑橘芽變資源間的SSR變異位點(diǎn) 為了便于分析各資源之間的基因型差異，使用GATK SelectVariants[24]工具提取indels位點(diǎn)，對(duì)提取的indels位點(diǎn)使用vcflib工具[25]篩選出50 bp以上位點(diǎn)。以各資源indels位點(diǎn)坐標(biāo)為對(duì)象，通過(guò)TBtools[26]繪制韋恩圖得到不同資源indels位點(diǎn)數(shù)量差異（以‘溫州蜜柑’為例，圖6）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)不同資源之間存在大量的indel差異位點(diǎn)。

韋恩圖根據(jù)在某一位點(diǎn)相較于參考基因組是否存在變異繪制，圖中數(shù)字表示為某幾個(gè)資源之間共有的變異位點(diǎn)的數(shù)量

對(duì)篩選出的位點(diǎn)，使用bcftools排序、建立索引后，使用bcftools isec[27]工具對(duì)各個(gè)樣品位點(diǎn)求并集，利用Python編寫(xiě)程序去除交集，所得差集位點(diǎn)即為indel差異位點(diǎn)。將結(jié)果導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選出SSR位點(diǎn)。在7個(gè)‘塔羅科’血橙芽變中發(fā)現(xiàn)11個(gè)SSR變異位點(diǎn)，2個(gè)‘五月紅’芽變中發(fā)現(xiàn)8個(gè)SSR變異位點(diǎn)，5個(gè)臍橙樣品中發(fā)現(xiàn)8個(gè)SSR變異位點(diǎn)，9個(gè)‘冰糖橙’品種中發(fā)現(xiàn)16個(gè)SSR變異位點(diǎn)，2個(gè)‘砂糖橘’芽變中發(fā)現(xiàn)9個(gè)SSR變異位點(diǎn)，4個(gè)‘溫州蜜柑’芽變中發(fā)現(xiàn)15個(gè)芽變位點(diǎn)，8個(gè)‘沃柑’芽變中發(fā)現(xiàn)21個(gè)SSR變異位點(diǎn)，在‘沃柑’雜交品種中發(fā)現(xiàn)11個(gè)SSR變異位點(diǎn)，在‘椪柑’中發(fā)現(xiàn)14個(gè)SSR變異位點(diǎn)。在SSR位點(diǎn)變異中，‘塔羅科’血橙以ATT基序最多，‘五月紅’以TAA基序最多，臍橙以TAA基序最多，‘冰糖橙’以GA基序最多，‘砂糖橘’以AAT基序最多，‘溫州蜜柑’以AAT基序最多，‘沃柑’芽變資源以AAT基序最多，‘沃柑’雜交資源以TAA、GA基序最多。通過(guò)查看擴(kuò)增產(chǎn)物引物發(fā)現(xiàn)，除目標(biāo)位點(diǎn)外，引物交叉擴(kuò)增也提供了一些SSR位點(diǎn)，這部分位點(diǎn)中也存在一定程度的變異（表4）。

2.3.3 SSR變異位點(diǎn)驗(yàn)證 為了檢驗(yàn)測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)來(lái)自于‘冰糖橙’‘沃柑’中的2個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行巢式PCR驗(yàn)證，位點(diǎn)信息見(jiàn)表5。獲得指紋身份證，其中電泳結(jié)果顯示與分析結(jié)果一致，如圖7所示。

3 討論

3.1 柑橘芽變鑒定的方法

芽變的鑒定對(duì)柑橘新品種選育具有重要的意義。在柑橘及果樹(shù)的選育種過(guò)程中，通常選擇發(fā)生芽變的枝條進(jìn)行無(wú)性繁殖，可以選育成優(yōu)新品種。在對(duì)芽變資源進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，一般將其與親本材料進(jìn)行分子標(biāo)記的比較，從而確定材料是否發(fā)生變異[28]。然而AFLP、SSR、SRAP、RAPD、LTR等傳統(tǒng)的分子標(biāo)記并非專(zhuān)為芽變鑒定而設(shè)計(jì)[1,3,12]，因此，在柑橘的芽變鑒定中能力不足，常常無(wú)法將芽變品種區(qū)分開(kāi)。本研究的特點(diǎn)是從大量測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)掘變異程度高的位點(diǎn)，以這些高變異位點(diǎn)為著力點(diǎn)，有針對(duì)性地設(shè)計(jì)用以芽變鑒定的SSR引物；為提高鑒別效率，以引物互補(bǔ)結(jié)構(gòu)為限制條件對(duì)引物進(jìn)行分組，開(kāi)發(fā)MPCR方法；以這些位點(diǎn)為T(mén)arget SSR，對(duì)60份柑橘資源進(jìn)行建庫(kù)并在Miniseq平臺(tái)完成高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法完成對(duì)資源的快速鑒別，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)可便捷地篩選出SSR變異位點(diǎn)。

