馮童禹，喬桂榮，蔣 晶，邱文敏，韓小嬌，卓仁英，劉明英＊

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 杭州 311400；2.南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

我國是農(nóng)業(yè)大國，土壤是立農(nóng)之本，卻被動承載著包括重金屬在內(nèi)的大部分污染物。我國重金屬污染的耕地面積達(dá)2 000 萬hm2，每年僅鎘污染的糧食達(dá)1 200 萬t，造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過200 億元[1]。重金屬元素的難降解、易富集及食物鏈的可傳遞性給生態(tài)環(huán)境和食品安全帶來嚴(yán)重威脅，是人類生命健康和安全的“隱形殺手”[2]。植物修復(fù)技術(shù)是近年重金屬污染土壤治理的研究熱點[3]，其中超積累型東南景天（Sedum alfredii Hance）是為數(shù)不多的鎘超積累植物之一[4]，可在地上部分累積鎘15 500 μg·g-1（干質(zhì)量）而不呈現(xiàn)任何毒害作用，是應(yīng)用于土壤鎘污染修復(fù)的寶貴材料[5]；同時，超積累型東南景天的極強(qiáng)耐鎘特性預(yù)示著其具有豐富的抗逆基因，是研究植物耐重金屬機(jī)理的理想物種。

為解析其鎘耐性及超積累的機(jī)制，大量的研究聚焦于超積累型東南景天的鎘吸收、轉(zhuǎn)運及解毒[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，超積累型東南景天可以通過高效的根-莖轉(zhuǎn)運機(jī)制將高濃度的鎘離子轉(zhuǎn)運到地上部分，并最終儲存于葉肉的薄壁細(xì)胞、莖的髓部及皮層組織中[9]。維持植物細(xì)胞內(nèi)金屬離子的平衡及內(nèi)穩(wěn)態(tài)是提高植物耐重金屬的關(guān)鍵[10]。研究表明，超積累型東南景天中有多個基因被發(fā)現(xiàn)與鎘離子轉(zhuǎn)運等相關(guān)，包括SaHMA3（heavy metal ATPase, HMA）[11]、SaNRAMP3（natural resistance-associated macrophage protein, NRAMP）[12]、SaNRAMP6[13]、SaMTP1（metal tolerance protein, MTP）[14]、SaZIP4[15]以及SaCAX2（cation exchangers, CAX）[16]。

ATP 結(jié)合盒（ATP-binding cassette,ABC）是目前發(fā)現(xiàn)的最大的、功能最廣泛的蛋白超家族之一，因其在跨膜運輸?shù)孜飼r需要借助水解ATP 釋放的能量完成而得名[17]。ABC 基因家族包括全分子和半分子2 種類型，全分子蛋白結(jié)構(gòu)包括2 個核苷酸結(jié)合域（NBD）和2 個跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD），半分子的蛋白只有1 個膜結(jié)構(gòu)域（MSD）和1 個NBD[17]。該基因家族廣泛存在于各類生物體中，在哺乳動物[18]、微生物[19]、植物[20]等生物中鑒定出ABC 家族的物種已超過100 種，其中，人類基因組中發(fā)現(xiàn)48 個ABC 基因[18]，參與細(xì)菌耐藥性、次生代謝物積累和腫瘤細(xì)胞的抗藥性等，受到國內(nèi)外研究者廣泛關(guān)注。在植物中，ABC 家族被認(rèn)為參與植物體內(nèi)激素[21]、脂質(zhì)[22]、金屬離子[23]、次生代謝物[24]以及調(diào)控植物與病原體相互作用[25]。然而，目前在超積累型東南景天中尚未開展該基因家族成員的研究。本研究以前期超積累型東南景天組學(xué)測序結(jié)果為基礎(chǔ)，借助同源比對鑒定超積累型東南景天ABC 家族基因，并開展生物信息學(xué)分析。另外，借助實時定量技術(shù)分析干旱、鹽堿等不同脅迫處理下ABC 基因的表達(dá)情況，為該基因功能的深入驗證奠定前期基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

本實驗所選用的植物材料為超積累型東南景天，水培于1/2 Hoagland-Arnon 營養(yǎng)液中并置于人工培養(yǎng)室中25℃、16 h 光照、8 h 黑暗培養(yǎng)，調(diào)節(jié)pH 為6.0，每3 d 更換一次水培營養(yǎng)液。

