陳彧，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，郭赟，丁世杰，周光宏

豬肌肉干細(xì)胞在三維水凝膠中的分化研究

陳彧，朱浩哲，陳益春，劉政，丁希，郭赟，丁世杰，周光宏

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院/國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心/教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095

【目的】探究豬肌肉干細(xì)胞在三維水凝膠中的分化效果，為體外誘導(dǎo)肌肉干細(xì)胞分化成為肌肉組織提供方法指導(dǎo)?！痉椒ā繉⒁欢〝?shù)目的豬肌肉干細(xì)胞分別在二維和三維條件下誘導(dǎo)分化（二維條件指在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，三維條件指在水凝膠中培養(yǎng)細(xì)胞），分別收取增殖階段、預(yù)分化階段、分化初期、分化成熟、分化末期的二維培養(yǎng)細(xì)胞的RNA和蛋白樣品，以及分化7和14 d的三維培養(yǎng)細(xì)胞的RNA和蛋白樣品。利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在兩種條件下分化至不同階段時(shí)成肌相關(guān)基因、、、的表達(dá)水平；利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞在兩種條件下分化至不同階段時(shí)MYOG、MyHC蛋白的表達(dá)水平；利用免疫熒光染色技術(shù)觀察豬肌肉干細(xì)胞在二維和三維條件下融合形成的肌管；使用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)分化14 d培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸含量及組成?！窘Y(jié)果】二維培養(yǎng)的豬肌肉干細(xì)胞在分化第3天時(shí)開始發(fā)生肌融合，在分化第7天形成成熟肌管，隨后進(jìn)入分化末期，肌管開始脫落。三維培養(yǎng)的豬肌肉干細(xì)胞在分化第7天時(shí)還未完全伸展，細(xì)胞的和表達(dá)水平低；分化第14天時(shí)水凝膠內(nèi)已形成多核肌管，和表達(dá)達(dá)到二維分化水平。三維分化有利于終末分化基因和的表達(dá)，分化14 d時(shí)的表達(dá)量是二維分化7 d的12倍，的表達(dá)量是二維分化7 d的4倍，但是MyHC蛋白的表達(dá)量?jī)H為二維分化7 d時(shí)的1/6。氨基酸分析結(jié)果表明體外培養(yǎng)肌肉組織中17種水解氨基酸含量均低于豬肉，且必需氨基酸在總氨基酸的占比也低于豬肉，但是呈味氨基酸的占比相較豬肉更高。【結(jié)論】豬肌肉干細(xì)胞可以在三維膠原水凝膠中分化形成肌管，且三維條件有利于成肌分化相關(guān)基因表達(dá)，但要實(shí)現(xiàn)MyHC蛋白的高表達(dá)還需進(jìn)一步研究，按此方法體外培養(yǎng)的肌肉組織有較高的呈味氨基酸含量，可能會(huì)有較好的風(fēng)味。

