李燕中，李 強(qiáng)，鄔學(xué)清，吳亞麗，金 宏，劉拴成

(1.集寧師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院；2.集寧師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000)

黃芪為豆科多年生藥用草本植物，是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，作為天然中草藥，又名綿芪、綿黃芪，有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”的美稱[1,2]?！吨袊幍洹分杏涊d黃芪包括蒙古黃芪和膜莢黃芪兩種，蒙古黃芪主要分布在我國的內(nèi)蒙古、河北、山西等地；膜莢黃芪分布于吉林、遼寧、黑龍江、河北、內(nèi)蒙古、山西、陜西和甘肅等地。其藥性溫和、味甘，有補(bǔ)氣升陽、止汗固表、利水消腫、排膿托毒、行滯通痹等臨床功效，可用于氣虛乏力、中氣下陷、表虛自汗、氣虛水腫、血虛萎黃等的治療[1]。黃芪作為一種免疫促進(jìn)劑或免疫調(diào)節(jié)劑在人醫(yī)臨床已廣泛應(yīng)用，同時(shí)黃芪作為飼料添加劑還能夠改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能，增強(qiáng)多種動(dòng)物的免疫功能[3]，并且黃芪還可作為外源性抗氧化劑，提高機(jī)體抗氧化能力，改善肉質(zhì)和風(fēng)味，延緩酸敗程度[4,5]。

黃芪的化學(xué)成分眾多，主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類及氨基酸類等。黃芪甲苷是黃芪中的主要活性成分之一，是目前評(píng)價(jià)黃芪質(zhì)量及黃芪制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)性成分[6,7]。黃芪甲苷具有增強(qiáng)免疫功能、抗炎、降壓、穩(wěn)定紅細(xì)胞膜、提高血漿環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量和促進(jìn)小鼠再生肝DNA合成等多種作用[8,9]。

1 黃芪甲苷提取方法和工藝現(xiàn)狀及存在的問題

中藥提取有著久遠(yuǎn)的歷史，煎煮法、冷浸漬法、回流法、索氏提取法等都是傳統(tǒng)的提取分離手段[10]。目前，黃芪甲苷提取方法常采用浸泡提取法、索氏提取器提取法、超臨界流體萃取法和發(fā)酵法[11，12]，純化方法常用大孔樹脂吸附法和堿化處理法。雖然也有研究人員提出超聲提取法、微波輔助萃取法、超高壓提取法、加速溶劑萃取法等，但實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用較少。

判斷黃芪甲苷提取工藝是否優(yōu)良可以考慮以下幾個(gè)因素：①黃芪甲苷得率的高低；②整個(gè)工藝流程是否經(jīng)濟(jì)；③黃芪甲苷的活性。常規(guī)提取工藝往往存在提取效率低、提取時(shí)間長(zhǎng)、雜質(zhì)含量大、溶劑消耗大、操作流程復(fù)雜等缺點(diǎn)，阻礙了黃芪甲苷的研究與開發(fā)。因此，筆者總結(jié)了近年有關(guān)黃芪甲苷提取工藝的研究，以便為后續(xù)黃芪甲苷的研究開發(fā)提供依據(jù)。

2 黃芪甲苷提取方法和工藝的研究進(jìn)展

近年來，有不少關(guān)于黃芪甲苷提取工藝改進(jìn)與優(yōu)化的研究報(bào)道，常用的提取方法和工藝主要分以下幾類。

2.1 熱提法

熱提法主要包括煎煮法、回流提取法以及連續(xù)提取法，是一種傳統(tǒng)提取方法，一直沿用至今。研究人員在使用熱提法過程中不斷優(yōu)化黃芪甲苷的熱提條件。一些研究人員對(duì)黃芪甲苷提取工藝進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn)的研究[13-16]，其中，昝麗霞選取了黃芪甲苷含量、干膏收率、總黃酮含量指標(biāo)，考察了影響黃芪中有效成分提取的因素，結(jié)果顯示，乙醇濃度為70%時(shí)，在70℃下，以1∶12的料液比提取3 h，測(cè)得干膏有25%左右得率，黃芪甲苷含量超過3%[13]。在該工藝條件下，優(yōu)選出的黃芪乙醇提取工藝相對(duì)科學(xué)、經(jīng)濟(jì)，能有效節(jié)約資源，可進(jìn)一步開展用于工業(yè)生產(chǎn)的研究。