對于鹽堿、干旱和脫落酸（ABA）激素脅迫，選取長勢一致、根部發(fā)育健康、無發(fā)黃發(fā)紅等現(xiàn)象，且主根長度約7 cm 的植株進(jìn)行脅迫處理，處理條件和濃度參照前期實驗室的研究[26]，具體處理方法為：將東南景天幼苗根部浸入含有100 mmol·L-1NaCl、20%PEG6000、100 μmol·L-1ABA的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液中，對照幼苗在1/2 Hoagland溶液中培養(yǎng)，然后于0、0.5、1、6 、12 h 后分別取根系。每個時間點取3 個生物學(xué)重復(fù)，用于提取RNA 的根部質(zhì)量約0.1 g。將來自3 個生物學(xué)重復(fù)的所有樣品在-80℃ 下冷凍保存以供進(jìn)一步實驗。

主要試劑：T4 DNA 連接酶與 pGEM?-T-easy載體購自德國 Promega 公司；2×GoldStar Taq MasterMix、DM15000 DNA Marker 和 DM2000 DNA Marker 購自北京康為科技有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒 DNA 小量提取試劑盒購自Axygen 公司；Trizol Reagent 購自GIBCO BRL 公司；反轉(zhuǎn)錄酶購自Invitrogen 公司；實時熒光定量試劑盒購自大連寶生物工程有限公司（Takara）；引物合成及測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 超積累型東南景天總RNA 提取及cDNA 合成 參照GIBCO BRL 公司的Trizol Reagent 操作說明書提取東南景天正常生長樣品及鹽堿、干旱和ABA 激素脅迫處理下根部總RNA 的提取。提取出的總RNA 由1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并經(jīng)過紫外分光光度計測定其純度和濃度，使用TE Buffer 按照1:100 比例稀釋RNA 樣品，然后測定其在260、280、320 nm 下的吸光值，計算提取的總RNA 純度和含量。按照Invitrogen 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書合成cDNA，并置于-80℃冰箱保存用于后續(xù)基因表達(dá)情況分析。

1.2.2 超積累型東南景天ABC 家族基因獲取及生物信息學(xué)分析 在超積累型東南景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中通過本地Blast（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/）查找ABC 家族基因的氨基酸及編碼區(qū)序列[27]，然后利用 HMM（http://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmsearch）在線分析工具鑒定候選的unigenes 是否含有TMD 和NBD 結(jié)構(gòu)域，并根據(jù)測序數(shù)據(jù)的序列號進(jìn)行命名。

利用MUSCLE 軟件對SaABC 蛋白氨基酸全長序列進(jìn)行比對，隨后在MEGA 7.0 軟件中用Neighbor-Joining（NJ）法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，設(shè)置bootstrap 測試為1 000 個重復(fù)。用PFAM（https://pfam.xfam.org）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）在線預(yù)測網(wǎng)站確定候選基因的結(jié)構(gòu)域組成，再將這些候選基因氨基酸序列在TMHMM v2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)網(wǎng)站上預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain, TM）。

在前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析獲得的與鎘脅迫關(guān)系密切的關(guān)鍵基因（hub 類基因）[27]中查找隸屬于ABC 家族的基因，并下載該基因?qū)?yīng)的關(guān)聯(lián)基因（edge 基因）及相關(guān)性系數(shù)，篩選出皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson Correlation Coefficient, PCC）閾值大于等于0.40 的edge 基因作為后續(xù)分析對象。利用基迪奧生物omicshare 云平臺（http://www.omicshare.com/tools/）中的GO 富集分析功能對所有符合標(biāo)準(zhǔn)的edge 基因進(jìn)行GO 分類。最后利用Cytoscape v3.6.1 中的NetworkAnalyzer 插件對hub基因與edge 基因的相關(guān)性進(jìn)行分析，并生成可視化圖片。