表4 在不同品系資源中可擴(kuò)增具有SSR位點(diǎn)差異的引物

續(xù)表4 Continued table 4　

表5 SSR驗(yàn)證位點(diǎn)信息

變異信息INFO表示序列變異在各個(gè)樣品中的存在情況，每一位數(shù)字代表一個(gè)樣品，在‘冰糖橙’中第1—5位分別為‘錦秀冰糖橙’‘錦紅大果冰糖橙’‘錦紅最紅冰糖橙’‘錦玉冰糖橙’‘橢圓冰糖橙’；在‘沃柑’中，第1—5位分別為‘皺皮沃柑’‘武鳴沃柑’‘有核沃柑’‘少核沃柑’‘無(wú)核沃柑’；“0”表示變異在該樣品中不存在，“1”表示變異在該樣品中存在

The variation information "INFO" represents the existence of sequence mutations in each sample. Each number represents a sample. The first to fifth in Bing Tang Cheng is Jin Xiu Bing Tang Cheng, Jin Hong Da Guo Bing Tang Cheng, Jin Hong Zui Hong Bing Tang Cheng, Jin Yu Bing Tang Cheng, Tuo Yuan Bing Tang Cheng. The first to fifth in Orah is Wrinkle Orah, Wu Ming Orah, Orah, Seedless Orah, Orri. “0” means that the mutation does not exist in the sample, and “1” means that the mutation exists in the sample

圖7 表5中SSR位點(diǎn)驗(yàn)證

本研究使用GMATA、cd-hit以及python程序?qū)Α死锫　汀疁刂菝鄹獭蚪M數(shù)據(jù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)的‘溫州蜜柑’核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，篩選出變異較高的多態(tài)位點(diǎn)用于引物設(shè)計(jì)，這些位點(diǎn)可以認(rèn)為在遺傳過(guò)程中不穩(wěn)定，容易發(fā)生變異。利用這些位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)柑橘資源設(shè)計(jì)引物進(jìn)行電泳分析，對(duì)于雜交品種的具有外源基因滲入的種質(zhì)具有較好的分別能力，對(duì)芽變品種也具有鑒別能力，通過(guò)Multiplex PCR后鑒別能力有所提升。通過(guò)NGS技術(shù)同時(shí)對(duì)大量SSR位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，避免了傳統(tǒng)電泳通量低、精度差、工序繁等弊端，在測(cè)得SSR變異的同時(shí)，也獲得了大量的SNP變異和indel變異，在60份柑橘資源平均檢測(cè)到2 004個(gè)SNPs變異，136個(gè)indels變異，其中‘清見(jiàn)’中檢測(cè)到的SNPs最少，為1 107個(gè)，‘無(wú)核沃柑’中檢測(cè)到SNPs最多，為4 405個(gè)，‘冰糖橙仁5’中檢測(cè)到indels最少，為55個(gè)，在‘無(wú)核沃柑’中檢測(cè)到indels最多為290個(gè)。大量的SNP、indels變異對(duì)芽變品種的鑒定提供了更多參考。

