鄒金成，侯睿哲，王紅英，趙詩慶，張愛麗

(上海交通大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海 200030)

引言

熱消融是通過將超聲及射頻、微波電磁波引入生物組織，導(dǎo)致能量沉積并轉(zhuǎn)化成熱，使組織發(fā)生凝固性壞死的局部治療技術(shù)。為實現(xiàn)良好的治療效果，需要對消融區(qū)的形狀和大小進(jìn)行評估。在熱消融實驗中最理想的實驗材料是動物組織，然而在體動物模型測量較為昂貴，即使是真實組織的體外使用也可能因取材、處理、存儲，特別是結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化方面而面臨很大困難[1]。因此，能模擬靶組織物理性質(zhì)和幾何性質(zhì)的凝膠體模被廣泛用作替代性研究材料。

目前，常用于熱消融研究的體模材料有明膠、瓊脂、聚丙烯酰胺。明膠保質(zhì)期長、成本低、制作簡單，且具有良好的透明度，但是機(jī)械強(qiáng)度與熔點低，不適宜用于溫度超過50℃的熱物理研究。瓊脂雖有良好的機(jī)械和熱穩(wěn)定性，因其不透明，即使可以通過在距離消融探針不同位置處插入熱電偶，來測得不同點的升溫速率并判斷消融情況，但無法精確測量消融區(qū)域的大小及形狀[2]。而聚丙烯酰胺凝膠則兼具良好的熱學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性質(zhì)與光學(xué)透明度[3]，可以適配較大范圍的熱學(xué)、電學(xué)性質(zhì)，是可視化仿生膠體的更優(yōu)選擇[4]。

聚丙烯酰胺膠有良好的光學(xué)透明度，通過添加熱敏感物質(zhì)可以觀察和測量膠體內(nèi)部凝固區(qū)域的三維形狀和尺寸，被廣泛應(yīng)用于射頻和微波頻段。常用的熱敏感劑有牛血清白蛋白(BSA)、蛋清。二者均可以在達(dá)到閾值溫度后發(fā)生不可逆的凝固，形成不透明的變白區(qū)域。相比于BSA，蛋清的成本更加低廉。也有采用非離子表面活性劑[11]和熱致變色染料作為熱敏感劑，用來制備可重復(fù)使用的可視化膠體。

然而，目前使用的可視化聚丙烯酰胺膠大多用于模擬肝臟組織的性質(zhì)，包括聲學(xué)[14]、熱學(xué)和電學(xué)性質(zhì)。其中，電學(xué)性質(zhì)主要是模擬470 kHz的頻率[15]，即臨床上射頻消融使用的頻率。也有部分模擬肌肉組織的仿生膠體，但所使用的頻率范圍大部分在MHz到GHz區(qū)間，很少有模擬kHz頻段的仿生膠體研究。雖然Aditya等[18-19]利用水、鋁粉和結(jié)冷膠制備了500 kHz下模擬人體肌肉介電性質(zhì)的體模，但也僅是單個頻率的電學(xué)性質(zhì)匹配，未進(jìn)行更大范圍頻段的適配度研究。

因此，本研究制作了一種三維可視化聚丙烯酰胺仿生膠體，可以較好地模擬肌肉組織在100～500 kHz頻率范圍內(nèi)的電學(xué)性質(zhì)，同時在射頻消融過程中還能三維立體地觀察射頻消融范圍。使用自主研發(fā)的460 kHz射頻消融系統(tǒng)加熱，觀察和對比了所制備膠體的射頻加熱響應(yīng)，效果較好，能為臨床研究提供有利參考。

1 方法

1.1 三維可視化仿生膠體制作材料

本研究參考Takegami等[10]的方法提出制作100 mL的三維可視化仿生膠體配方為：新鮮雞蛋蛋清35 mL,溶解NaCl的去離子水31.4 mL，含30%(w/v)丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺的水溶液(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺=19∶1)(迪申生物)33 mL，10%(w/v)的過硫酸銨(ammonium persulfate，APS)(默克)1mL，四甲基乙二胺(TEMED)(碧云天生物)0.1 mL。

其中，聚丙烯酰胺凝膠主要由丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺在水溶液中的交聯(lián)反應(yīng)，以及隨后的聚合反應(yīng)制成[9]，APS和TEMED分別作為聚合反應(yīng)的引發(fā)劑和催化劑被添加至膠體溶液中[20-21]；丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺，可以使膠體具有足夠的硬度，以保證獨立放置或插入射頻探針不會破裂[10]；利用蛋清對溫度的敏感性作為射頻消融方法研究的溫度指示劑，由于蛋清濃度過高會增大膠體的不透明度，濃度過低會導(dǎo)致靈敏度和光學(xué)對比度降低，濃度范圍在0%～40%為宜[10]，本研究選擇體積分?jǐn)?shù)為35%的蛋清，符合良好可視化的濃度范圍。