馬雪松等對(duì)比了回流提取法與煎煮法，選取指標(biāo)為黃芪甲苷得率，考查了提取方法和影響因素。結(jié)果表明，藥材充分粉碎后，經(jīng)8 h預(yù)浸泡，pH值均對(duì)煎煮法和回流提取法產(chǎn)生了主要影響，在pH值為12時(shí)，煎煮法在60℃下首次煎煮1 h是最佳提取條件，而回流提取法所用乙醇用量為藥材質(zhì)量的6倍，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)提取效果最好[14]。

黃際薇以黃芪甲苷含量為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，考察了藥材粒徑、浸泡時(shí)間和提取次數(shù)的影響因素，篩選出黃芪甲苷提取最佳工藝條件是過40目篩的藥材經(jīng)浸泡時(shí)間6 h，3次提取[16]。

張素清等采用醇提法，以黃芪甲苷提取量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)分析與R語言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及遺傳算法，優(yōu)化了黃芪中有效成分黃芪甲苷的提取工藝。結(jié)果表明R語言結(jié)合BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型具有良好的預(yù)測(cè)性，為優(yōu)化中藥材提取及相關(guān)制劑工藝提出了一種新的優(yōu)化方法[17]。

2.2 超臨界流體萃取法

宋振民等以黃芪甲苷的含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法，優(yōu)化了肺痿顆粒中黃芪甲苷的超臨界CO2萃取最佳工藝。結(jié)果顯示該優(yōu)選工藝有效成分提取率高，最佳提取工藝是利用95%乙醇夾帶劑濃度，粉碎粒度40目、提取時(shí)間1.5 h、采用10 mL·min-1夾帶劑流速進(jìn)行超臨界萃取[18]。

紀(jì)莎等用正交試驗(yàn)優(yōu)化了黃芪中黃芪甲苷超臨界CO2萃取法提取工藝[19]，以黃芪甲苷得率為考察指標(biāo)，用超臨界CO2萃取法提取黃芪甲苷，考察了萃取壓力、溫度、時(shí)間、萃取劑流速這幾種影響因素。結(jié)果表明，超臨界CO2萃取法提取黃芪甲苷的最佳工藝條件是:在45 ℃萃取溫度、45 MPa萃取壓力、萃取劑流速選擇20 L·h-1，經(jīng)過2 h萃取。

2.3 發(fā)酵法

隨著中藥發(fā)酵技術(shù)的不斷開展，大量學(xué)者運(yùn)用發(fā)酵技術(shù)以實(shí)現(xiàn)中藥有效成分的釋放，這不僅能提高中藥有效成分的釋放量，還可通過微生物對(duì)中藥的纖維、糖類、蛋白質(zhì)等成分進(jìn)行利用和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生包含多種活性成分的制劑或新藥[20]。中藥發(fā)酵借助于酶和微生物的作用，在一定的環(huán)境條件下(如溫度、濕度、空氣、水分等)，使藥物通過發(fā)酵過程，改變其原有性能，增強(qiáng)或產(chǎn)生新的功效。

侯美如等利用紫外分光光度法，測(cè)定了水浸法、水煎法兩種提取方法對(duì)黃芪與發(fā)酵黃芪中總皂苷的提取量[21]。研究結(jié)果表明發(fā)酵黃芪經(jīng)水浸法、水煎法提取的總皂苷量顯著高于對(duì)照黃芪的提取量，可能是皂苷熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間高溫處理使皂苷受損，從而導(dǎo)致含量下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)黃芪經(jīng)產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵后，降解了中草藥細(xì)胞壁的組成成分，如木質(zhì)素和纖維素等，使得包裹在細(xì)胞壁內(nèi)活性成分能夠釋放，進(jìn)而提高黃芪總皂苷的含量。中藥發(fā)酵不再需要化學(xué)提取劑，因而工藝簡(jiǎn)單、成本低，也是優(yōu)勢(shì)之一。