3.2 SSR-seq技術(shù)在植物種質(zhì)遺傳多樣性研究中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得短時(shí)間內(nèi)對(duì)大批量SSR位點(diǎn)進(jìn)行基因分型成為可能。Li等[10]通過(guò)AmpSeq- SSR技術(shù)對(duì)NY/T 1433-3014標(biāo)準(zhǔn)中的48個(gè)SSR位點(diǎn)和從粳稻參考基因組中隨機(jī)選擇的3 057個(gè)SSR位點(diǎn)進(jìn)行了高通量測(cè)序，以構(gòu)建8個(gè)水稻品種的指紋圖譜。AmpliSeq技術(shù)利用多重PCR，可通過(guò)一次PCR對(duì)上百萬(wàn)個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向測(cè)序并在24 h內(nèi)完成建庫(kù)測(cè)序，具有操作簡(jiǎn)便、高效快捷的特點(diǎn)；但由于目前AmpliSeq技術(shù)商業(yè)化程度高，導(dǎo)致單個(gè)樣品檢測(cè)成本高，因此，AmpSeq-SSR技術(shù)僅適用于少量樣本的大批量位點(diǎn)檢測(cè)，而不適用于大量樣本的檢測(cè)。?arhanová等[9]通過(guò)58對(duì)引物對(duì)南美洲南部的3種被子植物物種共計(jì)859個(gè)樣本進(jìn)行SSR-seq，認(rèn)為SSR基因座的測(cè)序是一種前瞻性方法，能夠檢測(cè)種內(nèi)和種間水平的變異。Yang等[8]使用GMATA軟件對(duì)黃瓜全基因組數(shù)據(jù)以及182個(gè)黃瓜種質(zhì)的重測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR位點(diǎn)預(yù)測(cè)，通過(guò)對(duì)基序數(shù)量、PIC值等限定條件篩選出91個(gè)Target SSR位點(diǎn)以及NY/T 2474-2013標(biāo)準(zhǔn)中的31個(gè)位點(diǎn)，通過(guò)定制的多重PCR panel擴(kuò)增后建庫(kù)測(cè)序，對(duì)382個(gè)黃瓜品種進(jìn)行基因分型，將其確定為4個(gè)種群。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上，創(chuàng)新使用生物信息學(xué)分析篩選出柑橘資源中高度變異SSR位點(diǎn)，通過(guò)多路復(fù)用PCR[16,29-33]對(duì)60份柑橘資源進(jìn)行建庫(kù)，大大提高了建庫(kù)測(cè)序的效率。在一周之內(nèi)即可完成從PCR到測(cè)序結(jié)果分析的全部流程，極大地提高了鑒別效率。通過(guò)對(duì)60份柑橘資源進(jìn)行Target SSR-seq，能夠?qū)①Y源區(qū)分為甜橙、寬皮柑橘兩個(gè)種，寬皮柑橘內(nèi)可分為‘沃柑’‘椪柑’、雜柑3個(gè)栽培種，對(duì)于芽變材料也能較好地區(qū)分。在所篩選出的變異位點(diǎn)中，多為復(fù)等位變異，表明這些位點(diǎn)在遺傳進(jìn)化中容易發(fā)生變異，在以后的芽變研究中可以多加關(guān)注。除SSR變異外，在所研究的位點(diǎn)中也發(fā)現(xiàn)了大量的indels突變與SNP變異，為芽變資源的區(qū)分提供了更多的信息，而這些信息很難通過(guò)傳統(tǒng)電泳方式得以利用[9]。值得注意的是，在對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析時(shí)，還發(fā)現(xiàn)有少部分變異位點(diǎn)并非由最初設(shè)計(jì)而來(lái)，而是由于在MPCR過(guò)程中發(fā)生了引物交叉擴(kuò)增產(chǎn)生，在這些位點(diǎn)中同樣存在著SNP、indels和SSR變異，這說(shuō)明在MPCR時(shí)，會(huì)對(duì)更多的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，這些位點(diǎn)的存在使得檢測(cè)范圍擴(kuò)大，為芽變的分析提供了更多的參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一套使用Target SSR-seq技術(shù)進(jìn)行柑橘芽變鑒定的試驗(yàn)分析方法。從全基因組序列以及大量測(cè)序數(shù)據(jù)中發(fā)掘高變異位點(diǎn)用以芽變鑒定的研究。使用python編寫(xiě)了引物分組程序用以MPCR，極大地提高了電泳檢測(cè)效率以及建庫(kù)速度。文庫(kù)經(jīng)過(guò)MiniSeq平臺(tái)完成高通量測(cè)序并使用GATK分析流程得到變異位點(diǎn)。對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行PCoA分析后可快速完成對(duì)資源的鑒定。使用bcftools結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)，可快速篩選出差異位點(diǎn)。該分析流程操作簡(jiǎn)單，適合對(duì)大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。使用該方法，對(duì)60份柑橘芽變資源進(jìn)行鑒定，在種間鑒定效果好，種內(nèi)鑒別也有較好的效果。在后續(xù)的研究中，可將位點(diǎn)與性狀相關(guān)聯(lián)，在芽變鑒定、遺傳資源研究中發(fā)揮更大的作用。

[1] EL ZAYAT M A S, Hassan A H, Nishawy E, Ali M, Amar M H. Patterns of genetic structure and evidence of Egyptian Citrus rootstock based on informative SSR, LTR-IRAP and LTR-REMAP molecular markers. Journal of Genetic Engineering Biotechnology, 2021, 19(1): 1-14.