1.2.3 不同脅迫處理下表達(dá)模式的分析 使用NCBI 網(wǎng)站的Primer-BLAST 在線工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）基于候選基因序列的非保守區(qū)設(shè)計實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）的引物qSaABC-F（5’-GGAGCAAGATG ACGTTCCTGA-3’）和qSaABC-R（5’-GCTTCACCG GTCCATCTTTTTC-3’）。利用大連寶生物工程有限公司（Takara）的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（Code No.RR820A）試劑盒在Applied Biosystems 7300 實時熒光定量PCR 儀中進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。具體反應(yīng)體系如下：2×TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，Primer-qSa12F279-F（10 μmol·L-1）0.8 μL，Primer-qSa12F279-F（10 μmol·L-1）0.8 μL cDNA 2 μL，dH2O 6 μL。將上述反應(yīng)物短暫離心后置于Applied Biosystems 7300 實時熒光定量PCR 儀中，按照兩步法設(shè)置實時熒光定量PCR 擴(kuò)增程序如下：階段1：95℃ 30 s；階段2：95℃ 5 s，60℃ 31 s（40 個循環(huán)）；融解曲線：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

以SaUBC9 基因作為內(nèi)參基因[28]，采用2-ΔΔCT的方法[29]計算候選SaABC 基因在根中鹽脅迫、干旱脅迫和ABA 激素脅迫下的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sa12F279 基因的進(jìn)化分析

在東南景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中運用本地Blast 查找到表達(dá)水平受到鎘脅迫調(diào)控的ABC 基因。該基因的開放閱讀框長度為4 497 bp，編碼蛋白長度為1 498 個氨基酸，相對分子量為167.1 KD，等電點為6.92，根據(jù)測序數(shù)據(jù)的編號將其命名為Sa12F279基因。

以模式生物擬南芥（Arabidopsis thaliana）的ABC 家族成員為參照基因，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，鑒定Sa12F279 基因的亞家族分類。進(jìn)化樹顯示：擬南芥的ABC 成員聚為11 個亞類，Sa12F279 基因與C 亞類成員聚為一類，并與AtABCC9（AT3G601601）和AtABCC15（AT3G609701）2 個基因關(guān)系最相近（圖1）。

2.2 Sa12F279 基因的蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成

基于在線網(wǎng)站pHammer 等分析Sa12F279 基因的結(jié)構(gòu)域組成分布情況，鑒定其是否與擬南芥ABC 家族中的C 亞類成員類似，具有保守結(jié)構(gòu)域排布。分析顯示：Sa12F279 基因的蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)成呈現(xiàn)TMD-NBD-TMD-NBD 的排布方式（圖2）。Sa12F279 基因的TMD 和NBD 與擬南芥ABC 家族C 亞類成員的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域長度差異較小；除AtABCC15 外，4 個結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的定位位置也較為相近。結(jié)構(gòu)域排布及分布的一致性也佐證了該基因為C 亞類的一員，為其功能探索提供了方向。

利用MegAlign 軟件進(jìn)行同源比對分析顯示：Sa12F279 基因與擬南芥ABC 家族的15 個C 亞類成員的氨基酸序列一致性在45.3%～77.1%，其中，2 個NBD 結(jié)構(gòu)域和2 個TMD 結(jié)構(gòu)域序列具有保守基序的一致性，NBD 結(jié)構(gòu)域也包含了Walker A、Walker B 以及ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的一致基序（圖3）。

2.3 Sa12F279 基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

Sa12F279 基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示：其與567 個基因存在功能上的關(guān)聯(lián)（圖4）。對這些基因進(jìn)行功能注釋，結(jié)果顯示：39.8%的基因執(zhí)行代謝相關(guān)功能（Metabolic process），29.3%的基因與細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程相關(guān)（Cellular process），10.2%的基因涉及生物調(diào)控（Biological regulation），7.1%的基因參與轉(zhuǎn)運活性（Transporter activity）。通過關(guān)聯(lián)基因的功能，作者推測該基因更有可能擔(dān)負(fù)著細(xì)胞內(nèi)代謝物質(zhì)等的運輸，與超積累型東南景天的生長發(fā)育等進(jìn)程密切相關(guān)。

圖1 以擬南芥ABC 家族基因為參照的Sa12F279 基因的進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of Sa12F279 with reference to AtABC family

