冀 霞，黃奕睿，余若菁，李旭康，朱康溢，郭銘娜

（惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007）

惠州市作為粵港澳大灣區(qū)重要的臨海城市，海洋和淡水資源豐富，水產(chǎn)養(yǎng)殖占據(jù)重要地位?！?019 中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》顯示，廣東省水產(chǎn)總產(chǎn)量866.40 萬t，躍居全國第一。2022 年上半年惠州市地區(qū)生產(chǎn)總值增速全省第一［1］，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展尤其迅猛，伴隨著養(yǎng)殖集約化程度、養(yǎng)殖密度和水產(chǎn)品總量不斷攀升，隨之出現(xiàn)的水質(zhì)環(huán)境惡化、疾病暴發(fā)流行、病原微生物耐藥性增強(qiáng)及水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題也日益突出［2］。

使用抗生素是目前解決水產(chǎn)品病害的主要手段［3］。由于缺乏科學(xué)指導(dǎo)，很多養(yǎng)殖戶存在濫用抗生素的情況，這不僅對病害收效甚微，還會導(dǎo)致環(huán)境中的抗生素逐漸積累，使細(xì)菌在選擇壓力下被誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性［4］。張騫月等［5］對南美白對蝦養(yǎng)殖池塘中磺胺類藥物的殘留分析，表明磺胺類藥物殘留濃度大，且藥物的濃度變化與養(yǎng)殖活動密切相關(guān)。寧丹等［6］對廣東省養(yǎng)殖魚類無乳鏈球菌耐藥性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它對多達(dá)12種抗生素都有不同程度的耐藥率，其中對鏈霉素和慶大霉素的耐藥率更是達(dá)到100%，有些菌株甚至表現(xiàn)出多重耐藥的現(xiàn)象。對比廣東省以外地區(qū)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)水生動物耐藥菌情況，也能看出不同地點耐藥菌對抗生素的敏感程度有所差異，可見，水產(chǎn)養(yǎng)殖抗生素耐藥菌防治情況不容樂觀，細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、耐藥基因的擴(kuò)散問題依舊不容忽視［7］。

目前，針對惠州等小區(qū)域水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中細(xì)菌耐藥性情況的研究報道較少，不同地區(qū)來源菌株對抗生素的敏感程度有很大差異。因此，通過研究分析惠州水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中細(xì)菌的耐藥性情況，為惠州市水產(chǎn)品的疾病控制及養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌耐藥性影響提供重要參考依據(jù)。

16S rDNA 測序常用于確定特定微生物群體的菌屬組成。常規(guī)檢測的方法是從細(xì)菌形態(tài)和生化水平檢測，很難鑒定出細(xì)菌的種屬，而用16S rDNA 測序方法可以更準(zhǔn)確鑒定出菌的種屬。MOORE 等［8］曾經(jīng)采用16S rDNA PCR、基因檢測技術(shù)，測定鮭魚養(yǎng)殖場水體中細(xì)菌病原體的多樣性和抗生素耐藥性，確定了不動桿菌屬、氣單胞菌屬等7 個不同屬的10 個分類群。因此，通過16S rDNA測序鑒定惠州市水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中微生物病原體，能更好地把控地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖病原性耐藥菌的種屬組成。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LB 培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；抗菌藥物購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Taq酶、DNA ladder 購自大連Takara 公司；16S rDNA 通用引物［9］（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT - 3'）合 成 和DNA 測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 樣品的采集和準(zhǔn)備

隨機(jī)選取惠州市3 個縣（區(qū)）內(nèi)4 個水產(chǎn)養(yǎng)殖點進(jìn)行采樣，分別是A：惠城區(qū)惠州市漁業(yè)研究推廣中心；B：惠城區(qū)湖心島休閑釣魚場；C：博羅縣泰美鎮(zhèn)芹塘村水產(chǎn)養(yǎng)殖點；D：惠陽區(qū)葉挺紀(jì)念館水產(chǎn)養(yǎng)殖點。以惠州市漁業(yè)推廣中心和博羅縣泰美鎮(zhèn)芹塘村為代表，4個水產(chǎn)養(yǎng)殖點的養(yǎng)殖魚類均為混養(yǎng)淡水魚類，以草魚和羅非魚為主，水產(chǎn)養(yǎng)殖水體環(huán)境細(xì)菌耐藥情況具有代表性。在采樣點隨機(jī)選取2 個不同的位置采集水樣，將50 mL 的離心管伸入水下15～25 cm 處，打開管蓋使水自然浸滿管子，在水下擰緊瓶口。將采集的水樣保存于4 ℃，并在8 h內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實驗分析。

