李盈，郭旭

（海南保亭黎族苗族自治縣畜牧漁業(yè)服務(wù)中心，海南 保亭 572300）

鵝星狀病毒(goose astrovirus, GoAstVs)是一種以引起鵝內(nèi)臟和關(guān)節(jié)中尿酸鹽沉積為特征的新型病毒。近年來，有關(guān)該病毒感染鵝的病例逐漸增多，在我國許多省份造成了鵝產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。加強(qiáng)對鵝星狀病毒的研究對于防治小鵝痛風(fēng)等疾病具有重要意義。本文主要從病原學(xué)、臨床特征、流行現(xiàn)狀、診斷檢測技術(shù)、防控技術(shù)等方面進(jìn)行綜述，旨在為進(jìn)一步研究星狀病毒提供參考依據(jù)。

1 鵝星狀病毒概述

1.1 星狀病毒特征

星狀病毒(astrovirus,AstVs)可感染人類、哺乳動(dòng)物、禽類等多種動(dòng)物。最早于1965年從仔鴨中被發(fā)現(xiàn)，1984年被正式命名為星狀病毒[1，2]。星狀病毒屬于星狀病毒科，是一種無包膜的單鏈陽性RNA病毒，表面有明顯的星狀突起[3]，病毒顆粒直徑為28~30 nm, 基因組長度因物種而異，范圍為6.4~7.9 kb，包括5’端非編碼區(qū)、3’端非編碼區(qū)和三個(gè)開放的閱讀框架（ORF1a, ORF1b,ORF2）。ORF1a和ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，二者之間包含高度保守的基因序列。ORF2編碼病毒粒子形成所需的病毒衣殼蛋白[4]。病毒衣殼蛋白又包含一個(gè)保守的衣殼核和一個(gè)可高度變異的刺突結(jié)構(gòu)域。該刺突結(jié)構(gòu)域極有可能是宿主抗體的靶點(diǎn)。另外，ORF2的氨基酸序列被用作星狀病毒分類的基礎(chǔ)。ORF2中氨基酸序列的同源性大于75%的被歸為同一種星狀病毒[5]。

1.2 星狀病毒分類

星狀病毒可根據(jù)感染哺乳動(dòng)物和禽類的能力，分為哺乳動(dòng)物星狀病毒屬（Mamastrovirus, MAstV）和禽類星狀病毒屬（Avastrovirus, AAstV）[6]。哺乳動(dòng)物星狀病毒主要感染人類、綿羊、豬、牛、老鼠、貓、犬等哺乳動(dòng)物，禽類星狀病毒主要感染雞、鴨、火雞、鴿子、鵝等禽類。但是這種基于宿主類群的分類似乎并不準(zhǔn)確，對星狀病毒遺傳和進(jìn)化的研究表明它們有跨越物種屏障、適應(yīng)新的宿主和物種的潛力[7]。星狀病毒的遺傳變異和跨物種傳播存在人畜共患感染的風(fēng)險(xiǎn)。

1.3 鵝星狀病毒特征

鵝星狀病毒(goose astrovirus, GoAstVs)于2005年在小鵝痛風(fēng)病例中被發(fā)現(xiàn)[8]，2016年11月在山東被發(fā)現(xiàn)，這是首次在我國發(fā)現(xiàn)鵝星狀病毒，其基因組長度為7.2 kb[9]。ORF2編碼的衣殼蛋白（Cap蛋白）是鵝星狀病毒唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，在感染環(huán)節(jié)參與了病毒吸附及復(fù)制，且是GoAstV的主要抗原區(qū)域，能介導(dǎo)病毒入侵宿主細(xì)胞，是研究的重點(diǎn)[10]。

目前發(fā)現(xiàn)鵝星狀病毒有GoAstV-1和GoAstV-2兩種基因型，均可導(dǎo)致雛鵝痛風(fēng)的臨床癥狀[11]。研究證明，GoAstV-2基因型對1~15日齡的雛鵝具有高致病性，但對25~35日齡的雛鵝僅造成輕微癥狀[12]。GoAstV-1和GoAstV-2兩種基因型可以共同存在于一個(gè)宿主體內(nèi)，出現(xiàn)協(xié)同作用，發(fā)病頻率略高于GoAstV-1[13]。WANG A P等[14]實(shí)驗(yàn)感染雛鵝，結(jié)果顯示GoAstV-1和GoAstV-2陽性率分別為36.36%和54.55%，兩種病毒合并感染率為21.21%。另外，GoAstV也可在家禽、水禽之間跨物種傳播[15，16]，也可以在鵝體內(nèi)垂直傳播[17]。引起鵝痛風(fēng)的GoAstV-2大約在2010年出現(xiàn)，而GoAstV-1出現(xiàn)得比GoAstV-2早，估計(jì)在1985年4月已出現(xiàn)，基于貝葉斯分析，GoAstV的平均進(jìn)化速率約為每年每個(gè)位點(diǎn)發(fā)生1.42×103個(gè)核苷酸替換[18]。