[2] KUMAR J P T, THIRUGNANAVEL A, UPADHYAY D Y, KAMDE S A, JALAMKAR P R, MURKUTE A A. Genetic diversity and population structure of sweet orange [sinensis (L.) Osbeck] germplasm of India revealed by SSR and InDel markers. bioRxiv, 2022. doi: 10.1101/2022.01.11.475964. doi: 10.1101/2022.01.11. 475964.

[3] Woo J K, Yun S H, Yi K U, Park Y C, Lee H Y, Kim M, Lee Y, Song K J, Kim H B. Identification of citrus varieties bred in Korea using microsatellite markers. Horticultural Science and Technology, 2020, 38(3): 374-384.

[4] JIN S B, KIM H B, PARK S, KIM M J, CHOI C W, YUN S H. Identification of the ‘haryejosaeng’ mandarin cultivar by multiplex PCR-based SNP genotyping. Molecular Biology Reports, 2020, 47(11): 8385-8395. doi: 10.1007/s11033-020-05850-4.

[5] 張紹陽(yáng), 孫崇德, 徐昌杰, 陳昆松. 基于S-SAP標(biāo)記技術(shù)的柑橘芽變新品系青甌柑的鑒別. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(8): 21-25.

ZHANG S Y, SUN C D, XU C J, CHEN K S. Identification of greenreticulate(a new bud mutation line of)based on S-SAP marker technique. Guizhou Agricultural Sciences, 201(8): 21-25. (in Chinese)

[6] 張文, 胡威, 張新宇, 周敏, 蔣巧巧, 鄧子牛, 李大志. 利用胚搶救技術(shù)獲得沙田柚×枸櫞雜交后代及其SRAP檢測(cè). 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2013, 30(3): 386-389.

ZHANG W, HU W, ZHANG X Y, ZHOU M, JIANG Q Q, DENG Z N, LI D Z. Acquisition of hybrids of Pummelo × Citron by using embryo rescue and their identification by SRAP molecular markers. Journal of Fruit science 2013, 30(3): 386-389. (in Chinese)

[7] TóTH G, GáSPáRI Z, JURKA J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis. Genome Research, 2000, 10(7): 967-981. doi: 10.1101/gr.10.7.967.

[8] Yang J j, Zhang J, Han R x, Zhang F, Mao A j, Luo J, Dong B b, Liu H, Tang H, Zhang J a, wen c l. Target SSR-Seq: A novel SSR genotyping technology associate with perfect SSRs in genetic analysis of cucumber varieties. Frontiers in Plant Science, 2019, 10: 531.

[9] ?ARHANOVá P, PFANZELT S, BRANDT R, HIMMELBACH A, BLATTNER F R. SSR-seq: Genotyping of microsatellites using next-generation sequencing reveals higher level of polymorphism as compared to traditional fragment size scoring. Ecology and Evolution, 2018, 8(22): 10817-10833. doi:10.1002/ece3.4533.

[10] LI L, FANG Z W, ZHOU J F, CHEN H, HU Z F, GAO L F, CHEN L H, REN S, MA H Y, LU L, ZHANG W X, PENG H. An accurate and efficient method for large-scale SSR genotyping and applications. Nucleic Acids Research, 2017, 45(10): e88. doi: 10.1093/nar/gkx093.

[11] Li H, Ma Y s, Pei F y, Zhang H y, Liu J c, Jiang M. Large- scale advances in SSR markers with high-throughput sequencing inSteud. Electronic Journal of Biotechnology, 2021, 49: 50-55.

[12] 胡冬梅, 江東, 李永平, 彭磊, 李冬云, 朱延松, 楊云光. 利用Target SSR-seq技術(shù)鑒定溫州蜜柑芽變材料. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54(23): 5083-5096.

