葉玉珍，鐘志娟，李 馨，鐘富丹，黃鈺涵，毛露甜，徐良雄*

（1.惠州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 惠州 516007；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

細(xì)菌種類豐富，廣泛分布于自然界，有的細(xì)菌會導(dǎo)致植物病害，如青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）可在200多種植物中引發(fā)致命的“青枯病”［1］和由黑脛病菌（胡蘿卜軟腐歐文氏菌馬鈴薯黑脛亞種，Erwiniacarotovora subsp.atroseptica）引起馬鈴薯黑脛病可使植株根部變黑腐爛［2］，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量，造成農(nóng)作物的經(jīng)濟效益下降。而金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）可致使人類患病，危及人類的生命健康［3］?？股卦趹?yīng)對各類植物細(xì)菌病害、動物及人類細(xì)菌感染中發(fā)揮著十分重要的作用。然而，農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)及醫(yī)療領(lǐng)域中抗生素的大量使用和排放可造成環(huán)境長期殘留，進一步加速了細(xì)菌耐藥性的發(fā)生與擴散，給農(nóng)業(yè)病害防治與細(xì)菌感染臨床治療帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，新型抗生素的發(fā)現(xiàn)意義重大［4-5］。

植物內(nèi)生真菌資源豐富，其次生代謝物種類多樣、產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)獨特、不少具有良好的抗菌活性，是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的重要資源［6-7］。在前期抗菌活性植物內(nèi)生真菌的篩選中，已發(fā)現(xiàn)分離自銀葉樹的一株內(nèi)生黑孢菌HU0460，其玉米發(fā)酵物具有明顯的金黃色葡萄球菌拮抗活性，并從中發(fā)現(xiàn)了4個蒽醌類化合物，本研究將對其制備、鑒定過程和抗菌活性進行報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑孢菌Nigrosporasp.HU0460 于2018 年3 月分離自汕尾市海豐縣附近的銀葉樹Heritiera littoralisDryand枝條，保藏于實驗室；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）、大腸桿菌（Escherichia coli）購于廣東省微生物菌種保藏中心；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin resistantS.aureus，MRSA）由廣州呼吸疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室提供；青枯病菌（Ralstonia solanacearum）、黑脛病菌（Erwinia carotovora subsp.atroseptica）由實驗室分離鑒定。

1.2 儀器與試劑

提取及分離所用試劑均為分析純（天津大茂）；硫酸鏈霉素和甲氧西林（上海麥克林生化科技），萬古霉素（上海宏葉生物科技）；柱層析硅膠（74~150μm，煙臺江友硅膠）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（瑞典Amersham Biosciences）；LC-16P 高效液相色譜儀和LC-MS-8040 電噴霧質(zhì)譜儀（日本Shimadzu），Lambda紫外分光光度計（美國PerkinElmer），Synergy H1 多功能微孔板檢測儀（美國BioTek），Quantum-I核磁共振波譜儀（400 MHz，武漢中科牛津），Bio TOF IIIQ高分辨質(zhì)譜儀（德國Bruker），IP-digi300/3+旋光儀（上海儀邁儀器）。

1.3 菌株發(fā)酵

將活化好的菌塊接種至30 mL PDB 中，28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d 得到1 級種子液；吸取2 mL 菌液至裝有120 mL PDB 的三角瓶內(nèi)，相同條件下培養(yǎng)3 d，得到2級種子液；分別吸取5 mL 菌液均勻接種至150 瓶玉米固體培養(yǎng)基中，28 ℃黑暗靜置培養(yǎng)35 d。