2 臨床癥狀

鵝星狀病毒主要感染3周齡以下的雛鵝，該病可持續(xù)7~10 d，發(fā)病率和死亡率高，致死率為50%~80%。受感染的小鵝出現(xiàn)痛風(fēng)、厭食、精神沉郁、拉白色糞便，嗜睡，部分小鵝眼瞼變灰色、混濁，生長也會(huì)受到抑制。解剖發(fā)現(xiàn)膽囊、腎臟、心臟、肝臟、氣管等器官和關(guān)節(jié)出現(xiàn)尿酸鹽沉積；腎臟的損傷最為嚴(yán)重，出現(xiàn)出血和腫脹[19]。組織病理學(xué)分析顯示腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，炎癥細(xì)胞浸潤腎臟組織中，肝細(xì)胞空泡變性伴炎癥，脾淋巴細(xì)胞浸潤、解體、壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，在大腦皮層中，死亡的神經(jīng)細(xì)胞被小膠質(zhì)細(xì)胞包裹。痛風(fēng)病的鵝盲腸絨毛明顯縮短，抑制了腸粘膜屏障的功能。此外，在死亡的雛鵝中觀察到腦炎病變。發(fā)病存活下來的鵝生長緩慢，容易受到細(xì)菌感染[20]。

3 發(fā)病機(jī)理

鵝星狀病毒在鵝身體的多個(gè)組織中復(fù)制，包括心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、法氏囊、胸腺、胰腺、腦、腺胃和腸。病毒在腎臟的出現(xiàn)率最高，其次是脾臟和肝臟[21]。蘇木精染色顯示，脾切片中脾細(xì)胞出血和壞死；腎切片間質(zhì)出血，腎小管壞死和腎小球腫脹，尿酸結(jié)晶；肝切片的肝細(xì)胞變性。GoAstV感染早期可激活宿主免疫反應(yīng)，TLR3、RIG-I和MDA5參與了GoAstV的宿主免疫應(yīng)答，感染過程中IFN I型(IFN-α、IFN-β)、炎癥因子(IL-8、IL-10、TNF-α)、抗病毒蛋白(Mx、OASL、PKR)和MHC-I的表達(dá)也上調(diào)。相比之下，促炎細(xì)胞因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表達(dá)被抑制。然而，快速的病毒復(fù)制、抑制炎癥因子(IL-1β，IL-6)和MHC-II的表達(dá)可能是宿主免疫反應(yīng)不能提供足夠的保護(hù)來對抗GoAstV感染的原因[20]。研究指出，GoAstV感染可引起腎上皮細(xì)胞自噬，刷狀緣和細(xì)胞間連接破壞，足細(xì)胞損傷，纖維化增加，最終導(dǎo)致腎臟損傷[22]。Moser等人[23]研究表明，星狀病毒可以增加上皮細(xì)胞的通透性。星狀病毒誘導(dǎo)的腎上皮細(xì)胞通透性增加可能導(dǎo)致痛風(fēng)病。此外，由于家禽缺乏精氨酸酶，氨不能代替嘌呤，次黃嘌呤和黃嘌呤加工成尿素，然后氧化成尿酸，形成尿酸鈉和尿酸鈣，最后通過腎臟排泄。如果尿酸鹽形成的速率大于泌尿器官的排泄能力，則內(nèi)臟表面上的尿酸鹽沉積物可引起痛風(fēng)[24]。因此，引起腎臟和尿路損傷或尿液濃度和尿排泄紊亂的因素可以促進(jìn)尿酸鹽沉積物的形成。鵝星狀病毒可引起腎臟損害，這可能是引起小鵝痛風(fēng)的主要原因。