HU D M, JIANG D, LI Y P, PENG L, LI D Y, ZHU Y S, YANG Y G. Identification of bud sport mutation ofby target SSR-seq technology. Scientia Agricultura Sinica, 2021, 54(23): 5083-5096. (in Chinese)

[13] 張亞飛. 柑橘種質(zhì)資源5個(gè)性狀的多樣性研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2020.

ZHANG Y F. Genetic Diversity Assessment of 5 Traits in Citrus Germplasm Resources [D]. Chongqing: Southwest University, 2020. (in Chinese)

[14] Wang X w, Wang L. GMATA: An integrated software package for genome-scale SSR mining, marker development and viewing. Frontiers in Plant Science, 2016, 7: 1350.

[15] Tarjan R. Depth-first search and linear graph algorithms. SIAM Journal on Computing, 1972, 1(2): 146-160.

[16] SHEN Z Y, QU W B, WANG W, LU Y M, WU Y H, LI Z F, HANG X Y, WANG X L, ZHAO D S, ZHANG C G. MPprimer: A program for reliable multiplex PCR primer design. BMC Bioinformatics, 2010, 11: 143. doi: 10.1186/1471-2105-11-143.

[17] CHEN S F, ZHOU Y Q, CHEN Y R, GU J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics, 2018, 34(17): i884-i890. doi: 10.1093/bioinformatics/bty560.

[18] LI H, DURBIN R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics, 2009, 25(14): 1754-1760. doi:10.1093/bioinformatics/btp324.

[19] LI H, HANDSAKER B, WYSOKER A, FENNELL T, RUAN J, HOMER N, MARTH G, ABECASIS G, DURBIN R, 1000 Genome Project Data Processing Subgroup. The sequence alignment/map format and SAMtools. Microbiology Spectrum, 2009, 25(16): 2078-2079. doi: 10.1093/bioinformatics/btp352.

[20] MCKENNA A, HANNA M, BANKS E, SIVACHENKO A, CIBULSKIS K, KERNYTSKY A, GARIMELLA K, ALTSHULER D, GABRIEL S, DALY M, DEPRISTO M A. The Genome Analysis Toolkit: A MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Cell Reports, 2010, 20(9): 1297-1303. doi: 10.1101/ gr.107524.110.

[21] PARADIS E, CLAUDE J, STRIMMER K. APE: Analyses of phylogenetics and evolution in R language. Bioinformatics, 2004, 20(2): 289-290. doi: 10.1093/bioinformatics/btg412.

[22] Wickham H. ggplot2. Springer New York, 2011, 3(2): 180-185.

[23] FOO P C, NURUL NAJIAN A B, MUHAMAD N A, AHAMAD M, MOHAMED M, YEAN YEAN C, LIM B H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction as viable PCR substitute for diagnostic applications: a comparative analysis study of LAMP, conventional PCR, nested PCR (nPCR) and real-time PCR (qPCR) based onDNA derived from faecal sample. BMC Biotechnology, 2020, 20(1): 34. doi: 10.1186/s12896-020- 00629-8.

[24] TOPTA? B ?, RAKOCEVIC G, KóMáR P, KURAL D. Comparing complex variants in family trios. Bioinformatics, 2018, 34(24): 4241-4247. doi: 10.1093/bioinformatics/bty443.

[25] GARRISON E, KRONENBERG Z N, DAWSON E T, PEDERSEN B S, PRINS P. Vcflib and tools for processing the VCF variant call format. bioRxiv, 2021. doi: 10.1101/2021.05.21.445151.

[26] CHEN C j, CHEN H, ZHANG Y, THOMAS H R, FRANK M H, HE Y h, XIA R. TBtools: An integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data. Molecular Plant, 2020, 13(8): 1194-1202. doi: 10.1016/j.molp.2020.06.009.

[27] PALANDE V, SIEGAL T, DETROJA R, GOROHOVSKI A, GLASS R, FLUEH C, KANNER A A, LAVIV Y, HAR-NOF S, LEVY- BARDA A, VIVIANA KARPUJ M, KURTZ M, PEREZ S, RAVIV SHAY D, FRENKEL-MORGENSTERN M. Detection of gene mutations and gene-gene fusions in circulating cell-free DNA of glioblastoma patients: An avenue for clinically relevant diagnostic analysis. Molecular Oncology, 2022, 16(10): 2098-2114. doi: 10.1002/ 1878-0261.13157.