豬肌肉干細(xì)胞；分化；水凝膠；肌管；細(xì)胞培養(yǎng)肉

0 引言

【研究意義】細(xì)胞培養(yǎng)肉是根據(jù)肌肉自我修復(fù)機(jī)理，通過動(dòng)物上提取的干細(xì)胞在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化形成肌纖維而生產(chǎn)的肉類，其無需通過動(dòng)物養(yǎng)殖，具有環(huán)保、節(jié)能、高效、安全等諸多潛在優(yōu)點(diǎn)[1]。肌肉干細(xì)胞是一種需要錨點(diǎn)的細(xì)胞，必須附著在一定基質(zhì)或者附著在支架上才能增殖分化[2]。因此，要實(shí)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞在體外分化形成肌肉組織，需要選用合適的支架對(duì)肌肉干細(xì)胞進(jìn)行三維培養(yǎng)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】細(xì)胞培養(yǎng)中常用天然水凝膠作為支架[3]，如膠原蛋白、血纖蛋白等，這樣的體系有利于肌細(xì)胞分化的融合和收縮[4]。早在1988年就有研究通過使用膠原對(duì)二維培養(yǎng)的禽類骨骼肌細(xì)胞分化形成的肌管進(jìn)行包被，將肌管的培養(yǎng)時(shí)間從5—6 d延長(zhǎng)至2—3周，實(shí)現(xiàn)了類似于三維培養(yǎng)的效果[5]。OKANO等[6]將C2C12小鼠成肌細(xì)胞和I型膠原混合注入毛細(xì)管模具中，構(gòu)建了一種桿狀的水凝膠體，經(jīng)過7 d的培養(yǎng)，得到了可觀察到多核肌管的肌肉組織。還有研究通過將多層三維水凝膠中培養(yǎng)的牛肌肉組織進(jìn)行堆疊，制作出了具有一定厚度的培養(yǎng)肉牛排[7]。除了水凝膠支架外，常見的可用于肌肉干細(xì)胞培養(yǎng)的支架還有明膠纖維支架[8]、植物蛋白支架[9]等，相關(guān)研究還報(bào)道了在脫去細(xì)胞的植物組織上進(jìn)行肌細(xì)胞的三維培養(yǎng)[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前的研究較多通過組織染色或免疫熒光染色觀察肌細(xì)胞融合后形成的肌管來表征肌肉干細(xì)胞在三維條件下的分化效果，但是這種方法不能較為準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)肌細(xì)胞的分化程度，且大部分關(guān)于肌細(xì)胞三維培養(yǎng)研究使用的細(xì)胞為小鼠成肌細(xì)胞C2C12，而生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)肉需要培養(yǎng)更符合人類食用習(xí)慣的物種的肌肉干細(xì)胞，如、雞、鴨、豬、牛、羊等畜禽類和魚類?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用一種基于膠原水凝膠用于豬肌肉干細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)體系，通過RT-qPCR、Western blot、免疫熒光染色的方法來表征豬肌肉干細(xì)胞在水凝膠中的分化水平，并與二維分化的細(xì)胞進(jìn)行對(duì)比以評(píng)價(jià)三維條件下的分化效果，為將來實(shí)現(xiàn)肌肉干細(xì)胞體外大規(guī)模分化生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)肉產(chǎn)品提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 七日齡幼豬，幼豬品種為約克夏豬，由蘇食集團(tuán)生豬養(yǎng)殖基地提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、F10培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、100×雙抗（PS）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、0.25%胰蛋白酶、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF），購于美國(guó)GIBCO公司；鼠尾I型膠原、Matrigel，購于美國(guó)CORNING公司；膠原酶D、消散酶II，購于美國(guó)Roche公司；濃鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉、甲醇、乙醇、曲拉通X-100，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫脂奶粉、Trizol、DMSO（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)），購于索萊寶公司；牛血清白蛋白（BSA）購于美國(guó)SIGMA公司；RIPA裂解液（強(qiáng)）、PMSF，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、SuperSignal? West Pico PLUS 化學(xué)發(fā)光底物，購于美國(guó)Thermo公司；ChamQ SYBR qPCR Master Mix（貨號(hào)Q311-02）、HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)（貨號(hào)R323-01），購于Vazyme公司；Loading buffer、彩虹預(yù)染蛋白Marker（10—250 kD）、Tris-MOPS-SDS電泳緩沖液、4%—20% SurePAGE?蛋白預(yù)制膠、免疫印跡PVDF膜、平衡液、轉(zhuǎn)膜液、TBST，購于南京金斯瑞生物科技有限公司；MyHC一抗（貨號(hào)：ab37484）、MYOG一抗（貨號(hào)：ab238027）購于Abcam公司；GAPDH一抗（貨號(hào)：MAB374）購于Millipore公司；鼠二抗（貨號(hào)：CW2333S）購于Cwbiotech公司；免疫熒光鼠二抗（貨號(hào)：A11005），購于美國(guó)Thermo公司；Antifade Mounting Medium with DAPI，購于Vector公司；鬼筆環(huán)肽購于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬肌肉干細(xì)胞的分離與分選 將剛屠宰幼豬在75%乙醇中浸泡消毒后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中，切取幼豬前后腿部的肌肉組織，并將其置于裝有DMEM的離心管中漂洗2—3 min。將漂洗后的肌肉組織轉(zhuǎn)移至盛有DMEM的培養(yǎng)皿中，用滅菌的手術(shù)剪將肌肉組織剪碎，并將剪碎后的肌肉組織收集至裝有DMEM的離心管中。向離心管中加入1/6體積的膠原酶D和消散酶II溶液（濃度均為10 mg?mL-1），混勻后反復(fù)抽吸肌肉組織，然后將離心管轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中孵育，每孵育15 min反復(fù)抽吸一次，直至溶液可順利通過30 mL帶針頭的注射器。加入5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基（15% FBS+84% F10+1% PS）和適量PBS稀釋酶解后的肌肉組織，并使用100 μm細(xì)胞濾器過濾溶液，濾液經(jīng)過800×離心5 min后吸除上清液取沉淀。向離心管中加入5 mL紅細(xì)胞裂解液重懸沉淀，裂解5 min后經(jīng)800×離心5 min后吸除上清液取沉淀，用PBS清洗沉淀1—2次。使用40 μm細(xì)胞濾器過濾，使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)濾液中細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照計(jì)數(shù)結(jié)果將單細(xì)胞以1×107的接種量接種至預(yù)裝有8 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中用于流式分選，剩余細(xì)胞經(jīng)過800×離心5 min后取細(xì)胞沉淀，按照1×106/mL凍存細(xì)胞。單細(xì)胞在培養(yǎng)的第2進(jìn)行流式分選，首先用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞并用基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)，300×離心5 min后收集細(xì)胞沉淀。用含1% BSA的PBS溶液稀釋的CD56-PE、CD29-488、CD31-APC、CD45-647熒光抗體1 mL重懸細(xì)胞，在冰上孵育30 min，300×離心5 min后用PBS溶液清洗2次，清洗后用300 μL含3%雙抗的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測(cè)（Aria II SORP 流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司），分選出CD56+、CD29-、CD31-、CD45-的豬肌肉干細(xì)胞為P0代細(xì)胞。

1.2.2 豬肌肉干細(xì)胞的體外增殖培養(yǎng) 復(fù)蘇P2代豬肌肉干細(xì)胞，以1.5×105的接種量接種細(xì)胞到預(yù)鋪了0.05%鼠尾I型膠原的10 cm培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿中預(yù)先加入8 mL增殖培養(yǎng)基（15% FBS+84% F10+1% PS，bFGF濃度5 ng?mL-1）。然后將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約40%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。傳代時(shí)先使用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，收集細(xì)胞并使用臺(tái)盼藍(lán)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目，然后按照1.5×105的接種量接種到新的預(yù)鋪膠原培養(yǎng)皿中。將細(xì)胞傳代至P5代并增殖至足夠數(shù)量，以P5代細(xì)胞作為研究對(duì)象。

1.2.3 豬肌肉干細(xì)胞的體外二維分化 將3×105的P5代豬肌肉干細(xì)胞接種到預(yù)鋪了0.02% Matrigel的3.5 cm培養(yǎng)皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿中預(yù)先加入2 mL增殖培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)皿放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d對(duì)細(xì)胞進(jìn)行換液。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約90%時(shí)更換為分化培養(yǎng)基（2% HS+97% DMEM+1% PS），每2 d進(jìn)行一次半換液。

1.2.4 豬肌肉干細(xì)胞的體外三維分化 用DMEM培養(yǎng)基將鼠尾I型膠原濃度稀釋到2 mg?mL-1，并用1 mol?L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)膠原pH至7.4。將9×106的P5代豬肌肉干細(xì)胞和1 800 μL膠原溶液，160 μL Matrigel混勻后接入定制的模具中，待其凝固后加入4 mL增殖培養(yǎng)基。然后將其放置在37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后將增殖培養(yǎng)基吸出更換為分化培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d進(jìn)行一次半換液。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)量 二維培養(yǎng)細(xì)胞直接使用Trizol裂解液裂解，三維培養(yǎng)細(xì)胞使用Trizol裂解液裂解，并用冷凍破碎儀破碎樣品。按照天根的培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒的操作流程提取樣品的總RNA，使用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度；使用Vazyme公司的HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑，按照技術(shù)說明書對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA；使用Vazyme公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑，按照技術(shù)說明書進(jìn)行qPCR反應(yīng)，使用2-△△CT方法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（基因及引物信息見表1）。