1.3 耐藥菌株分離培養(yǎng)

分別取100 mL 水樣。用PBS 緩沖液10 倍梯度稀釋后，取100 uL 用涂布法分別涂布于2 組不同種類抗生素，包括氨芐西林（Ampicillin，Amp，100 g/mL）、慶大霉素（Gentamicin，Gen，10 g/mL）、四環(huán)素（Tetracycline，Tet，12.5 g/mL）和氯霉素（Chloramphenicol，Cm，30 g/mL）、卡那霉素（Kanamycin，Kan，25 g/mL）、諾氟沙星（Norfloxacin，Nor，4 g/mL）的固體LB 培養(yǎng)皿上，不含抗生素的LB培養(yǎng)板做對照，每組3個平行。將培養(yǎng)基分組置于28 ℃和37 ℃的培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)16～18 h，計算各種抗生素培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，并表示為菌落形成單位CFU/mL，平均2 個相鄰稀釋梯度的值，然后同無抗性LB 平板上的菌落對比，得到細(xì)菌的耐藥率（CFU=n1=第一平板克隆個數(shù)，n2=第二平板克隆個數(shù)，n3=第三平板克隆個數(shù)，c=稀釋梯度），用GraphPad prism進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并根據(jù)菌落的形態(tài)特征挑選出不同菌株進(jìn)行保種。

1.4 細(xì)菌基因組DNA的16 S rDNA的PCR擴(kuò)增與鑒定

根據(jù)菌落的形態(tài)特征，隨機(jī)從各個平板中挑出不同菌落，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2.5 uL 10×Ex Taq Buffer，2 uL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），引物27F（10 umol/L）、引物1 492R（10 umol/L）各0.5 uL，0.2 uL TaKaRa Ex Taq HS（5 U/uL），1 uL 的DNA 模板，補(bǔ)ddH2O 至25 uL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.5 16S rDNA 的測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，挑取陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇blast進(jìn)行同源性比對，并基于MEGA 軟件用近鄰法（Neighbor-Joining）構(gòu)建耐藥菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，在MEGA 主窗口菜單欄中選擇“Phylogeny"，再選擇Construct/Test Neighborjoining Tree，系統(tǒng)進(jìn)化樹，導(dǎo)出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐藥菌分布和耐藥菌耐藥率分析

在惠州市范圍內(nèi)的3個縣/區(qū)隨機(jī)選取4個采樣點（圖1）。將各采樣點水樣梯度稀釋，涂布于含不同抗生素的固體培養(yǎng)皿上，并在28 ℃與37 ℃下培養(yǎng)16 h，對長出的菌落進(jìn)行計數(shù)。

圖1 惠州市水樣采集分布圖

對菌落計數(shù)的結(jié)果顯示，在28 ℃的培養(yǎng)條件下，A采樣點分離的菌對氨芐西林以及諾氟沙星的耐藥率高達(dá)59.2%和53.74%；其次是對四環(huán)素和卡那霉素的耐藥率，分別為14.9%和8.1%；對慶大霉素的耐藥率為2.4%；對氯霉素的耐藥率最低為0.3%；B點分離出來的菌，對氨芐西林以及諾氟沙星抗生素的耐藥率則分別為40.4%和15.7%，對卡那霉素和四環(huán)素的耐藥率為5.9%和1.4%，對慶大霉素和氯霉素的耐藥率為0.4%和0；C 點分離出的菌對諾氟沙星、氨芐西林和卡那霉素的耐藥率達(dá)到29.5%、21.4%和20.2%，對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率分別為16.2%和5.7%，對于氯霉素的耐藥率是0.1%。D點分離的菌對氨芐西林和諾氟沙星的耐藥率高達(dá)75%和63.3%，對于四環(huán)素耐藥率為5%，而對卡那霉素，慶大霉素、氯霉素的耐藥率均低至0（圖2）。