4 流行現(xiàn)狀

2016年11月，鵝星狀病毒在山東被發(fā)現(xiàn)，并迅速蔓延到我國的其他主要產(chǎn)鵝省份[25]，江蘇、河南、河北、安徽、湖北、廣東、湖南、遼寧、福建、浙江、四川、內(nèi)蒙古、黑龍江、海南等省均有GoAstV感染檢測陽性的報(bào)告。不同的省份感染率和死亡率有一定差異。ZHU Q H等[26]在黑龍江省鵝場檢測出GoAstV-2型鵝星狀病毒。與GoAstV原株相比，菌株HLJ2021的刺突結(jié)構(gòu)域540Q氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了影響蛋白結(jié)構(gòu)的突變。菌株HLJ2021與AstV/HB01/Goose/0123/19發(fā)生重組，產(chǎn)生重組菌株。HLJ2021菌株對小鵝也表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病性。感染死亡率為83.3%。FU X L等[18]對廣東省和福建省的GoAstV基因組進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果表明GoAstV在中國南方鵝體內(nèi)廣泛存在，且GoAstV-1和GoAstV-2在鵝體內(nèi)循環(huán)。

5 診斷檢測技術(shù)

ORF2開放閱讀框的5’端基因序列屬于保守基因序列，該特征為研制Cap蛋白抗體和以Cap保守區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)引物和探針奠定了理論基礎(chǔ)。

5.1 反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（RT-LAMP）檢測

在病毒學(xué)診斷技術(shù)的研究進(jìn)展中，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增核酸，已用于快速檢測各種病毒，包括禽星狀病毒[27]。LAMP檢測用一套4個(gè)特異性引物可以識(shí)別6個(gè)不同的序列，是一種成本低、省時(shí)、高特異性和靈敏性的方法[28]。根據(jù)ORF1b基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)并篩選出兩組引物，最終確定采用一引物組在水浴鍋中完成RT-LAMP的檢測，反應(yīng)的最佳溫度和時(shí)間分別為61 ℃和30 min，利用瓊脂糖凝膠電泳和染料指示劑顯色對RT-LAMP結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。RT-LAMP法檢測GoAstV分別基于瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和肉眼檢測顏色變化所判定的靈敏度，與熒光定量法靈敏度相同。RT-LAMP方法所用引物組可特異性地檢測GoAstV，并未與其它常見的禽類病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測

RT-PCR方法也可以用來檢測鵝星狀病毒，基本原理是提取陽性GAstV病料的RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[29，30]。

RT-PCR擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄體系為：2 uL引物、4 uL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，2 uL二硫酸糖醇（DTT）、7 uL RNA模板、4 uL dNTP Mix（10 mM）。42 ℃反應(yīng)50 min，82 ℃反應(yīng)5 min，得到cDNA。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：2 uL 引物、6 uL 雙氧水、2 uL cDNA、10 uL Mix酶，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸 10 min。之后將獲得的PCR產(chǎn)物加入1%凝膠中進(jìn)行電泳并進(jìn)行紫外分析[31，32]。根據(jù)GAstV-1和GAstV-2差異最大的ORF2的基因序列設(shè)計(jì)兩對引物，可以在FAM和VIC通道中分別獲得gstv -1和gstv-2的熒光信號(hào)，gstv -1和gstv -2的檢出限分別為33.3、33.7倍/μL 。RT-PCR方法具有較高的特異性、敏感性和重復(fù)性，可用于臨床對GAstV-1和GAstV-2的檢測[33]。

5.3 雙重定量PCR（qPCR）檢測

YANG K K等結(jié)合鵝細(xì)小病毒(GPV)和鵝星狀病毒(GAstV)的保守基因組區(qū)設(shè)計(jì)兩對引物，使用雙重定量PCR (qPCR)方法同時(shí)檢測這兩種病毒。根據(jù)GPV(變性溫度82.1 ℃)和GAstV(變性溫度79.8 ℃)不同來區(qū)分它們。與其它水禽病毒混合試驗(yàn)沒有產(chǎn)生交叉反應(yīng)。 GPV和GAstV的檢出限分別為5.74 × 101倍/μL和6.58 × 101倍/μL。研究表明該方法具有較高的靈敏度、特異性和重復(fù)性，可用于流行病學(xué)研究，能有效控制GPV和GAstV的傳播[34]。

5.4 定量環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)擴(kuò)增（qLAMP）檢測

定量環(huán)介導(dǎo)等溫反應(yīng)擴(kuò)增（qLAMP）方法檢測鵝星狀病毒簡便、靈敏、快捷。一組4個(gè)特異性引物，包括2個(gè)內(nèi)引物和2個(gè)外引物，以鵝星狀病毒的ORF1a基因作為靶向基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。鵝星狀病毒qLAMP擴(kuò)增的最優(yōu)條件為：25 uL LAMP反應(yīng)體系中加入2個(gè)內(nèi)引物（各1 uL）、2個(gè)外引物（各1 uL）、2.5 uL 10×等溫?cái)U(kuò)增緩沖液，1 uL Bst DNA聚合酶（8 U/uL）、2 uL DNA模板、11.25 uL無核酸酶水、3.5 uL dNTP Mix（10 mM）、1.5 uL MgSO4(100 mM)，擴(kuò)增溫度為65 ℃恒溫水浴，反應(yīng)時(shí)間60 min。qLAMP檢測方法特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，與其它病毒無交叉反應(yīng)，對鵝星狀病毒檢出最低限為1×101倍/uL，與傳統(tǒng)PCR的檢出最低限1×104倍/uL相比，靈敏度要高許多[35]。