此外，已有研究構(gòu)建的以牛血清白蛋白為溫度指示劑的聚丙烯酰胺凝膠在470 kHz時的電導(dǎo)率約為0.117 S/m[15]，接近肝臟組織的電導(dǎo)率為0.148 S/m[22]。與以蛋清為指示劑的聚丙烯酰胺膠體電導(dǎo)率接近，顯著低于肌肉組織的電導(dǎo)率0.45 S/m[21]。因此，本研究在制作過程中添加了NaCl來調(diào)整膠體的導(dǎo)電性能和電學(xué)性質(zhì)[23-25]，并配置了含有不同濃度NaCl的膠體以探究其對膠體電學(xué)特性的影響。

1.2 三維可視化仿生膠體的制作

參照文獻(xiàn)報道的聚丙烯酰胺凝膠制作流程[12,20,22]，本研究中三維可視化膠體的制作過程為：在室溫條件下，向35 mL的蛋清中加入31.4 mL含有一定濃度NaCl的去離子水，用磁力攪拌子將其攪拌均勻后，再向制備的蛋清-NaCl水溶液中加入33 mL丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液，使其混合均勻。之后向蛋清/水/丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合溶液中滴加1 mL 10%(w/v)的APS溶液以及0.1 mL的TEMED。在溶液攪拌1 min后，將制備的溶液倒入制作好的膠體模型中，室溫條件下靜置半小時直至混合并固化成凝膠。最后，在制作好的膠體表面滴加少量去離子水，用封口膜密封后置于4℃冰箱保存。

1.3 仿生膠體的電特性測量

射頻消融技術(shù)主要利用高頻電流場作用下的熱效應(yīng)，達(dá)到對靶向組織消融治療的目的。然而，不同個體或同一個體不同組織的導(dǎo)電性能(即電阻抗特性)有差異，為更好地研究其射頻消融治療方法，本研究設(shè)計制作的仿生膠體可通過改變?nèi)ルx子水中NaCl的濃度，調(diào)節(jié)膠體的電阻抗特性。為驗證該仿生膠體與生物組織阻抗特性的一致性與NaCl濃度對膠體電特性的影響，本研究使用LCR表(keysight，E4980A)測量了豬里脊肉與含不同濃度NaCl的仿生膠體分別在100 kHz～2 MHz(射頻消融頻率一般在300 kHz～1 MHz之間)頻率區(qū)間內(nèi)的阻抗幅值和相位角，測量過程均在室溫22℃下進(jìn)行。其中，對豬里脊肉的阻抗特性測量包括肌肉纖維平行和垂直于電極時的兩種情況。另外，為補(bǔ)償測試電極引起的雜散導(dǎo)納，實際測量之前均對測量電路進(jìn)行了開路修正。

1.4 射頻加熱實驗

本研究利用自主設(shè)計的射頻發(fā)生系統(tǒng)對制備的仿生膠體進(jìn)行了恒定電壓(15 V)模式、頻率為460 kHz、時長10 s的加熱實驗，并觀察其可視化與量化指標(biāo)。實驗裝置見圖1。其中，實驗所使用的電極為加工在聚酰亞胺薄膜上且尺寸為1.4 mm×4 mm、間距為1 mm的兩個銅電極。膠體完全覆蓋電極，并且膠體底面邊緣與電極短邊相重合。

圖1 射頻加熱實驗裝置Fig.1 Radiofrequency heating experimental device

2 結(jié)果與討論

2.1 不同濃度NaCl膠體的電特性測試

為探究仿生膠體及消融組織的電特性要求，本研究分別制作了不同濃度的NaCl膠體。在20℃環(huán)境下，對比了各種膠體、肌肉纖維方向分別與電極平行、垂直時的阻抗幅值和相位角，其隨頻率變化的曲線見圖2。其中，仿生膠體中分別含有的NaCl濃度為0%，0.14%、0.28%和0.42%(w/v)。

圖2 含不同濃度NaCl的膠體、肌肉(豬里脊肉)纖維方向分別與電極平行時、垂直時的阻抗幅值(a)和相位角(b)隨頻率變化的曲線圖

實驗發(fā)現(xiàn)，肌肉組織的阻抗幅值隨頻率增加有先增大，再迅速下降的趨勢，在約300 kHz時達(dá)到峰值。其中，上升區(qū)間內(nèi)的阻抗幅值變化在肌肉與電極平行和垂直時分別為1.30%、1.67%，在誤差可接受范圍內(nèi)(5%)。因此，阻抗幅值在100～500 kHz無顯著性差異，可認(rèn)為基本不變。此外，相位角在500 kHz以下時隨頻率增加而劇烈下降；當(dāng)頻率高于500 kHz時，阻抗角基本不隨頻率變化。