2.4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的Sa12F279 基因鎘脅迫表達(dá)分析

利用前期獲得的鎘脅迫前后超積累型東南景天的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，進(jìn)行Sa12F279 基因鎘脅迫表達(dá)分析（圖5）。結(jié)果顯示：在鎘脅迫24 h 的樣品中，Sa12F279 基因在根、莖、葉3 種組織中均出現(xiàn)了下調(diào)的應(yīng)答模式，與對照組相比，根和莖中的下調(diào)比葉中更顯著。在鎘脅迫96 h 的樣品中，Sa12F279基因的表達(dá)水平與鎘脅迫24 h 相比未出現(xiàn)顯著變化。基于此，作者推測Sa12F279 基因有可能不直接參與鎘脅迫應(yīng)答，有可能與其它脅迫相關(guān)，或參與正常生理進(jìn)程的維持。

2.5 Sa12F279 基因不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

圖2 Sa12F279 基因與擬南芥ABC 家族C 亞類成員的結(jié)構(gòu)域組成比較Fig.2 Comparison of domian structure among Sa12F279 and C-subfamily of AtABC

為進(jìn)一步分析Sa12F279 基因?qū)ζ渌硇苑巧锩{迫的響應(yīng)情況，采用實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）方法，研究干旱、鹽堿及ABA 激素處理下Sa12F279 基因在根中的響應(yīng)模式，并借助SPSS 軟件進(jìn)行T-test 顯著性分析（圖6）。結(jié)果顯示：在ABA 激素處理0.5 h 時，Sa12F279 基因出現(xiàn)表達(dá)量的顯著下調(diào)，隨后出現(xiàn)表達(dá)量的上調(diào)應(yīng)答，在1 h 和12 h 處理條件下呈現(xiàn)表達(dá)量的上升（圖6A）。在鹽脅迫處理條件下，Sa12F279 基因在處理前期未有明顯的表達(dá)量變化，而在12 h 處理時出現(xiàn)表達(dá)量的顯著上調(diào)（圖6B）。在干旱脅迫處理下，Sa12F279 基因在1 h 處理時顯著下調(diào)，其他時間點表達(dá)量升高或變化不明顯（圖6C）。綜合3 種脅迫處理，作者發(fā)現(xiàn)，Sa12F279 基因?qū)Σ煌{迫的響應(yīng)趨勢存在差異，但均未有極顯著的應(yīng)答產(chǎn)生，這意味著Sa12F279 基因可能更重要的功能是參與生長發(fā)育的調(diào)控，但具體功能仍需更有力的實驗結(jié)果進(jìn)一步證實。

3 討論

超積累型東南景天是鎘超積累植物，蘊含了大量與鎘耐性、吸收相關(guān)的基因[8,30]。它既是研究鎘耐性及富集機(jī)制的寶貴材料，同時在植物修復(fù)中具有巨大的應(yīng)用潛力。ABC 類蛋白作為介導(dǎo)物質(zhì)運輸?shù)闹匾易澹涔δ苎芯恳恢笔艿綇V泛的關(guān)注[31-32]。在人類中，研究者針對ABC 家族的C 亞類轉(zhuǎn)運蛋白的底物特異性、對組織表達(dá)以及轉(zhuǎn)運動力學(xué)開展廣泛的研究，而這些研究對探索細(xì)胞功能、新藥物研發(fā)和藥物代謝研究等都具有非常重要的意義[25]。在植物中，ABC 家族的C 亞類轉(zhuǎn)運蛋白最初被發(fā)現(xiàn)是位于液泡上，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運谷胱甘肽復(fù)合物[33]；后續(xù)隨著研究的深入，該家族成員被發(fā)現(xiàn)參與重金屬污染物的攝取[34]、鹽脅迫的抵御[35]、根際分泌物的運輸[36]以及離子通道的調(diào)節(jié)[34]。然而該家族成員在超積累型東南景天中尚缺乏相關(guān)研究。

本研究在前期鎘脅迫東南景天轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中[27]鑒定了屬于ABC 家族的1 個基因，并將其命名為Sa12F279 基因。對該基因的進(jìn)化及蛋白結(jié)構(gòu)的研究有助于提供該基因功能的線索。通過進(jìn)化分析，作者發(fā)現(xiàn)，Sa12F279 基因與擬南芥ABC 轉(zhuǎn)運蛋白家族中的C 亞類聚為一簇，同時也呈現(xiàn)TMD和NBD 結(jié)構(gòu)域的保守排布形式。這意味著Sa12F279基因的功能或許更傾向于C 亞類成員的功能，然而同一基因家族成員之間功能也存在著差異或冗余[31,37]，需要開展深層次的功能研究。