5.5 免疫學(xué)診斷方法

使用抗體的免疫學(xué)診斷方法是篩選和分析病毒抗原的較好方法。單克隆抗體（mAb）被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)診斷。鵝星狀病毒纖突蛋白（VP27蛋白）是一種重要的衣殼蛋白，是開發(fā)診斷試劑的候選蛋白，可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體。

5.5.1 Cap蛋白單克隆抗體的制備[36，37]通過克隆VP27基因來制備特異性單克隆抗體（mAb），經(jīng)蛋白質(zhì)印記分析和免疫熒光分析表明，該單克隆抗體可特異性識(shí)別感染細(xì)胞中的VP27，具有較高的診斷潛力。

制備抗原：以Cap保守區(qū)域?yàn)榛A(chǔ)設(shè)計(jì)引物，并以cDNA為模板進(jìn)行基因擴(kuò)增，回收目的基因片段，并將該目的基因與大腸桿菌表達(dá)載體（pET-30a）進(jìn)行酶切反應(yīng)以獲得陽性重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a-Cap，并將其接種到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并加入1 mmol/L的誘導(dǎo)劑ITPG（異丙基硫代半乳糖苷，Isopropyl β-D-Thiogalactoside）誘導(dǎo)5 h，采用尿素法進(jìn)行變性復(fù)性，并利用鎳柱系統(tǒng)進(jìn)行蛋白純化。采用Western blot方法對獲得的重組蛋白進(jìn)行純度鑒定，在目的位點(diǎn)出現(xiàn)特異性條帶則可作為免疫原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備單克隆抗體。

動(dòng)物免疫與細(xì)胞融合：將純化、鑒定后的重組蛋白乳化后，皮下注射實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（一般為BLAB/C實(shí)驗(yàn)小鼠），經(jīng)過三次免疫，取免疫后的小鼠脾臟制備細(xì)胞懸液，與對數(shù)期生長的骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

雜交瘤的篩選及抗體性質(zhì)檢測：通過HAT選擇培養(yǎng)基（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine 胸腺嘧啶核苷）或者ELISA的方法篩選出呈陽性的雜交瘤細(xì)胞。之后檢測陽性雜交瘤細(xì)胞的抗體性質(zhì)，包括特異性、中和活性、親和力、亞類、識(shí)別抗原表位等的檢測與鑒定。

雜交瘤的克隆化：選取抗體性質(zhì)優(yōu)良的雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法進(jìn)行克隆純化，制備腹水。

5.5.2 Cap蛋白多克隆抗體的制備 呂炫等[38]通過大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化GAstV-2 Cap蛋白，制備了具有較高效價(jià)的多克隆抗體。劉莉等[39]采用同樣的方法制備了GAstV-1Cap蛋白的多克隆抗體。

與多克隆抗體相比，單克隆抗體性質(zhì)更穩(wěn)定，對抗原的特異性更強(qiáng)。蛋白抗體的制備技術(shù)可為鵝星狀病毒感染的臨床診斷及檢測方法的建立奠定理論基礎(chǔ)。

6 防控技術(shù)