表1 RT-qPCR引物信息表

1.2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 二維培養(yǎng)細(xì)胞直接用RIPA裂解液（使用時(shí)加入1% PMSF）裂解細(xì)胞，三維培養(yǎng)細(xì)胞使用PIRA裂解液（使用時(shí)加入1% PMSF）裂解并使用冷凍破碎儀破碎樣品。將裂解后的樣品在12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后收集上清液，使用BCA試劑盒檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)濃度，并加入Loading buffer在95℃下加熱5 min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后通過快速濕轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，切取對(duì)應(yīng)蛋白分子量的條帶（MyHC：220 kD；MYOG：34 kD；GAPDH：36 kD）置于5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后4℃下孵育一抗14 h（一抗稀釋比例為1﹕1 000），室溫孵育二抗2 h（二抗稀釋比例為1﹕2 000），二抗孵育結(jié)束后顯影并拍照，使用Quantity one軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析。

1.2.7 免疫熒光染色觀察肌細(xì)胞的融合情況 二維培養(yǎng)樣品和三維培養(yǎng)樣品用PBS清洗干凈后均用4%多聚甲醛固定過夜，固定后的樣品用PBS清洗后，使用0.5% Triton X-100通透30 min，然后用5% BSA溶液封閉30 min，MyHC一抗孵育（一抗稀釋比例為1﹕800，4℃下孵育12 h）；二抗孵育（二抗稀釋比例為1﹕1 000，室溫避光孵育1 h）；F-actin染色（鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育20 min）；滴加含DAPI的防熒光猝滅劑，蓋上蓋玻片，在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.8 氨基酸組成分析 分別取適量的分化14 d三維培養(yǎng)肌肉和新鮮豬肉（取自豬背最長(zhǎng)?。┯陧斂掌恐?，加入3 mL的6 mol?L-1HCl，抽真空并通入氮?dú)?，?10℃水解23 h。將水解后的樣品稀釋到25 mL，取1 mL稀釋液進(jìn)行氮吹，吹至干燥后用1 mL的0.02 mol?L-1HCl復(fù)溶。復(fù)溶后過0.22 μm水相濾膜，將濾液收集至液相小瓶中，使用HITACHI-L8900氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)樣品的氨基酸組成和含量進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SAS軟件，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，使用GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每組試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，所有數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；圖中不同字母表示兩組數(shù)據(jù)平均值間存在顯著性差異（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 二維條件下豬肌肉干細(xì)胞不同分化階段的形態(tài)學(xué)觀察

在光學(xué)顯微鏡下觀察處于不同分化階段的豬肌肉干細(xì)胞，處于增殖期的豬肌肉干細(xì)胞，可觀察到其細(xì)胞形態(tài)主要為中間寬、兩端拉長(zhǎng)的梭形或者紡錘形，為干細(xì)胞的正常形態(tài)（增殖階段，圖1-A）；當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí)，細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模接觸（預(yù)分化階段，圖1-B），此階段開始誘導(dǎo)分化；分化第3天可觀察到細(xì)胞伸展更具方向性，并開始發(fā)生肌融合，能觀察到較為細(xì)小的肌管形成（分化初期，圖1-C）；分化第4天已經(jīng)能觀察到大面積肌融合的發(fā)生，開始生成較粗較長(zhǎng)的多核肌管（圖1-D）；分化第7天，肌細(xì)胞的融合程度達(dá)到最高，產(chǎn)生的肌管長(zhǎng)度和直徑都達(dá)到較高水平（分化成熟，圖1-E）；分化第8天，可以觀察到肌管已經(jīng)開始大面積地脫落并聚成團(tuán)狀漂浮在培養(yǎng)基中（分化末期，圖1-F）。

A：處于增殖期的豬肌肉干細(xì)胞（成肌細(xì)胞）；B：分化0 d（預(yù)分化）；C：分化3 d；D：分化4 d；E：分化7 d；F：分化8 d

2.2 三維培養(yǎng)肌肉組織在模具中的形態(tài)觀察

將豬肌肉干細(xì)胞和水凝膠預(yù)混后接入帶微柱的模具中培養(yǎng)，模具中的微柱會(huì)調(diào)控細(xì)胞定向排列，可以促進(jìn)細(xì)胞分化，對(duì)比分化0 d和分化7 d（圖2），可以觀察到模具中的水凝膠發(fā)生了明顯的收縮，具體表現(xiàn)為水凝膠的面積變小，支柱周邊的網(wǎng)孔面積增大，分化7—13 d（圖3），水凝膠面積無顯著變化。

2.3 豬肌肉干細(xì)胞分化至各階段的免疫熒光染色

對(duì)二維和三維培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，通過激光共聚焦顯微鏡來觀察其分化過程中肌管的成型。在二維培養(yǎng)中，可以觀察到處于增殖期的細(xì)胞多處于梭形或者紡錘形（圖4-A）；當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到預(yù)分化階段時(shí)，細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞間相互接觸但是排布無序（圖4-B）；當(dāng)?shù)竭_(dá)分化初期時(shí)，可觀察到肌細(xì)胞的排布具有一定的方向性，細(xì)胞形態(tài)細(xì)長(zhǎng)，相鄰的細(xì)胞開始融合，出現(xiàn)多核細(xì)胞（圖4-C）；肌細(xì)胞分化進(jìn)入成熟期后，可觀察到寬數(shù)十微米，可長(zhǎng)達(dá)數(shù)百微米的明顯的多核肌管結(jié)構(gòu)，多核肌管中的細(xì)胞核呈整齊的方向性排列，且MyHC蛋白信號(hào)強(qiáng)，其與肌管共定位（圖4-D）；這種多核肌管在分化末期仍能部分存在（圖4-E）。在三維培養(yǎng)至第7天時(shí)，可觀察到細(xì)胞大多為未伸展開的圓球形，無肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MyHC）表達(dá)（圖4-F），分化至第14天時(shí)大部分肌細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長(zhǎng)，部分細(xì)胞發(fā)生融合形成較為細(xì)長(zhǎng)的多核肌管，肌管直徑與二維培養(yǎng)下有較大差距，但是其中的細(xì)胞核和二維培養(yǎng)條件下一致呈方向性排列，MyHC蛋白有表達(dá)（圖4-G）。