圖2 不同采樣點不同種類抗生素在28 ℃下的耐藥率

在37 ℃的培養(yǎng)條件下，A采樣點分離出的細(xì)菌對諾氟沙星和氨芐西林的耐藥率分別為59.5%和57.8%，對四環(huán)素、慶大霉素和卡那霉素的耐藥率為13.94%、9.7%和9.3%，對氯霉素的耐藥率為0。B 點分離出來的菌對氨芐西林的耐藥率為44.6%，對諾氟沙星的耐藥率為27.1%，而對四環(huán)素和卡那霉素的耐藥率分別為2.2%和0.9%，對慶大霉素和氯霉素的耐藥率分別為0.3% 和0。C 點分離的菌對諾氟沙星耐藥率為53.64%。對氨芐西林的耐藥率19.3%，對卡那霉素的耐藥率為13.6%，對四環(huán)素的耐藥率為12.2%，對慶大霉素和氯霉素的耐藥率則為0.1%。D點分離培養(yǎng)的菌對氨芐西林和諾氟沙星的耐藥率分別為14.5%和13.8%，對四環(huán)素和慶大霉素的耐藥率則是0.7%，對卡那霉素和氯霉素的耐藥率為0（圖3）。

圖3 不同采樣點不同種類抗生素在37 ℃下的耐藥率

2.2 16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

分別在28 ℃和37 ℃條件下，不同抗性實驗組的平行平板上，隨機(jī)選取5 株形態(tài)不同的菌株，經(jīng)16S rDNA序列，得到46株菌株序列。比對結(jié)果顯示，此46株菌株分別屬于8 種不同菌屬（表1）。

表1 養(yǎng)殖水體的耐藥菌的16S rDNA的同源性對比

通過對16S rDNA 基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），發(fā)現(xiàn)樣品中最多的30 株屬于氣單胞菌屬（Aeromonas）；叢毛單胞菌屬（Comamonas）分離得到7株；不動桿菌屬（Acinetobacter）分離得到2 株；拉烏爾菌屬（Raoultella）分離得到2株；艾氏菌屬（Escherichia）分離得到2 株；短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）分離得到1株；假單胞菌屬（Pseudomonas）分離得到1株；克雷伯氏菌屬（Klebsiella）分離得到1株。

圖4 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 耐藥菌的分離及16S rDNA的序列分析

從分離出的菌株發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣單胞菌屬（Aeromonas）有65.22%，叢毛單胞菌屬（Comamonas）有15.21%，不動桿菌屬（Acinetobacter）有4.34%，拉烏爾菌屬（Raoultella）有4.34%，艾氏菌屬（Escherichia）有4.34%，短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）有2.17%，假單胞菌屬（Pseudomonas）有2.17%，克雷伯氏菌屬（Klebsiella）有2.17%（圖5A）。其中，產(chǎn)氣單胞菌屬耐藥的抗生素為氨芐西林、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星；叢毛單胞菌屬對卡那霉素、慶大霉素具有耐藥性，同時對氨芐西林和卡那霉素聯(lián)合用藥有著較高的耐藥性；不動桿菌屬對四環(huán)素、氯霉素具有耐藥性；拉烏爾菌屬對氨芐西林具有耐藥性；艾氏菌屬對四環(huán)素和氯霉素具有耐藥性；短穩(wěn)桿菌屬對慶大霉素具有耐藥性；假單胞菌屬對氯霉素具有耐藥性；克伯雷氏菌屬對四環(huán)素具有耐藥性（圖5B）。

圖5 基于16S rDNA序列分析的惠州市養(yǎng)殖水體菌屬組成

從圖6 可以看出，在所有對氨芐西林耐藥的菌株中，產(chǎn)氣單胞菌屬（Aeromonas）的耐藥率最高，為81.8%，拉烏爾菌屬（Raoultella）的耐藥率為18.2%；對諾氟沙星耐藥的菌株全部屬于產(chǎn)氣單胞菌屬，耐藥率為100%；在對卡那霉素耐藥的菌株為叢毛單胞菌屬和產(chǎn)氣單胞菌屬，耐藥率均為50%；對四環(huán)素耐藥的菌株50%屬于產(chǎn)氣單胞菌屬（Aeromonas），不動桿菌屬（Acinetobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、和艾氏菌屬（Escherichia）耐藥率均為16.7%；而對氯霉素耐藥的有假單胞菌屬（Pseudomonas）、不動桿菌（Acinetobacter）和艾氏菌屬（Escherichia）耐藥率各為33.4%；對慶大霉素耐藥最高的為產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas），耐藥率為60%，其次是叢毛單胞菌屬（Comamonas）和短穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）耐藥率各為20%；對氨芐西林和卡那霉素聯(lián)合用藥具有耐藥性的菌屬有產(chǎn)氣單胞菌屬和叢毛單胞菌屬，耐藥率分別為44.5%和55.5%。