相同頻率下，肌肉纖維平行于電極時測得的阻抗幅值要高于肌肉纖維與電極垂直時的幅值，且相位角的絕對值略大，表明肌肉纖維平行于電極時的容性稍強(qiáng)。

通過調(diào)節(jié)仿生膠體中NaCl的含量并對含不同濃度(0.14%、0.28%和0.42%)NaCl的仿生膠體進(jìn)行電學(xué)特性的測量發(fā)現(xiàn)：(1)隨NaCl濃度的增加，仿生膠體的阻抗幅值逐漸減小；相位角在500 kHz以下時無明顯變化，高頻時與NaCl濃度成正相關(guān)。(2)仿生膠體中NaCl含量為0.28%，即制作過程中添加濃度為0.9%的NaCl-去離子水溶液時，阻抗幅值介于兩種肌肉纖維與電極相對取向之間，且幅值與相位角隨頻率變化的趨勢基本相同。

2.2 三維可視化仿生膠體的量化與可視化測試

為顯示本研究制作的三維可視化膠體在射頻加熱過程中的加熱效果，將加熱電極置于膠體的底部，使用460 kHz射頻對膠體進(jìn)行加熱，記錄射頻加熱10 s過程中，不同時間節(jié)點的加熱膠體形態(tài)變化。同時使用紅外熱成像儀同步測試膠體的溫升過程，記錄結(jié)果見圖3。其中，圖3(e)-(h)中，白色虛線表示膠體底部邊緣，黑色實線表示15℃的等溫線。隨射頻電流的施加，仿生膠體與電極接觸的部分溫度會迅速升高，膠體正面形成以電極為底邊的扇形溫升區(qū)域，且溫度整體以電極為中心向外擴(kuò)散。受熱區(qū)域逐漸變白，形成類似四分之一橢球體的加熱形狀，并且隨射頻作用時長的不斷增加，白色加熱區(qū)域在縱向深度和橫向?qū)挾壬隙紩忻黠@增加。

圖3 不同加熱時長下，仿生膠體的明場拍攝照片(a)-(d) 與紅外溫升(ΔT)圖像(e)-(h)

對圖3中不同射頻加熱時長下明場拍攝的仿生膠體正面變白區(qū)域，以及對紅外溫升圖像中15℃的等溫線包圍的區(qū)域進(jìn)行高度和寬度的測量、統(tǒng)計。對四塊膠體，各重復(fù)測量三次取平均值，結(jié)果見圖4?？砂l(fā)現(xiàn)紅外溫升圖像中15℃溫升包圍區(qū)域與明場中膠體變白區(qū)域的尺寸基本一致。

圖4 不同射頻加熱時長下，明場照片正面變白區(qū)域和紅外溫升圖像中15℃溫升區(qū)域的寬度、高度對比圖

2.3 膠體與肌肉組織加熱效果對比測試

為驗證本研究制作的加熱膠體在實際應(yīng)用中的消融情況，根據(jù)電特性曲線測試結(jié)果，選擇含0.28%(w/v)NaCl的仿生膠體與肌肉組織進(jìn)行對比實驗。實驗前，首先使用直徑5 cm、高8 cm的亞克力管制作仿生膠體，同時切好相同尺寸的肌肉放在模具中。使用上海美杰醫(yī)療科技有限公司研發(fā)的多模態(tài)腫瘤消融探針(探針直徑2 mm，探針有效消融長度3 cm)，采用460 kHz頻率射頻，控制恒定射頻電壓有效值30 V，分別對仿生膠體與肌肉組織加熱3 min，實驗裝置示意圖，見圖5。肌肉組織和膠體在加熱過程中的實時阻抗變化見圖6。分別將消融后的組織與膠體從中間切開，觀察消融情況并測量其消融范圍，結(jié)果見圖7。

圖5 膠體與肌肉組織加熱裝置示意圖Fig.5 Schematic diagram of tissue-mimicking phantom and muscle tissue heating

由圖6可知，在射頻消融過程中，膠體與肌肉組織的阻抗變化曲線幾乎一致，說明本研究膠體具有與肌肉組織相同的電特性。圖7中對比測試的仿生膠體消融范圍為16.4 mm，肌肉組織消融范圍為16 mm，并且膠體消融與組織消融的變白區(qū)域近乎相同。

圖6 肌肉組織與膠體射頻消融過程中實時阻抗

圖7 肌肉與膠體的消融范圍

3 結(jié)論

本研究根據(jù)射頻消融的基本原理與生物組織相關(guān)電學(xué)特性，研制了一種應(yīng)用于射頻消融研究的三維可視化仿真膠體，并對比測試了仿真膠體與肌肉組織的電特性，結(jié)果表明，通過改變膠體中NaCl濃度，可以改變其電特性，并且能擁有與生物組織相似的電性質(zhì)。對膠體的射頻加熱實驗表明，本研究膠體能夠?qū)崟r清晰地顯示射頻消融的區(qū)域，且與肌肉組織對比實驗發(fā)現(xiàn)，二者具有相同的加熱區(qū)域。本研究的仿生膠體可為射頻精準(zhǔn)消融治療方法的研究提供可視化和量化的熱響應(yīng)效果，同時也為不同組織膠體的研究提供了設(shè)計方法，有利于指導(dǎo)射頻消融技術(shù)的臨床治療研究。