[28] 鄧秀新, 彭抒昂. 柑橘學(xué).北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2013.

DENG X X, Peng S A. Citrology. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)

[29] RACHLIN J, DING C M, CANTOR C, KASIF S. MuPlex: Multi-objective multiplex PCR assay design. Nucleic Acids Research, 2005, 33: W544-W547. doi: 10.1093/nar/gki377.

[30] YAMADA T, SOMA H, MORISHITA S. PrimerStation: a highly specific multiplex genomic PCR primer design server for the human genome. Nucleic Acids Research, 2006, 34(Suppl. 2): W665-W669. doi: 10.1093/nar/gkl297.

[31] YOU F M, HUO N, GU Y Q, LUO M C, MA Y, HANE D, LAZO G R, DVORAK J, ANDERSON O D. BatchPrimer3: a high throughput web application for PCR and sequencing primer design. BMC Bioinformatics, 2008, 9: 253. doi: 10.1186/1471-2105-9-253.

[32] KAPLINSKI L, ANDRESON R, PUURAND T, REMM M. MultiPLX: automatic grouping and evaluation of PCR primers. Bioinformatics, 2004, 21(8): 1701-1702. doi: 10.1093/bioinformatics/ bti219.

[33] 王亞恒. 應(yīng)用于靶向測(cè)序的多重PCR引物設(shè)計(jì)系統(tǒng)[D]. 上海: 東華大學(xué), 2018.

WANG Y H. A multiplex PCR primers designing system for targeted sequencing [D]. Shanghai: Donghua University, 2018. (in Chinese)

Identification of 60 Citrus Accessions Using Target SSR-seq Technology

ZHU YanSong1, ZHANG YaFei1, CHENG Li1, YANG ShengNan1, ZHAO WanTong1,2, JIANG Dong1,2

1Citrus Research Institute of Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing400712

【Background】Bud sports mutation is a DNA mutation occurred in somatic meristem, and it often displays visible morphological and other characteristic changes different from its mother plants in branches, leaves, flowers and fruits. However, the discriminating bud sports mutation from the epigenetic variation caused by environmental conditions and cultivation measures etc. external factors was still mostly depended on the molecular fingerprint detection. 【Objective】This study objective was to identify citrus bud sports mutant through Target-SSR sequencing technology.【Method】Firstly, the genome of clementine mandarin (Blanco) and satsuma (Macf.), as well as GSS and EST sequences of satsuma were used to scan SSRs loci with GMATA, and the highly polymorphic SSRs loci were screened out to design primers. The multiplex PCR with optimized primers were ampllified on 60 citrus bud sports mutants to construct high-thoughout sequencing library, and the amplification products were then sequenced on illumina Minseq platform. The clean sequencing short reads were mapped to reference target sequences to find differentiated SSRs loci presented in citrus bud sports mutants.【Result】 A total of 77 pairs of SSR primers were designed from highly polymorphic SSRs loci. The primer pair combinations were optimized and 18 multiplex PCR amplification products were sequenced. The target SSR-seq analysis showed that the genotyping data of SSRs could divided 60 citrus accessions into two groups corresponding to sweet orange and mandarin, and the mandarin group could be further subdivided into different citrus cultivars, such as Orah, ponkan etc. 11 SSR loci containing mostly ATT motif were found in 7 Tarroco blood orange mutants, 8 SSR loci containing mostly TAA motif were found in 2 ‘Wu Yue Hong’ mutants and 5 navel orange, 16 SSR loci containing mostly GA motif were found in 9 Bing Tang Cheng mutants, 9 SSR loci containing mostly AAT motif were found in 2 Sha Tang Ju mutants, and 15 SSR loci with mostly AAT motif were found in 4 satsuma mutants. This study showed that Target-SSR sequencing technology provided an excellent resolving approach to discriminate citrus bud mutations.【Conclusion】In this study, an effective method for citrus bud mutant identification by using Target SSR-seq technology were established, and 60 citrus germplasm accessions could be discriminated. The precision and reliability of SSR genotyping information could be utilized in citrus germplasm resources management and variety intellectual property protection.

citrus; bud sports; Target SSR-seq

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.011

2022-02-24；

2022-05-23

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000101）、科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFD1001400）

朱延松，E-mail：2508308456@qq.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）