A：分化0 d；B：分化7 d；C：分化13 d A: Differentiated for 0 day; B: Differentiated for 7 days; C: Differentiated for 13 days

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05). The same as below

以上結(jié)果表明，在膠原水凝膠中，豬肌肉干細(xì)胞可以分化并融合形成多核肌管，但是相比二維條件下細(xì)胞分化7 d就已產(chǎn)生成熟肌管，肌細(xì)胞在三維分化7 d時(shí)仍大部分呈球形，伸展程度較小，分化14 d時(shí)才可觀察到細(xì)胞融合產(chǎn)生的肌管，且肌管的直徑和長(zhǎng)度及細(xì)胞的融合程度相比二維培養(yǎng)都有較大差距，肌細(xì)胞整體的分化進(jìn)程較二維培養(yǎng)慢。

2.4 豬肌肉干細(xì)胞分化過程中各關(guān)鍵基因的表達(dá)變化

分別收取增殖期（Myoblast）、預(yù)分化期（pre-diff）、分化初期、分化成熟、分化末期的二維培養(yǎng)細(xì)胞RNA樣品以及分化7、14 d的三維培養(yǎng)細(xì)胞RNA樣品，通過RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)其成肌過程中關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MYOG）屬于MRFs家族，是成肌分化啟動(dòng)的標(biāo)志基因，對(duì)分化的進(jìn)行及肌管的形成起決定性的作用[13]，微囊蛋白-3（caveolin-3，CAV-3）是細(xì)胞膜上微囊的主要組成成分，其特異地表達(dá)于肌細(xì)胞中[14]，在肌細(xì)胞分化融合形成肌管的過程中起重要的作用，MyHC是肌細(xì)胞分化成熟產(chǎn)生的重要蛋白，是構(gòu)成肌原纖維的重要成分，MyHC-slow和MyHC-2a是其兩種亞型。結(jié)果顯示在二維培養(yǎng)過程中，的表達(dá)在細(xì)胞進(jìn)入分化初期時(shí)顯著上調(diào)，并在到達(dá)分化成熟期前一直維持在較高的表達(dá)水平，在分化進(jìn)入末期時(shí)表達(dá)顯著下調(diào)，在三維培養(yǎng)過程中，在分化7—14 d表達(dá)顯著上調(diào)，但在分化7 d時(shí)的表達(dá)相對(duì)較低，而分化14 d時(shí)表達(dá)量比二維分化初期更高。在二維分化的增殖期和預(yù)分化期基本不表達(dá)，在分化初期開始表達(dá)，并且在分化到末期表達(dá)開始下調(diào)，在三維分化7 d時(shí)已經(jīng)開始表達(dá)但表達(dá)量低于二維分化初期，分化14 d時(shí)的表達(dá)量與二維分化初期和成熟期水平相當(dāng)。二維分化中和都是在進(jìn)入分化初期后才開始表達(dá)，其中隨著分化的進(jìn)行顯著上調(diào)，在分化末期表達(dá)量較成熟期仍有顯著的提升，而的表達(dá)在分化初期到分化末期無顯著變化，在三維分化中，分化7 d時(shí)的表達(dá)量與同期的二維分化相比更高，的表達(dá)量與同期的二維分化相比無顯著性差異，三維分化14 d時(shí)的表達(dá)量是二維分化7 d的12倍，的表達(dá)量是二維分化7 d的4倍。

A：增殖期的豬肌肉干細(xì)胞（成肌細(xì)胞）；B：二維分化0 d；C：二維分化3 d；D：二維分化7 d；E：二維分化8 d；F：三維分化7 d；G：三維分化14 d

以上結(jié)果表明在三維水凝膠中，豬肌肉干細(xì)胞的分化進(jìn)程與二維分化培養(yǎng)存在一定的差異，其表現(xiàn)在和的上調(diào)較二維分化慢，但是和的表達(dá)量可以達(dá)到甚至高于同期的二維分化，且在進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間（14 d）的分化后其表達(dá)仍能顯著提升，說明在基因水平上，豬肌肉干細(xì)胞在三維水凝膠體系中可以促進(jìn)分化。

2.5 豬肌肉干細(xì)胞分化過程中各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化

分別收取增殖期、預(yù)分化期、分化初期、分化成熟期、分化末期的二維培養(yǎng)細(xì)胞蛋白樣品以及分化7、14 d的三維培養(yǎng)細(xì)胞蛋白樣品，通過Western Blot技術(shù)檢測(cè)其成肌過程中MYOG和MyHC蛋白的表達(dá)變化。在二維分化進(jìn)程中，MYOG蛋白在增殖期和預(yù)分化期基本不表達(dá)，在開始分化時(shí)表達(dá)量顯著提高，并隨著分化的進(jìn)行，表達(dá)量逐漸降低，三維分化中，MYOG蛋白在分化7 d時(shí)基本未表達(dá)，分化14 d時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)。MyHC蛋白在二維分化的增殖階段和預(yù)分化階段無表達(dá)，在分化后開始表達(dá)，且分化成熟時(shí)的表達(dá)量較分化初期有顯著提高。當(dāng)二維分化進(jìn)入末期時(shí)MyHC的表達(dá)量顯著降低，三維分化7 d時(shí)，MyHC蛋白基本無表達(dá)，分化14 d時(shí)有較少量的MyHC蛋白表達(dá)，但表達(dá)量與二維分化相比更低。

以上結(jié)果表明，在蛋白水平上，三維水凝膠中細(xì)胞的MYOG蛋白和MyHC蛋白的表達(dá)相比二維分化低，尤其是MyHC蛋白表達(dá)與二維分化相比差異較大。

2.6 三維培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸組成分析

由表2可知，培養(yǎng)肌肉中的氨基酸含量與豬肉仍有較大的差距，其各項(xiàng)氨基酸含量均低于豬肉。培養(yǎng)肌肉中的必需氨基酸占總氨基酸的比例為23.39%，低于豬肉的37.12%，但是培養(yǎng)肌肉中的呈味氨基酸占總氨基酸的比例為53.19%，高于豬肉的44.39%。

