黃晶 雷玉華 華曉芳 周慧 朱賢林

急性心肌梗死是臨床中常見的一種心血管疾病，具有較高的致死率，在急性心肌梗死早期常常表現(xiàn)為冠狀動脈急性、持續(xù)性因缺血、缺氧導(dǎo)致心肌細胞大量死亡，是導(dǎo)致患者出現(xiàn)心肌重構(gòu)，引發(fā)心力衰竭的主要原因[1,2]。PI3K/AKT/GSK3β可以促進心肌細胞增殖分裂，活化多種效應(yīng)分子，在心肌細胞的存活方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，同時可以作為治療急性心肌梗死的關(guān)鍵分子靶點[3,4]。miRNA在多種心血管系統(tǒng)中均有表達，在心臟發(fā)育、心率失常、心肌重構(gòu)、心肌細胞凋亡等病理變化中均有參與[5]。miR-208在心肌組織中顯示特異性表達，具有較高的保守性。本文旨在研究基于PI3K/AKT/GSK3β信號通路研究下調(diào)miR-208a對急性心肌梗死模型大鼠的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本文選取健康、清潔級SD雄性大鼠40只，體重220～260 g，均由華北理工大學(xué)提供，合格證號:SYXK(冀)2020-007。鼠齡6～8周。大鼠均給予常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，黑/白光照交替12 h，溫度為20～25℃，濕度為40%～50%。

1.2 方法

1.2.1 急性心肌梗死模型建立：本文參考李曉琳等[6]的文獻建立模型：模型制備前12 h大鼠禁食，將大鼠麻醉后在胸前備皮，將大鼠頭、四肢固定，腹部朝上，常規(guī)消毒。在大鼠左側(cè)胸部第3、4肋間作橫切口，肌肉層分離后，將其胸腔撐開，確定心臟位置，心包膜撕開，心臟完全暴露后，找到左冠狀動脈前降支，在其2～3 mm 處使用6-0帶針線穿過前降支，結(jié)扎，將切口縫合。假手術(shù)組不做結(jié)扎，只穿線。發(fā)現(xiàn)大鼠左心室變白，心率減緩，Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，表現(xiàn)為弓背向上型，說明模型建立成功。40只大鼠成功37只。

1.2.2 分組及干預(yù)：37只中有10只為假手術(shù)組，其余為模型組、空白組、miR-208a轉(zhuǎn)染組，每組9只。下調(diào)miR-208a通過敲低miR-208a實現(xiàn)，100 nmol/L轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染miR-208a，分為miR-208a轉(zhuǎn)染組，空白組使用100 nmol/L轉(zhuǎn)染miRNA抑制劑轉(zhuǎn)染無意義序列，均由中共廣州銳博公司提供。模型組、假手術(shù)組2組均給予等體積的生理研究干預(yù)。

1.2.3 miR-208a檢測：取大鼠尾部靜脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，取得上層血清，放置-20℃凍箱內(nèi)備用。采用實時熒光定量PCR檢測miR-208a表達：將采集到的100 μl血清加300 μl Trizol震蕩混勻靜置10 min，加80 μl氯仿再次震蕩混勻靜置5 min，離心后凝膠離心至管底，加100 μl DEPC水。將標本混合液15 000 r/min，離心處理15 min。提取上清至液轉(zhuǎn)移到含糖原EP管中，加等體積預(yù)冷異丙醇，混勻，-20℃靜置2 h。提取白色沉淀加1 ml的75%乙醇，混勻后充分洗滌RNA沉淀，4℃ 7 500 g，離心處理5 min，摒棄上清液。加80 μl DEPC水對RNA沉淀進行溶解，-80℃保存。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit)逆轉(zhuǎn)成cDNA，嚴格按照操作說明書進行操作。采用THUNDERBIRD qPCR Mix PCR試劑盒進行實時熒光定量PCR檢測，以外源性cel-mir-39-3p作參照，采用2-ΔΔCT法對miR-208a表達水平分析。

1.2.4 心功能相關(guān)指標檢測：采用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，通過超聲心動圖觀察大鼠左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVDd)、左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVDs)、左心室縮短分數(shù)(left ventricular shortening score，LVFS)。

1.2.5 心肌梗死面積、病理組織觀察：大鼠處死后，采集大鼠心肌組織，提取后采用0.9%氯化鈉溶液沖洗后，將粘附在其表面的異物清除干凈，干凈紗布將表面水分吸干后制備切片，置于2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)溶液中，染色15 min后使用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，計算大鼠心肌梗死面積。之后切片經(jīng)過二甲苯脫蠟后，梯度乙醇水化，蘇木精染色5 min，流水沖洗后給予伊紅染色30 s，觀察。