6.1 鵝星狀病毒感染的預(yù)防

6.1.1 注射有效疫苗和抗體 疫苗接種是預(yù)防病毒的重要措施。Sellers 等[40]研究表明通過用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的雞星狀病毒衣殼蛋白接種種雞，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，而且可以通過卵黃將抗體傳遞至后代維雞。目前，還沒有商業(yè)化的疫苗或其它方法來預(yù)防鵝星狀病毒。孫永林[31]用制備的卵黃抗體對1日齡雛鵝進(jìn)行頸部皮下注射免疫（免疫劑量為1 mL），免疫過的雛鵝精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)尿酸鹽沉積、痛風(fēng)等臨床癥狀，這表明卵黃抗體對鵝星狀病毒有較好的預(yù)防效果。D. Xu等[41]通過在重組的GAstV蛋白中插入鵝源新城疫（NDV）弱毒株制備二價(jià)疫苗，對GAstV和NDV感染均具有一定保護(hù)作用，但由于各種GAstV亞型之間混合感染，使用其它病毒作為疫苗載體需要進(jìn)一步研究。榮雪路等[42]制備了鵝星狀病毒重組衣殼蛋白亞單位疫苗，并在開產(chǎn)前5周對種鵝進(jìn)行胸部肌肉注射（1 mL/羽），28 d后對種鵝進(jìn)行免疫效力測定，抗體效價(jià)不低于3.6 log2，產(chǎn)蛋卵黃中抗體效價(jià)不低于3.01 log2，孵出的雛鵝血清中抗體效價(jià)不低于2.7 log2，免疫效果良好。姚倫廣等[43]研制了鵝星狀病毒滅活疫苗，并進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，可實(shí)現(xiàn)100%保護(hù)。張立武[44]等研究發(fā)現(xiàn)，卵黃抗體雖可預(yù)防鵝星狀病毒，但預(yù)防保護(hù)期短，需要重復(fù)注射來控制嚴(yán)重疫情。滅活疫苗的缺點(diǎn)是至少有7 d的免疫空白期，而鵝易在免疫空白期內(nèi)感染而發(fā)病。針對卵黃抗體和滅活疫苗的不足，用SD毒株作為滅活抗原，經(jīng)過兩次乳化制備的一種卵黃抗體復(fù)合物，一方面可以有效預(yù)防鵝星狀病毒，另一方面預(yù)防保護(hù)期較長，可以對鵝的整個(gè)生長周期進(jìn)行保護(hù)。王桂軍等[45]采用薄膜擴(kuò)散法制備脂質(zhì)體作為疫苗佐劑把VP27蛋白包裹起來，起到緩釋抗原的作用，可以延長抗原蛋白在機(jī)體內(nèi)的時(shí)間，使受免疫動(dòng)物可持續(xù)產(chǎn)生中和抗體，從而進(jìn)一步延長免疫保護(hù)期。

6.1.2 切斷傳播途徑 環(huán)境控制：合理選擇鵝場地址，場地布局和設(shè)施設(shè)備要科學(xué)，從無疫區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)化種禽場引種，并做好引種檢疫，有效切斷傳播途徑。加強(qiáng)飼養(yǎng)管理：合理安排飼養(yǎng)密度，配置營養(yǎng)合理的飼料，減少應(yīng)激；實(shí)行全進(jìn)全出飼養(yǎng)，空場或空舍2周以上方可飼養(yǎng)下一批雛鵝。嚴(yán)格執(zhí)行消毒程序：做好空舍消毒、帶鵝消毒、用具消毒、人員車輛消毒等；鵝群清空后，對非易燃的籠具、地面進(jìn)行火焰消毒；另外，在中午選用0.2%~0.3%的過氧乙酸帶鵝噴霧消毒[46，47]。做好無害化處理：對病死鵝、墊料、糞便等進(jìn)行無害化處理，防止疫病傳播。

6.2 鵝星狀病毒感染的治療

飲水中添加護(hù)腎利尿的藥物和葡萄糖可促進(jìn)尿酸排出，緩解痛風(fēng)癥狀。孫永林[32]對雛鵝開展攻毒治療試驗(yàn)，研究表明分別在1日齡和7日齡注射兩次卵黃抗體，可有效治療雛鵝痛風(fēng)。張凌云等[48]用鵝星狀病毒亞單位疫苗免疫之后制備的卵黃抗體連續(xù)10 d注射患病鵝，死亡率可降至5.4%~6.4%，研究表明卵黃抗體可有效治療鵝星狀病毒感染。李海利等[49]研發(fā)一種中藥制劑（黃芪40份、石韋20份、梔子16份、金銀花12份、蟑螂10份、黃芩6份、茵陳蒿6份、苦參3份、萹蓄2份），肌肉注射患病鵝（4 mL只，2次/d），可顯著降低尿酸鹽濃度，有效控制病情。

7 結(jié)論與展望

鵝星狀病毒是危害我國鵝產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一種新型病毒，疫苗的研制與應(yīng)用仍然是鵝星狀病毒研究的重點(diǎn)。制備具有較好防控效果的疫苗需要不斷模仿病毒感染的過程，不斷了解鵝星狀病毒傳播的特點(diǎn)和感染機(jī)制才可以從根本上解決鵝星狀病毒感染所導(dǎo)致的鵝痛風(fēng)問題。未來的研究可以從鵝星狀病毒跨宿主傳播的致病性、鵝星狀病毒的致病機(jī)制、鵝星狀病毒治療藥物的研發(fā)等方面開展。