1.4 發(fā)酵物提取與分離

發(fā)酵物以95%乙醇浸提3 次，提取液過濾后濃縮除去乙醇得到混懸液?；鞈乙阂砸宜嵋阴ポ腿〉玫揭宜嵋阴ゲ浚摬拷?jīng)正相硅膠（74~150μm）柱層析，以二氯甲烷-甲醇（100∶0~80∶20）梯度洗脫得到流份E1~22。合并流份E10（15.0 g）經(jīng)中壓反相硅膠柱層析，30%~100%甲醇—水梯度洗脫得到E10-1~12，其中E10-4 為化合物3（355.0 mg）。流份E10-11（1.0 g）經(jīng)凝膠柱層析，純甲醇溶液等度洗脫得到流份E10-11-1~6，流份E10-11-4（193.0 mg）經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析，20%~80%甲醇水溶液梯度洗脫得到化合物4（161.0 mg）。E12（2.0 g）經(jīng)中壓反相硅膠柱層析，30%~80%甲醇-水梯度洗脫得到E12-5-1~14，流份E12-5-10 經(jīng)HPLC 制備純化，30%甲醇—水等度洗脫得到化合物1（15.5 mg，tR= 30.4 min）和化合物2（6.5 mg，tR=41.2 min）。

1.5 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

通過綜合分析核磁共振譜、質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻鑒定化合物1~4的化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 化合物1~4的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.6 化合物活性評價

采用濾紙片瓊脂擴散法［8］與微量稀釋法［9］評價單體化合物的細(xì)菌拮抗活性，甲氧西林、萬古霉素與硫酸鏈霉素為陽性對照。濾紙片瓊脂擴散法中，陽性對照載樣量為40μg），化合物載樣量為100 μg，設(shè)置3 組重復(fù)，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：淡粉色固體粉末，ESI-MS：m/z355［M+H］+，353［M - H］-，707［2M - H］-，［α］24D= - 6.0（c0.1，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（log ε）212（2.45），236（2.66），290（3.58），366（3.43）nm。通過HRESIMS 顯示的準(zhǔn)分子離子峰m/z355.138 63［M+H］+（理論值為355.139 29），推斷其分子式為C17H22O8。1H NMR 譜（表1）顯示化合物1 存在1 個不飽和碳上質(zhì)子［δH6.51（s，1H），H-6］和4 個疑似連氧碳上質(zhì)子信號［δH4.66（d，J = 2.8 Hz，1H，H-9）；3.83（dd，J = 10.2，5.3 Hz，1H，H-4）；3.46（overlapped，1H，H-4a）；3.33（overlapped，1H，H-3）］和2 個甲氧基［δH3.96（s，3H）;δH3.45（s，3H）］和1 個甲基［δH1.18（s，3H）］質(zhì)子信號。13C NMR譜顯示該化合物共有17個碳信號，其中：包括1 個羰基（δC207.58）、6 個芳香環(huán)碳（δC160.77，158.30，139.76，124.03，109.24，100.61）、6個連氧碳［δC77.42，74.70，73.95，72.96，57.35，56.86］和其余5 個碳［δC45.87~27.35］信號。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)（溶劑為氘代甲醇）

通過1H-1H COSY、HSQC和HMBC譜（圖2）分析對上述質(zhì)子信號和碳信號進行歸屬，發(fā)現(xiàn)其與另一個蒽醌類化合物4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin［10］（2）具有類似的結(jié)構(gòu)骨架。但化合物1 中的C-4位為一個連氧碳［δH3.83（dd，J=10.2，5.3 Hz，1H，H-4）；δC74.70］，而非亞甲基。在NOESY譜，H-1a和H-1α（δ 1.55）、H-4、H-4a 相關(guān)，說明它們在空間上相互靠近，H-1a和H-4、H-4a位于該六元環(huán)的同側(cè)，C-4位的羥基處于β-位；H-3與H-1β（δ 1.09）、H-3、H-11相關(guān)，提示C-2 和C-3 位的羥基處于α-位。此外，其JH-9/H-1a、JH-1a/H-4a與4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin（2）一致，后者的絕對構(gòu)型通過X-單晶衍射得到了確認(rèn)［10］，因此推定化合物1的絕對構(gòu)型為1aS，2S，3R，4S，4aS，9R，該新蒽醌類化合物命名為4a-epi-4β，9α-dimethoxydihydrodeoxybostrycin。