3 討論

3.1 豬肌肉干細(xì)胞的二維分化進(jìn)程

肌肉干細(xì)胞也被稱為肌衛(wèi)星細(xì)胞[15]，位于肌纖維膜和基底膜之間[16]，正常條件下，肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，表達(dá)和，和是肌衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)志基因，被認(rèn)為是肌衛(wèi)星細(xì)胞命運(yùn)的主要調(diào)控因子[17-18]，當(dāng)肌肉受到機(jī)械損傷時(shí)，肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，分化為成肌細(xì)胞（Myoblast），會(huì)激活并上調(diào)的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入增殖階段，并抑制分化[19]。當(dāng)肌衛(wèi)星細(xì)胞收到誘導(dǎo)分化的信號(hào)，退出細(xì)胞周期并結(jié)束增殖，成肌細(xì)胞進(jìn)一步分化為肌細(xì)胞（Myocyte），開始表達(dá)，細(xì)胞進(jìn)入分化進(jìn)程，在分化早期就開始表達(dá)[20]，其對(duì)肌細(xì)胞融合形成多核肌管（Myotube）和肌纖維起著重要促進(jìn)作用[21-22]。被證明與T小管的形成相關(guān)，其在肌細(xì)胞融合形成肌管時(shí)表達(dá)上調(diào)，并在分化成熟的過程中表達(dá)降低，在成人肌肉中幾乎不表達(dá)[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在二維培養(yǎng)的豬肌肉干細(xì)胞分化進(jìn)程中，和在增殖階段和預(yù)分化階段基本不表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分化初期，和的表達(dá)快速上調(diào)并隨著分化的進(jìn)行而表達(dá)量逐漸降低，終末分化基因的表達(dá)水平隨著分化的進(jìn)行不斷提高，這與Schmidt等[24]的研究結(jié)果類似。該結(jié)果揭示了豬肌肉干細(xì)胞在二維分化條件下的分化進(jìn)程，其中和表達(dá)水平可以用來判斷豬肌肉干細(xì)胞在分化進(jìn)程中所處的階段。

表2 豬肉和培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸含量

*為呈味氨基酸 *Refers to flavoring amino acids

Myoblast：增殖期的豬肌肉干細(xì)胞；pre-diff：二維分化0 d；2D-D3：二維分化3 d；2D-D7：二維分化7 d；2D-D8：二維分化8 d；3D-D7：三維分化7 d；3D-D14：三維分化14 d。下同

圖6 豬肌肉干細(xì)胞分化過程中各關(guān)鍵蛋白的表達(dá)變化

3.2 豬肌肉干細(xì)胞在三維水凝膠的分化

本研究發(fā)現(xiàn)三維分化第7天時(shí)和表達(dá)水平低，分化14 d時(shí)才達(dá)到二維分化第7天時(shí)的水平，表明水凝膠中肌細(xì)胞的分化受到抑制，這很可能是水凝膠三維環(huán)境的作用。三維培養(yǎng)相較于二維培養(yǎng)，細(xì)胞所處的環(huán)境更加復(fù)雜，環(huán)境對(duì)細(xì)胞的影響更大。研究表明，細(xì)胞剛接入水凝膠時(shí)都是未展開的球形，細(xì)胞膜的表面會(huì)有一些受體用于感知外界環(huán)境，這些信息會(huì)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生變化，從而改變細(xì)胞的形態(tài)來適應(yīng)環(huán)境，這種變化最終會(huì)影響細(xì)胞的功能和命運(yùn)[25]。在本研究中，豬肌肉干細(xì)胞在水凝膠中分化第7天時(shí)細(xì)胞的伸展程度較小，肌融合未發(fā)生，在分化第14天時(shí)可觀察到分化形成的多核肌管結(jié)構(gòu)。肌細(xì)胞在水凝膠中的伸展較二維培養(yǎng)更緩慢，肌融合也隨之受阻。這種細(xì)胞在水凝膠中延遲伸展的現(xiàn)象在Scott等[26]的研究中也有類似的報(bào)道，血管外膜成纖維細(xì)胞在不同強(qiáng)度的聚乙二醇水凝膠中培養(yǎng)7 d仍均保持球形，直至第14天才發(fā)生不同程度的伸展，且強(qiáng)度較大的水凝膠中細(xì)胞伸展程度較小，說明水凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)限制了細(xì)胞的形態(tài)變化。將肌肉干細(xì)胞接入強(qiáng)度適宜的膠原水凝膠中，細(xì)胞會(huì)逐漸結(jié)合膠原纖維上的錨點(diǎn)，纖維會(huì)給細(xì)胞牽引力誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，并使水凝膠發(fā)生收縮[27]。當(dāng)水凝膠強(qiáng)度較大，即環(huán)境不適宜細(xì)胞伸展時(shí)，細(xì)胞會(huì)分泌一些基質(zhì)降解酶來改變周圍的環(huán)境，這就可能造成細(xì)胞在水凝膠中伸展延遲[28]。Hogrebe等[29]研究了不同強(qiáng)度自組裝肽水凝膠中人間充質(zhì)干細(xì)胞的伸展情況，在接種細(xì)胞1 d后，在強(qiáng)度為0.25 kP的水凝膠中，二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的細(xì)胞均仍呈球形；強(qiáng)度為1.25 kP和5 kP的水凝膠中分別二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)的細(xì)胞均可以正常伸展；而在強(qiáng)度為10 kP的水凝膠中，二維培養(yǎng)的細(xì)胞可以正常伸展，三維培養(yǎng)的細(xì)胞卻不能伸展開；對(duì)其進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在0.25 kP的水凝膠中，二維和三維培養(yǎng)的細(xì)胞仍為球形，而在10 kP的水凝膠中三維培養(yǎng)26 d時(shí)可明顯觀察到細(xì)胞伸展。該結(jié)果說明細(xì)胞伸展需要環(huán)境提供一定的牽引力，如果牽引力過小，細(xì)胞可能不能正常伸展；而水凝膠強(qiáng)度太大，細(xì)胞會(huì)需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能伸展，因?yàn)榧?xì)胞需要釋放一些基質(zhì)降解酶來創(chuàng)造適宜自身的環(huán)境，故構(gòu)成水凝膠的纖維的易降解程度也會(huì)是細(xì)胞伸展速度的影響因素。水凝膠除了通過影響細(xì)胞的伸展對(duì)細(xì)胞造成影響，構(gòu)成水凝膠纖維的濃度、交聯(lián)程度及接種細(xì)胞的密度等也會(huì)決定水凝膠網(wǎng)絡(luò)的空隙大小，從而影響細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換和細(xì)胞間的信號(hào)傳遞[30]。在二維培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞可以通過流動(dòng)的培養(yǎng)基快速地進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞，但是在三維培養(yǎng)中，水凝膠復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸路徑增加，細(xì)胞的物質(zhì)交換受到抑制。因此，三維培養(yǎng)時(shí)需要一些類似于血管的結(jié)構(gòu)輔助內(nèi)部的細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，如Kolesky等[31]通過3D打印技術(shù)在明膠和纖維蛋白交聯(lián)形成的水凝膠中打印了類血管組織，實(shí)現(xiàn)了為厚組織灌輸培養(yǎng)基和生長(zhǎng)因子。