3 常用黃芪甲苷純化方法探討

熱提產(chǎn)物通常用萃取來進(jìn)行純化，然而萃取法所用溶劑耗費(fèi)量大，富集效果差。為此不少研究者進(jìn)行了純化方法的探討。其中使用多、效果相對(duì)較好的有大孔吸附樹脂純化法和堿化處理法。

3.1 大孔吸附樹脂純化法

有研究表明，通過大孔吸附樹脂處理，可以提高黃芪甲苷的純度。蔣思德等利用3種樹脂對(duì)黃芪皂苷進(jìn)行了吸附和解吸實(shí)驗(yàn)[22]，發(fā)現(xiàn)最適合黃芪皂苷純化的是D101樹脂，最佳條件下黃芪甲苷能達(dá)到93.21%的轉(zhuǎn)移率。而馮俊選擇75%乙醇作為醇提試劑，之后利用大孔樹脂吸附法純化黃芪皂苷，也發(fā)現(xiàn)D101樹脂由于解析率高，適合黃芪提純?cè)碥铡?/p>

葛慷艷等利用甲醇回流提取黃芪甲苷，水溶液用水飽和的正丁醇萃取，合并正丁醇液后用氨試液洗滌，之后用丁醇飽和的水萃取，比較了高效液相色譜—紫外檢測(cè)法與CAMG薄層掃描法對(duì)黃芪甲苷含量的測(cè)定[23]。由于前者僅在200 nm處有弱的末端吸收，噪音對(duì)結(jié)果影響較大，結(jié)果重現(xiàn)性差。而薄層掃描法重現(xiàn)性好，不受紫外下無吸收成分的影響，相對(duì)來說是較好的一種黃芪甲苷含量測(cè)定方法。同時(shí)對(duì)樣品制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，對(duì)照使用D101大孔樹脂進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)不用樹脂進(jìn)行分離時(shí)，黃芪甲苷含量要高出10%左右，使用大孔樹脂進(jìn)行分離可能會(huì)導(dǎo)致一部分黃芪甲苷損失。

章詩迪對(duì)大孔樹脂洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)用大孔樹脂富集黃芪甲苷時(shí)，最佳洗脫條件為純水、30%乙醇水溶液依次除雜，并用70%乙醇水溶液富集[24]。

3.2 堿化處理法

楊曉雷等研究了從黃芪生藥中提取黃芪甲苷的新工藝[25]，采用黃芪生藥和提取液比為1∶12的5% NaOH溶液加熱回流提取，經(jīng)HPD300大孔樹脂柱去除雜質(zhì)，再用正丁醇萃取，黃芪甲苷得率高于傳統(tǒng)工藝，操作簡(jiǎn)單，純度較高。

楊長(zhǎng)花等發(fā)現(xiàn)黃芪藥材產(chǎn)地、質(zhì)量不同，測(cè)定黃芪甲苷含量，各不相同?？傮w來看，堿化處理后黃芪甲苷含量明顯高于未用堿處理的[26]。她們比較了4個(gè)主要黃芪產(chǎn)地黃芪質(zhì)量，利用冷浸法測(cè)定水溶性浸出物和醇溶性浸出物，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定黃芪甲苷的含量，結(jié)果表明，4個(gè)主要黃芪產(chǎn)地黃芪的水溶性浸出物含量均比醇溶性浸出物含量高。其中黃芪甲苷含量測(cè)定結(jié)果顯示，內(nèi)蒙古出產(chǎn)的黃芪質(zhì)量最為優(yōu)質(zhì)，其次是甘肅、山西和黑龍江出產(chǎn)的黃芪。

也有研究人員對(duì)黃芪甲苷提取時(shí)減少雜質(zhì)的干擾進(jìn)行了研究。韓鳳波發(fā)現(xiàn)用NaOH調(diào)節(jié)pH至11，經(jīng)過75%堿性乙醇?jí)A化處理后，能促進(jìn)黃芪皂苷向黃芪甲苷轉(zhuǎn)化[27]。用甲醇洗滌進(jìn)行黃芪甲苷純化，工藝簡(jiǎn)單，減小了黃酮類、蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)對(duì)于黃芪甲苷制備的干擾。