圖2 化合物1的1H-1H COSY（粗線）和HMBC（箭頭）相關(guān)

化合物2：淡粉色固體粉末，ESI-MS：m/z337［MH］-，［α］24D=-12.5（c0.07，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（logε）211（2.36），244（2.11），289（2.73），357（3.55）nm。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ6.49（s，1H，H-6），4.65（d，J=2.8 Hz，1H，H-9），3.94（s，3H，H-12），3.43（s，3H，H-13），3.17（dd，J= 12.0，4.3 Hz，1H，H-3），3.13（m，1H，H-4a），2.87（m，1H，H-1a），2.60（ddd，J=12.6，4.3，2.5 Hz，1H，H-4α），1.75（td，J=12.6，5.3 Hz，1H，H-4β），1.56（ddd，J= 13.7，3.1，1.6 Hz，1H，H-1α），1.13（s，3H，H-11），1.00（t，J= 13.7 Hz，1H，H-1β）;13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ204.79（C-10），160.05（C-5），157.28（C-7），139.33（C-8），124.77（C-9a），109.06（C-10a），100.41（C-6），74.47（C-9），72.95（C-3），71.85（C-2），57.23（C-13），56.72（C-12），42.32（C-4a），39.55（C-1），36.32（C-1a），29.40（C-4），27.29（C-11）。對比文獻［10］，化合物2被鑒定為4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin。

化合物3：黃色固體粉末，ESI-MS：m/z339［MH］-，［α］28D=-85.3（c0.15，CH3OH）;UV（CH3OH）λmax（log ε）214（2.83），244（2.69），284（3.52），355（3.62）nm。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ6.49（s，1H，H-6），4.82（d，J= 9.8 Hz，1H，H-9），4.09（t，J= 9.2 Hz，1H，H-4），3.92（s，3H，H-12），3.28（d，J = 9.2 Hz，1H，H-3），2.40（td，J=13.2，9.2 Hz，1H，H-4a），2.35（m，1H，H-1β），2.30（m，1H，H-1a），1.44（dd，J= 13.6，11.4 Hz，1H，H-1α），1.33（s，3H，H-11）;13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ205.11（C-10），159.86（C-5），157.48（C-7），138.83（C-8），128.76（C-9a），109.40（C-10a），100.14（C-6），79.40（C-3），73.37（C-9），72.08（C-4），72.06（C-2），56.71（C-12），53.25（C-4a），41.06（C-1），40.74（C-1a），27.20（C-11）。比對文獻［10-11］化合物3鑒定為9α-hydroxyhalorosellinia A。

化合物4：棕紅色固體粉末，ESI-MS：m/z335［MH］-，［α］24D=- 87.8（c 0.1，CH3OH）; UV（CH3OH）λmax（log ε）212（2.97），254（2.97），299（3.46），501（3.39）nm。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ6.44（s，1H，H-6），4.73（d，J=4.5 Hz，1H，H-4），3.89（s，3H，H-12），3.50（d，J=4.5 Hz，1H，H-3），2.71（d，J=18.2 Hz，1H，H-1α），2.65（d，J= 18.2 Hz，1H，H-1β），1.21（s，3H，H-11）;13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ184.91（C-5），178.12（C-8），161.12（C-10），160.70（C-7），160.66（C-9），139.85（C-4a），137.45（C-1a），110.36（C-6），110.36（C-9a），108.10（C-10a），76.90（C-3），69.88（C-2），68.85（C-4），57.44（C-12），35.47（C-1），26.21（C-11）。對比文獻數(shù)據(jù)［10-11］，化合物4被鑒定為bostrycin。