1.2.6 指標檢測：ROS測定采用Fenton反應(yīng)活性氧(ROS)試劑盒(南京建成生物工程研究所)完成。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)：提取標本包被液，對TGF-β 0.1 ml進行適當稀釋，進而加到聚苯乙烯反應(yīng)板各孔中。加蓋 4℃ 24 h保存。次日使用洗滌液進行3次全方位洗滌，甩干；各孔內(nèi)加不同稀釋倍數(shù)的待檢標本0.1 ml，同時增加陽性和陰性對照，置于43℃溫箱60 min，移去液體。同上述法則洗滌3次，甩干；各孔內(nèi)加稀釋TGF-β 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干；各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min；各孔內(nèi)加2 mol的TGF-β 0.05 ml，終止反應(yīng)。試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，試驗操作嚴格根據(jù)說明書上的步驟進行。采用免疫印跡(Western blot)將標本提取液，利用1 000 r/min速率離心處理提取液，然后加入裂解液，進行反復(fù)凍融后以120 000 r/min再次離心處理，提取上清液，再利用酶標儀檢測PI3K、AKT、GSK3β蛋白濃度，保存后靜置。加入10%的分離膠，封閉，吸干水分，灌注5%的濃縮膠，凝固成功后置于電泳槽中將其固定，最后加入5 μl Marker和變性蛋白樣品，電泳30 min，將蛋白分離膠底后結(jié)束電泳，磚模成功后加入5%的脫脂奶粉進硝酸纖維素膜(Nitrocellulosefilter membrane，NC)膜中，封閉固定1 h，加入一抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶1 000)孵育，經(jīng)過震蕩洗膜后加二抗(PI3K、AKT、GSK3β 1∶10 000)，孵育，再次震蕩洗膜，最后以GAPDH為內(nèi)參，使用紅外熒光成像系統(tǒng)對結(jié)果給予分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠miR-208a表達比較 miR-208a轉(zhuǎn)染組miR-208a表達低于模型組、空白組，高于假手術(shù)組(P<0.05)；模型組、空白組miR-208a表達均高于假手術(shù)組(P<0.05)；模型組、空白組miR-208a表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 4組大鼠miR-208a表達比較

2.2 4組大鼠心功能相關(guān)指標比較 miR-208a轉(zhuǎn)染組LVEF、LVFS高于模型組、空白組，低于假手術(shù)組(P<0.05)；LVDd、LVDs低于模型組、空白組，高于假手術(shù)組(P<0.05)；模型組、空白組LVEF、LVFS低于假手術(shù)組，LVDd、LVDs高于假手術(shù)組(P<0.05)；空白組LVEF、LVFS高于模型組，LVDd、LVDs低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心功能相關(guān)指標比較

2.3 4組大鼠病理組織觀察 假手術(shù)組大鼠心肌細胞表現(xiàn)為桿狀、細長，橫紋肌表現(xiàn)正常，細胞排列整齊；模型組大鼠梗死區(qū)域較薄，心肌細胞明顯減少，細胞排列紊亂，細胞腫脹，血管有明顯的充血，有大量炎性細胞浸潤。空白組細胞排列、腫脹等方面明顯改善。miR-208a轉(zhuǎn)染組大鼠細胞排列恢復(fù)整齊，細胞腫脹、炎性浸潤消失。見圖1。

圖1 4組大鼠病理組織觀察(HE染色×200)

2.4 4組大鼠心肌梗死面積比較 miR-208a轉(zhuǎn)染組心肌梗死面積低于模型組、空白(P<0.05)；空白組心肌梗死面積低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 4組大鼠心肌梗死面積比較

2.5 4組大鼠ROS、TGF-β水平比較 miR-208a轉(zhuǎn)染組ROS、TGF-β水平低于模型組、空白組，高于假手術(shù)組(P<0.05)；模型組、空白組ROS、TGF-β水平分別高于假手術(shù)組(P<0.05)；空白組ROS、TGF-β水平低于模型組(P<0.05)。見表4。