圖6 不同抗生素耐藥菌屬組成

3 討論與結(jié)論

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中無法隔絕外部環(huán)境，因此，耐藥菌和耐藥基因?qū)⑾蛲鈹U(kuò)散，帶來養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化，從而使水產(chǎn)養(yǎng)殖品的抗病力下降，死亡率提高［10］。有研究者分離省外淡水養(yǎng)殖動物源的菌株，得到最主要的病原菌為產(chǎn)氣單胞菌屬的嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌和溫和氣單胞菌等［11］，其次為少量的假單胞菌屬、不動桿菌屬、檸檬酸桿菌和弧菌屬等潛在致病菌［12］。與上述研究結(jié)果相似，本研究中產(chǎn)氣單胞菌屬（65.22%）數(shù)量最多；但從惠州市養(yǎng)殖水體中分離出了與文獻(xiàn)中不同菌屬的不常見致病菌，有叢毛單胞菌屬（15.21%）、拉烏爾菌屬、短穩(wěn)桿菌屬和克雷伯氏菌屬等。

產(chǎn)氣單胞菌是一種廣泛分布于水生環(huán)境中的革蘭氏陰性細(xì)菌，在淡水環(huán)境中極其普遍，在水溫上升時期，產(chǎn)氣單胞菌會急速繁殖，在人類和動物中定居并感染，引發(fā)人類、魚類和其他水生動物的細(xì)菌疾病［13］。此類菌屬中的嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見病原菌，它攜帶溶血素、細(xì)胞毒素和腸毒素等多種毒力基因，感染叉尾鮰、黃顙魚等水生動物引發(fā)溶血性敗血癥和人類腹瀉［14］，造成水生動物的批量死亡和經(jīng)濟(jì)損失。朱永肖［15］調(diào)查河南沿黃漁區(qū)氣單胞菌耐藥性，結(jié)果顯示產(chǎn)氣單胞菌對青霉素和氨芐西林的耐藥率均為100%，對四環(huán)素、強(qiáng)力霉素和萘啶酸的耐藥率均超過了30%。實驗結(jié)果與文獻(xiàn)一致，該細(xì)菌對氨芐西林和諾氟沙星都具有較強(qiáng)的耐藥性，但對諾氟沙星耐藥的菌株全部是產(chǎn)氣單胞菌。

惠州市4 個采樣點3 個地區(qū)對氨芐西林和諾氟沙星的耐藥率最高，其主要原因是由于這2 類抗生素的應(yīng)用比較廣泛，長期使用使其產(chǎn)生了大量的耐藥菌。細(xì)菌耐藥程度與養(yǎng)殖水平、養(yǎng)殖模式和用藥習(xí)慣有關(guān)。博羅縣地處惠州北部，相對偏遠(yuǎn)，農(nóng)村以小規(guī)模魚塘養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖品種和抗菌藥物的使用不統(tǒng)一，這也可能是博羅地區(qū)與其他3個地區(qū)細(xì)菌的耐藥性存在一定差異的原因。

綜上所述，惠州市主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)水體中的細(xì)菌總耐藥率水平較高，其中對抗生素氨芐西林和諾氟沙星的耐藥率高，對四環(huán)素、氯霉素耐藥率較低。但是氯霉素同時能作用于人體線粒體從而引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，我國2002 年出臺《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》（193 號公告），將氯霉素列入禁用清單，禁止在所有食品動物上使用。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，不能使用氯霉素，盡量避免用氨芐西林和諾氟沙星類抗生素，可以將耐藥率低的四環(huán)素作為水產(chǎn)養(yǎng)殖的首選藥物。