由于黃芪甲苷為水溶性物質(zhì)，在黃芪復(fù)方制劑中黃芪甲苷易與組分中其他成分極性近似、理化性質(zhì)相近的水溶性成分互相干擾，不易進(jìn)行質(zhì)量控制。而不少含黃芪新藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1,28]中，柱層析分離純化樣品仍需要在采用索氏提取、正丁醇萃取等操作后使用，導(dǎo)致操作繁復(fù)，無法對(duì)一些復(fù)雜的復(fù)方制劑進(jìn)行分離測(cè)定。為解決該問題，張玲等人采用甲醇回流，再用水飽和正丁醇提取黃芪甲苷，而正丁醇提取液用堿洗后經(jīng)水洗到中性以便除去雜質(zhì)[29]。采用雙波長(zhǎng)薄層掃描法，分析了5種以黃芪為主藥的中成藥中黃芪甲苷的含量，該提取方法不需要上柱分離，就能有效除去雜質(zhì)，方法簡(jiǎn)便快捷，具有比較好的準(zhǔn)確度和精密度，適用于黃芪制劑的質(zhì)量控制。

夏廣萍等進(jìn)一步利用不同處理方法對(duì)黃芪甲苷含量影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)[30]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用氫氧化鈉溶液處理的大孔吸附樹脂法，其結(jié)果與藥典法中索氏提取法所測(cè)的含量之間無明顯差異，而使用氫氧化鉀甲醇溶液皂化，經(jīng)加熱回流處理后的黃芪甲苷含量最高，與前面兩種方法相比，測(cè)量結(jié)果差異較大。

張金紅等采用正交實(shí)驗(yàn)，利用堿水解法顯著提高了黃芪中黃芪甲苷收率[31]。以黃芪甲苷的收率為考察指標(biāo),優(yōu)選黃芪甲苷的提取工藝。發(fā)現(xiàn)對(duì)黃芪甲苷的收率起主要作用的是NaOH溶液濃度,最佳工藝條件為選用0.100 mol·L-1NaOH溶液,室溫水解2 h,黃芪與堿溶液料液比為1∶12,結(jié)果顯示，經(jīng)堿水解法的黃芪甲苷含量大約是未經(jīng)堿處理對(duì)照組的16.4倍。該方法簡(jiǎn)便易行,為工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。

章詩迪對(duì)提取液pH條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)雖然pH值為13時(shí)提取出的黃芪甲苷含量最高，但由于配制堿液所用氫氧化鈉為雜質(zhì)，在工業(yè)生產(chǎn)中盡可能除去，而pH為12時(shí)的黃芪甲苷純度與pH為13的結(jié)果接近，為節(jié)約除雜成本，生產(chǎn)中建議采用pH值為12[24]。

4 小結(jié)

目前黃芪甲苷傳統(tǒng)提取方法存在的問題是黃芪甲苷得率低、缺少優(yōu)化工藝導(dǎo)致黃芪甲苷純度低、得率偏低，可以采取提取后再進(jìn)一步純化的方法提高黃芪甲苷的純度。也有的提取過程繁雜、藥材浪費(fèi)多，而且黃酮、多糖等成分對(duì)于黃芪甲苷提取有一定的影響，可以采用堿化處理后，用甲醇洗滌進(jìn)行黃芪甲苷純化，減小黃酮類、蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)對(duì)于黃芪甲苷制備的干擾。正丁醇萃取處理可以提高純度，但是正丁醇沸點(diǎn)高，溶劑回收難。可以采用甲醇回流，再用水飽和正丁醇提取黃芪甲苷，而正丁醇提取液用堿洗后經(jīng)水洗到中性以便除去雜質(zhì)。雖然超臨界流體萃取提取率比一般提取方法高，但是因?yàn)槠鋬x器設(shè)備本身造價(jià)高，使用、維護(hù)費(fèi)用也較高，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還需進(jìn)一步提升工藝方法。黃芪發(fā)酵無須化學(xué)提取劑，工藝簡(jiǎn)單，成本低，有的研究試驗(yàn)采用解淀粉芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，安全性較好?？傮w來說，應(yīng)根據(jù)黃芪種類及其有效活性成分性質(zhì)的不同，選擇合適的提取工藝來提高黃芪甲苷含量。