表4 4組大鼠ROS、TGF-β水平比較

2.6 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關(guān)指標比較 miR-208a轉(zhuǎn)染組PI3K、AKT、GSK3β表達低于模型組、空白組，高于假手術(shù)組(P<0.05)；模型組、空白組PI3K、AKT、GSK3β表達高于假手術(shù)組(P<0.05)；空白組PI3K、AKT、GSK3β表達低于模型組(P<0.05)。見表5,圖2。

表5 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關(guān)指標比較

圖2 4組大鼠PI3K/AKT/GSK3β信號通路相關(guān)指標比較(WB圖)

3 討論

研究指出急性心肌梗死發(fā)病會導(dǎo)致機體中定居型巨噬細胞數(shù)量增加，脾臟會釋放大量的聚集型巨噬細胞、炎性細胞、中性粒細胞以及單核細胞等大量在梗死部位聚集，造成炎性反應(yīng)，心肌損傷的速度不斷加快[7,8]。急性心肌梗死發(fā)病過程是心肌不斷壞死的過程，目前實驗研究主要采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立急性心肌梗死模型，主要是其病理變化與實際貼近[9]，使得實驗結(jié)果更加科學(xué)。

miR-208a通過調(diào)節(jié)肌球蛋白基因表達，參與肌肉生理、病理信號反應(yīng)過程，具有心臟特異性，只在心臟中表達[10]。陳耽等[11]研究指出，miR-208a抑制劑通過下調(diào)β-MHC表達，能控制高血壓大鼠心功能障礙發(fā)展過程。在再灌注損傷大鼠中miR-208a表達較高，在缺血后處理大鼠中表達下降，β-MHC基因表達的高低與miR-208a表達呈正相關(guān)[12]。本文研究結(jié)果顯示，在急性心肌梗死模型大鼠中，miR-208a表達較高，miR-208a轉(zhuǎn)染組miR-208a表達降低，提示miR-208a轉(zhuǎn)染成功。經(jīng)過miR-208a轉(zhuǎn)染干預(yù)，急性心肌梗死模型大鼠LVEF、LVFS升高，LVDd、LVDs降低，說明miR-208a轉(zhuǎn)染能改善大鼠心功能相關(guān)指標，促進大鼠心功能恢復(fù)。本文中miR-208a轉(zhuǎn)染能縮小急性心肌梗死模型大鼠心肌梗死面積，從而改善大鼠心肌病變的嚴重程度，大鼠心肌組織炎性細胞浸潤狀況也得到顯著的改善。

當心肌梗死發(fā)生時，因心肌細胞氧代謝障礙，線粒體功能失衡等影響，導(dǎo)致大量的ROS產(chǎn)生，因為蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，引發(fā)心功能變化，在急性心肌梗死中伴有大量的肌鈣蛋白、肌動蛋白提升，是由于ROS損傷心肌細胞導(dǎo)致[13,14]。TGF-β參與心肌重構(gòu)、心肌纖維化等過程，對心臟成纖維細胞遷移有明顯的誘導(dǎo)作用，將促纖維化程序激活[15,16]。本文研究結(jié)果顯示，miR-208a轉(zhuǎn)染能降低ROS、TGF-β水平，從而起到減輕大鼠心肌損傷、心肌纖維化的作用。

相關(guān)研究表明，PI3K/AKT/GSK3β通路會促進心肌組織的纖維化，其上調(diào)會損害心肌細胞[17-19]，其會參與急性心肌梗死的發(fā)病過程。本研究結(jié)果顯示，miR-208a轉(zhuǎn)染能明顯能下調(diào)PI3K、AKT、GSK3β水平，抑制PI3K/AKT/GSK3β通路，進而抑制心肌細胞凋亡，降低缺血灌注及缺血引發(fā)的心肌組織損傷，最終起到保護大鼠心肌細胞的作用。另外，PI3K/Akt/GSK3β通路被激活后，TGF-β、Hes1、HIF-1α等炎性因子會被進一步釋放，炎性反應(yīng)加劇[20,21]。而miR-208a轉(zhuǎn)染在抑制PI3K/Akt/GSK3β通路后，也會減輕機體炎性反應(yīng)，緩解心肌損傷。

綜上所述，下調(diào)miR-208a可以抑制PI3K/Akt/GSK3β信號通路相關(guān)蛋白，進而抑制心肌細胞凋亡，緩解機體炎性反應(yīng)，保護機體心肌細胞，最終減緩心肌損傷程度，同時也能改善急性心肌梗死模型大鼠心功能，減少心肌梗死面積，為臨床急性心肌梗死靶向治療提供依據(jù)。