3.3 三維培養(yǎng)有利于MyHC相關(guān)基因的表達(dá)

肌球蛋白（Myosin）是肌原纖維的重要組成成分，其高表達(dá)是肌管或肌纖維成熟的重要標(biāo)志。肌球蛋白由肌球蛋白重鏈和肌球蛋白輕鏈組成，其中根據(jù)肌纖維的代謝類型不同，可將MyHC分為幾種不同的亞型[32]，其中MyHC-slow和MyHC-2a分別對(duì)應(yīng)慢速氧化型肌纖維和快速氧化型肌纖維[33]。在本研究中，三維分化條件相比于二維分化更有利于和的表達(dá)。這種三維培養(yǎng)促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)的現(xiàn)象與Fujie等[34]的研究結(jié)果類似，其通過聚乳酸-羥基乙酸共聚物制作的納米帶片和纖維連接蛋白制作出具有兩層肌細(xì)胞的肌肉組織薄片來模擬細(xì)胞的三維培養(yǎng)狀態(tài)，結(jié)果表明雙層培養(yǎng)時(shí)肌細(xì)胞的、、和表達(dá)水平均高于單層培養(yǎng)，表明雙層培養(yǎng)有利于肌管的分化成熟。但是本研究中雖然三維培養(yǎng)促進(jìn)了的相關(guān)基因表達(dá)，但是三維培養(yǎng)肌細(xì)胞的MyHC蛋白表達(dá)水平與二維培養(yǎng)有較大的差距。在Liu等[35]的研究中，二維培養(yǎng)和三維水凝膠培養(yǎng)7 d的C2C12細(xì)胞MyHC蛋白表達(dá)水平無顯著差異，與本研究的結(jié)果不同。本研究認(rèn)為MyHC的低表達(dá)可能和肌細(xì)胞的融合程度較低有關(guān)，免疫熒光染色的結(jié)果顯示MyHC蛋白的染色和F-actin染色的肌管是共定位的，說明肌細(xì)胞融合成肌管的程度與MyHC蛋白的表達(dá)呈一定的正向關(guān)系，現(xiàn)有研究證明MyHC的產(chǎn)生與肌細(xì)胞的融合程度有關(guān)[36]。本研究中構(gòu)建的水凝膠體系延緩了細(xì)胞的伸展，這可能也是肌細(xì)胞融合受阻的原因，將來的研究可以通過優(yōu)化水凝膠體系的配方，如改變膠原濃度及交聯(lián)程度等，構(gòu)建更有利于肌細(xì)胞融合形成肌管的水凝膠體系。

3.4 培養(yǎng)肌肉組織的氨基酸組成

本研究培養(yǎng)肌肉中的氨基酸含量與豬肉還有很大的差異，這可能與培養(yǎng)肌肉組織中的高水分含量有關(guān)，就氨基酸的組成來看，培養(yǎng)肌肉中的必需氨基酸在總氨基酸中的占比低于豬肉，但是呈味氨基酸的占比高于豬肉，可能會(huì)擁有更好的風(fēng)味。培養(yǎng)肌肉中含量較高的氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸等，這些也是構(gòu)成鼠尾膠原蛋白的主要氨基酸，鼠尾膠原中必需氨基酸占比約16%[37]，而培養(yǎng)肌肉中為23.39%，說明接入細(xì)胞后其必需氨基酸的占比明顯提升，未來可以通過優(yōu)化水凝膠的體系，提高細(xì)胞密度等方法，培養(yǎng)出營(yíng)養(yǎng)成分與豬肉更加接近的肌肉組織。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種用于豬肌肉干細(xì)胞體外三維培養(yǎng)的水凝膠體系，實(shí)現(xiàn)了豬肌肉干細(xì)胞的體外三維分化。三維條件有利于豬肌肉干細(xì)胞的終末分化基因和的表達(dá)，由此方法體外培養(yǎng)的肌肉組織具有較高的呈味氨基酸含量。

[1] 周光宏, 丁世杰, 徐幸蓮. 培養(yǎng)肉的研究進(jìn)展與挑戰(zhàn). 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2020, 20(5): 1-11.

ZHOU G H, DING S J, XU X L. Progress and challenges in cultured meat. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology, 2020, 20(5): 1-11. (in Chinese)

[2] STOKER M, O'NEILL C, BERRYMAN S, WAXMAN V. Anchorage and growth regulation in normal and virus-transformed cells. International Journal of Cancer, 1968, 3(5): 683-693. doi: 10.1002/ijc. 2910030517.

[3] DATAR I, BETTI M. Possibilities for anmeat production system. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2010, 11(1): 13-22.

[4] POWELL C A, SMILEY B L, MILLS J, VANDENBURGH H H. Mechanical stimulation improves tissue-engineered human skeletal muscle. American Journal of Physiology Cell Physiology, 2002, 283(5): C1557-C1565. doi: 10.1152/ajpcell. 00595.2001.

[5] VANDENBURGH H H, KARLISCH P, FARR L. Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.Cellular & Developmental Biology, 1988, 24(3): 166-174. doi: 10.1007/BF02623542.