2.2 化合物活性評價結(jié)果與分析

活性測試結(jié)果顯示（表2），100 μg 載樣量下，除大腸桿菌外，化合物1~4對其余4種測試菌均具有拮抗活性，其中化合物4的抗菌效果較好，其MRSA拮抗效果優(yōu)于40 μg 的硫酸鏈霉素，黑脛病菌拮抗效果與40 μg的硫酸鏈霉素相當(dāng)。MIC測定結(jié)果與濾紙片擴散法結(jié)果基本一致，其中化合物4對金黃色葡萄球菌、黑脛病菌和青枯病菌具有較好的細(xì)菌拮抗活性，其MIC 值分別為25、50、12.5 μg/mL?；衔? 對青枯病菌表現(xiàn)出較弱的抑制活性（MIC=100 μg/mL），以及化合物1 對黑脛病和青枯病菌具有微弱的抑制活性（MIC = 200 μg/mL），所有化合物對大腸桿菌均未表現(xiàn)出抑制活性（MIC ＞400 μg/mL）。

表2 化合物1~4對5種細(xì)菌的抑菌活性

3 討論與結(jié)論

在活性追蹤的指導(dǎo)下，本研究從銀葉樹內(nèi)生黑孢菌HU0460 玉米發(fā)酵物中分離鑒定了1 個新蒽醌類化合物4a-epi-4β，9α-dimethoxydihydrodeoxybostrycin（1）和3 個已知蒽醌類化合物4a-epi-9α-methoxydihydrodeoxybostrycin（2）、9α-hydroxyhalorosellinia A（3）和bostrycin（4）。其中，化合物4 得率高，且對金黃色葡萄球菌、黑脛病菌和青枯病菌的抗菌活性較強，其余3個化合物對上述測試菌表現(xiàn)出較弱的抑制活性。

黑孢屬真菌可產(chǎn)生如環(huán)肽類、萜類、甾體類和蒽醌類化合物等多種類型的代謝物，其中部分代謝產(chǎn)物具有不同的細(xì)菌拮抗活性［12］。UKWATTA［13］等從紅樹林植物內(nèi)生菌N.sphaerica中分離得到的苯基萘化合物nigronapthaphenyl，對枯草芽孢桿菌具有較強的抑制活性，MIC 值為2 μg/mL。TRISUWAN［14］等從Nigrospora sp.PSU-F18 分離得到的吡酮衍生物nigrosporapyrone A 其對金黃色葡萄球菌和MRSA 均有一定抑制活性。WANG［15］等研究發(fā)現(xiàn)紅樹林植物內(nèi)生菌Nigrospora sp.的蒽醌化合物4-deoxybostrycin 和nigrosporin B具有顯著的抑制結(jié)核分枝桿菌活性。除黑孢菌可產(chǎn)生蒽醌bostrycin［16］外，bostrycin 在鐮刀菌屬真菌的發(fā)酵物中也有報道［17］。bostrycin 不僅具有廣譜抗腫瘤活性，還是潛在的抗腫瘤藥物候選藥物［18］，同時對革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌也具有較強的細(xì)菌拮抗活性，MIC 值分別為0.26 μg/mL 和4.2 μg/mL，并且發(fā)現(xiàn)其乙酰基衍生物具有更強的抑制活性［10］。本研究發(fā)現(xiàn)Nigrosporasp.HU0460 玉米發(fā)酵物中bostrycin 得率較高，約占發(fā)酵物乙酸乙酯部分的1.4%，且對MRSA和革蘭氏陰性菌（青枯病菌和黑脛病菌）均具有良好的抑制活性。

本研究初步探討了黑孢菌HU0460 的抗菌活性物質(zhì)基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)了4個蒽醌類化合物，豐富了黑孢菌次級代謝產(chǎn)物多樣性，為該菌抗菌成分的深入研究奠定了基礎(chǔ)，對新型微生物源抗菌劑的研發(fā)具有一定的參考價值。