圖3 Sa12F279 基因與擬南芥ABC 家族C 亞類成員結(jié)構(gòu)域的同源比對分析Fig.3 Alignment of NBD and TMD domians among Sa12F279 and C-subfamily of AtABC

圖4 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的Sa12F279 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Co-expression network analysis of Sa12F279

圖5 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的Sa12F279 基因脅迫24、96 h 下根、莖、葉組織的鎘響應(yīng)模式Fig.5 The 24 h and 96 h Cd responsive patterns of Sa12F279 in the root, stem and leaf based on the transcriptomic data

圖6 Sa12F279 基因在ABA 激素、鹽堿及干旱脅迫下根中的響應(yīng)模式。Fig.6 The responsive patterns of Sa12F279 in the root under the abiotic stresses including ABA, salt and drought.

轉(zhuǎn)錄組測序反映了整體水平上mRNA 的表達(dá)及不同基因之間的關(guān)聯(lián)[38-39]。通過分析Sa12F279基因在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的關(guān)聯(lián)基因，作者發(fā)現(xiàn)其功能關(guān)聯(lián)的基因多參與代謝途徑、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程以及生物調(diào)控等；同時，其對鎘脅迫的響應(yīng)呈現(xiàn)下調(diào)的應(yīng)答模式。這意味著Sa12F279 基因的功能可能更偏重于參與生長、發(fā)育等進(jìn)程，在鎘脅迫下，其表達(dá)受到抑制，便于植物體調(diào)控更為核心的ABC 家族成員響應(yīng)脅迫。同樣，在擬南芥中，不同的ABCC成員的功能也存在較大的差異，并非所有的成員都與重金屬的轉(zhuǎn)運或耐性相關(guān)，如AtABCC4 調(diào)控氣孔的運動[40]，AtABCC6 被發(fā)現(xiàn)與根的次生生長相關(guān)[41]。

另外，作者發(fā)現(xiàn)，Sa12F279 基因?qū)BA 激素、鹽堿和干旱3 種非生物脅迫的應(yīng)答模式也存在差異，且表達(dá)量的變化幅度較平緩，這在另一方面佐證了作者對Sa12F279 基因的功能推測。然而，表達(dá)水平的變化受到多種因素的影響[42]，僅通過鎘、干旱、ABA 激素及鹽堿脅迫響應(yīng)模式斷定其是否參與重金屬離子的轉(zhuǎn)運及解毒尚不夠充分，更強(qiáng)有力的實驗證據(jù)源自基因的異源表達(dá)及轉(zhuǎn)基因材料的鎘耐性及鎘含量。而作者的研究工作將為超積累型東南景天ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的研究提供前期基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

4 結(jié)論

在東南景天轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，作者通過序列比對獲得1 個ABC 家族成員的基因，并將其命名為Sa12F279 基因。Sa12F279 基因在進(jìn)化上與C 亞類成員聚為一簇，且在結(jié)構(gòu)域構(gòu)成上符合ABC 家族的保守排列。Sa12F279 基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析顯示：與其功能關(guān)聯(lián)的基因多參與代謝途徑、細(xì)胞內(nèi)進(jìn)程以及生物調(diào)控等。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示：Sa12F279基因?qū)︽k脅迫呈現(xiàn)下調(diào)響應(yīng)，對ABA 激素、鹽堿和干旱脅迫的應(yīng)答模式也存在差異，且表達(dá)量的變化幅度較平緩。在ABA 激素處理下，呈現(xiàn)先下調(diào)后上升的趨勢；在鹽脅迫下，呈現(xiàn)早期響應(yīng)不顯著而于脅迫后期出現(xiàn)上調(diào)應(yīng)答；在干旱處理下，呈現(xiàn)先升后降又升的趨勢?；谏鲜鲅芯?，作者推測Sa12F279 基因可能更多地參與生長、發(fā)育等代謝進(jìn)程，而非鎘脅迫或其它非生物脅迫的主要響應(yīng)因子，更加精確的功能有待更進(jìn)一步的功能研究。