[6] OKANO T, MATSUDA T. Tissue engineered skeletal muscle: Preparation of highly dense, highly oriented hybrid muscular tissues. Cell Transplant, 1998, 7(1): 71-82. doi: 10.1177/ 096368979800700110.

[7] FURUHASHI M, MORIMOTO Y, SHIMA A, NAKAMURA F, ISHIKAWA H, TAKEUCHI S. Formation of contractile 3D bovine muscle tissue for construction of millimetre-thick cultured steak. NPJ Science of Food, 2021, 5(1): 6. doi: 10.1038/s41538-021- 00090-7.

[8] MACQUEEN L A, ALVER C G, CHANTRE C O, AHN S, CERA L, GONZALEZ G M, O'CONNOR B B, DRENNAN D J, PETERS M M, MOTTA S E, ZIMMERMAN J F, PARKER K K. Muscle tissue engineering in fibrous gelatin: implications for meat analogs. NPJ Science of Food, 2019, 3: 20. doi: 10.1038/s41538- 019-0054-8.

[9] BEN-ARYE T, SHANDALOV Y, BEN-SHAUL S, LANDAU S, ZAGURY Y, IANOCIVI I, LAVON N, LEVENBERG S. Textured soy protein scaffolds enable the generation of three-dimensional bovine skeletal muscle tissue for cell-based meat. Nature Food, 2020, 1(4): 210-220.

[10] GERSHLAK J R, HERNANDEZ S, FONTANA G, PERREAULT L R, HANSEN K J, LARSON S A, BINDER B Y, DOLIVO D M, YANG T, DOMINKO T, ROLLE M W, WEATHERS P J, MEDINA-BOLIVAR F, CRAMER C L, MURPHY W L, GAUDETTE G R. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials, 2017, 125: 13-22. doi: 10.1016/j.biomaterials. 2017.02.011.

[11] MODULEVSKY D J, LEFEBVRE C, HAASE K, AI-REKABI Z, PELLING A E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS ONE, 2014, 9(5): e97835.

[12] JONES J D, REBELLO A S, GAUDETTE G R. Decellularized spinach:

An edible scaffold for laboratory-grown meat. Food Bioscience, 2021, 41: 100986.

[13] FONG A P, YAO Z, ZHONG J W, JOHNSON N M, FARR G H, MAVES L, TAPSCOTT S J. Conversion of MyoD to a neurogenic factor: Binding site specificity determines lineage. Cell Reports, 2015, 10(12): 1937-1946. doi: 10.1016/j.celrep.2015.02.055.

[14] 蘇艷紅, 袁乾坤. Caveolin-3對(duì)骨骼肌,心肌傷病的調(diào)控機(jī)制. 中國(guó)學(xué)校體育: 高等教育, 2014(8): 6.

SU Y H, YUAN Q K. Regulation mechanism of Caveolin-3 on skeletal muscle and myocardial Injury. China School Physical Education (Higher Education), 2014(8): 6. (in Chinese)

[15] MAURO A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology, 1961, 9: 493-495. doi: 10. 1083/jcb.9.2.493.

[16] LEPPER C, PARTRIDGE T A, FAN C M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development, 2011, 138(17): 3639-3646. doi: 10.1242/ dev.067595.

[17] SOLEIMANI V D, PUNCH V G, KAWABE Y, JONES A E, PALIDWOR G A, PORTER C J, CROSS J W, CARVAJAL J J, KOCKX C E, VAN IJCKEN W F, PERKINS T J, RIGBY P W, GROSVELD F, RUDNICKI M A. Transcriptional dominance of Pax7 in adult myogenesis is due to high-affinity recognition of homeodomain motifs. Developmental Cell, 2012, 22(6): 1208-1220. doi: 10.1016/j.devcel.2012.03.014.

[18] DING S, WANG F, LIU Y, LI S, ZHOU G, HU P. Characterization and isolation of highly purified porcine satellite cells. Cell Death Discovery, 2017, 3: 17003. doi: 10.1038/cddiscovery. 2017.3.

[19] ZAMMIT P S, GOLDING J P, NAGATA Y, HUDON V, PARTRIDGE T A, BEAUCHAMP J R. Muscle satellite cells adopt divergent fates: A mechanism for self-renewal? The Journal of Cell Biology, 2004, 166(3): 347-357.

[20] ZAMMIT P S. Function of the myogenic regulatory factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4in skeletal muscle, satellite cells and regenerative myogenesis. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2017, 72: 19-32. doi: 10.1016/j.semcdb.2017.11.011.

[21] LE GRAND F, RUDNICKI M A. Skeletal muscle satellite cells and adult myogenesis. Current Opinion in Cell Biology, 2007, 19(6): 628-633.

[22] BENTZINGER C F, WANG Y X, RUDNICKI M A. Building muscle: molecular regulation of myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2012, 4(2): a008342. doi: 10.1101/cshperspect. a008342.

[23] PARTON R G, WAY M, ZORZI N, STANG E. Caveolin-3 associates with developing T-tubules during muscle differentiation. The Journal of Cell Biology, 1997, 136(1): 137-154. doi: 10.1083/jcb. 136.1.137.

[24] SCHMIDT M, SCHüLER S C, HüTTNER S S, EYSS B, MALTZAHN J. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cellular and Molecular Life Sciences, 2019, 76(13): 2559-2570. doi: 10.1007/s00018-019-03093-6.

[25] VERNEREY F J, LALITHA SRIDHAR S, MURALIDHARAN A, BRYANT S J. Mechanics of 3D cell-hydrogel interactions: experiments, models, and mechanisms. Chemical Reviews, 2021, 121(18): 11085-11148. doi: 10.1021/acs.chemrev.1c00046.

[26] SCOTT R A, ROBINSON K G, KIICK K L, AKINS R E. Human adventitial fibroblast phenotype depends on the progression of changes in substrate stiffness. Advanced Healthcare Materials, 2020, 9(8): e1901593. doi: 10.1002/adhm.201901593.

[27] TAN J L, TIEN J, PIRONE D M, GRAY D S, BHADRIRAJU K, CHEN C S. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, 100(4): 1484-1489.

[28] KOBAYASHI T, KIM H, LIU X, SUGIURA H, KOHYAMA T, FANG Q, WEN F Q, ABE S, WANG X, ATKINSON J J, SHIPLEY J M, SENIOR R M, RENNARD S I. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-β and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology, 2014, 306(11): L1006-L1015. doi: 10.1152/ajplung.00015. 2014.

[29] HOGREBE N J, GOOCH K J. Direct influence of culture dimensionality on human mesenchymal stem cell differentiation at various matrix stiffnesses using a fibrous self-assembling peptide hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2016, 104(9): 2356-2368. doi: 10.1002/jbm.a.35755.

[30] MAHADIK B P, BHARADWAJ N A, EWOLDT R H, HARLEY B A. Regulating dynamic signaling between hematopoietic stem cells and niche cells via a hydrogel matrix. Biomaterials, 2017, 125: 54-64. doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.02.013.

[31] KOLESKY D B, HOMAN K A, SKYLAR-SCOTT M A, LEWIS J A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113(12): 3179-3184. doi: 10.1073/pnas.1521342113.

[32] SCHIAFFINO S, REGGIANI C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews, 2011, 91(4): 1447-1531. doi: 10.1152/ physrev.00031.2010.

[33] EGGERT J M, DEPREUX F F, SCHINCKEL A P, GRANT A L, GERRARD D E. Myosin heavy chain isoforms account for variation in pork quality. Meat Science, 2002, 61(2): 117-126. doi: 10.1016/ s0309-1740(01)00154-1.

[34] FUJIE T, SHI X, OSTROVIDOV S, LIANG X B, NAKAJIMA K, CHEN Y, WU H K, KHADEMHOSSEINI A. Spatial coordination of cell orientation directed by nanoribbon sheets. Biomaterials, 2015, 53: 86-94. doi: 10.1016/j.biomaterials.2015.02.028.

[35] LIU G Y, AGARWAL R, KO K R, RUTHVEN M, SARHAN H T, FRAMPTON J P. Templated assembly of collagen fibers directs cell growth in 2D and 3D. Scientific Reports, 2017, 7(1): 9628. doi: 10.1038/s41598-017-10182-8.

[36] GROSSI A, YADAV K, LAWSON M A. Mechanical stimulation increases proliferation, differentiation and protein expression in culture: stimulation effects are substrate dependent. Journal of Biomechanics, 2007, 40(15): 3354-3362. doi: 10.1016/j.jbiomech. 2007.05.007.

[37] 任海濤, 鐘志勇, 鄭佳琳, 饒子亮, 鄺少松, 王剛, 唐小江. 鼠尾膠原蛋白提取、分離、純化方法的建立及鑒定. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 22(11): 50-53.

REN H T, ZHONG Z Y, ZHENG J L, RAO Z L, KUANG S S, WANG G, TANG X J. The establishment and appraisal of the methods for the extraction, separation and purification of rat tail collagen. Chinese Journal of Comparative Medicine, 2012, 22(11): 50-53. (in Chinese)

Differentiation of Porcine Muscle Stem Cells in Three-Dimensional Hydrogels

CHEN Yu, ZHU HaoZhe, CHEN YiChun, LIU Zheng, DING Xi, GUO Yun, DING ShiJie, ZHOU GuangHong

College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University/National Meat Quality and Safety Control Engineering Technology Research Center/Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control, Ministry of Education, Nanjing 210095

【Objective】 The objective of this study was to explore the differentiation effect of porcine muscle stem cells in three-dimensional hydrogels, and to provide a guidance for inducing muscle stem cells to differentiate into muscle tissue in vitro.【Method】 Some porcine muscle stem cells were respectively induced to differentiate under the conditions of 2D and 3D (2D condition means culturing cells in culture dishes; 3D condition means culturing cells in hydrogels). The RNA and protein samples of porcine muscle stem cells cultured in 2D were collected at proliferation, pre-differentiation, early differentiation, mature differentiation, and late differentiation, respectively, and those in 3D were also collected at day 7 and day 14 of differentiation, respectively. Then, RT-qPCR was used to compare the expression levels of the myogenic-related genes, including the genes ofand,under 2D and 3D differentiation conditions. Correspondingly, the Western Blot was used to detect the expression levels of MyHC protein and MYOG protein in the two conditions. Moreover, the immunofluorescence staining was used to observe the myotubes formed in cell culture dishes and hydrogels. Further, the amino acid content and composition of the cultured muscle tissue were analyzed by an amino acid automatic analyzer at day 14 of differentiation. 【Result】 The porcine muscle stem cells started to fuse to form myotubes at day 3 of differentiation in 2D. The myotubes formed in 2D matured at day 7 and divorced from culture dish afterwards. The porcine muscle stem cells were still globe and had low expression ofandat day 7 of differentiation in 3D. Multinucleated myotubes formed at day 14 and the expression ofandreached levels of 2D differentiation. The cells in hydrogels had higher expression of terminal differentiation genesandthan the cells in culture dishes. The expression ofwas 12 times that at day 7 in 2D and the expression ofwas 4 times that at day7 in 2D, but the expression of MyHC protein was only 1/6 that at day 7 in 2D. Amino acid analysis results showed that the contents of 17 hydrolyzed amino acids in cultured muscle tissue were all lower than those in pork, and the ratio of essential amino acids was also lower in cultured muscle tissue, but the ratio of flavor amino acids was higher. 【Conclusion】 The porcine muscle stem cells could differentiate into myotubes in 3D collagen hydrogels, and the 3D condition was positive to the expression of myogenic differentiation related genes, but further research was needed to achieve high expression of MyHC protein. The flavor amino acid content of the muscle tissue cultured in this way was high, which might mean good flavor.

porcine muscle stem cells; differentiation; hydrogels; myotubes; cultured meat

10.3864/j.issn.0578-1752.2022.22.014

2022-03-03；

2022-06-16

江蘇省青年科學(xué)家自然科學(xué)基金（BK20200537）、江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）（BE2020302）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFC2101400）、國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（32101991）、江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心

陳彧，E-mail：2020808131@stu.njau.edu.cn。通信作者丁世杰，E-mail：shijieding@njau.edu.cn。通信作者周光宏，E-mail：guanghong. zhou@hotmail.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）