程 鑫，王 鑫，吳宇森，張 雨，李瑩瑩，廉文靜

（天津農(nóng)學(xué)院 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，天津 300384）

多菌靈作為一種廣譜性殺菌農(nóng)藥，被普遍用作谷類作物和蔬菜水果等植物的殺菌劑。然而，多菌靈在食品中的殘留威脅人類健康，導(dǎo)致人體肝腎功能受損、出現(xiàn)惡心嘔吐等不良反應(yīng)[1]。因此，國(guó)內(nèi)外研究者探索構(gòu)建了多種多菌靈分析檢測(cè)方法。目前，測(cè)定多菌靈殘留的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法等[2]。然而，這些常規(guī)方法存在儀器檢測(cè)過(guò)程煩瑣、樣品前處理過(guò)程復(fù)雜、對(duì)設(shè)備和人員的要求較高等缺點(diǎn)[3]。因此，亟待找到快速、靈敏、簡(jiǎn)單的方法來(lái)檢測(cè)多菌靈農(nóng)藥殘留量。

本研究將具有特異識(shí)別性、預(yù)定性的分子印跡技術(shù)與電化學(xué)方法相結(jié)合，建立多菌靈分子印跡電化學(xué)傳感器，選擇簡(jiǎn)單、可控的電化學(xué)聚合方法，在玻碳電極（Glassy Carbon Electrode，GCE）表面合成多菌靈分子印跡聚合物（Molecular Imprinted Polymer，MIP），以鐵氰化鉀為探針，利用循環(huán)伏安法對(duì)影響多菌靈測(cè)定的各個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)。在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下，通過(guò)測(cè)定多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到分析性能參數(shù)，并將構(gòu)建的多菌靈電化學(xué)傳感器應(yīng)用于實(shí)際樣品中多菌靈的測(cè)定，為多菌靈的檢測(cè)和分析提供了快捷、靈敏、準(zhǔn)確的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

儀器：電化學(xué)工作站（CHI 660E型）；電子天平（BSA223S型）；三電極系統(tǒng)（以GCE電極為工作電極，分別以鉑絲電極和飽和甘汞電極為對(duì)電極和參比電極）；超聲波清洗儀（KH5200B型）。

試劑：多菌靈、吡咯、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氫氧化鈉等，均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 GCE電極預(yù)處理

分別用粒徑為1.0 μm、0.3 μm、50 nm的氧化鋁粉拋光GCE電極，用蒸餾水沖洗電極后，分別在乙醇、蒸餾水中超聲洗滌20 s，最后用蒸餾水沖洗后晾干。

1.3 電聚合多菌靈MIP

以預(yù)處理后的GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，置于含有15 mmol/L吡咯和5 mmol/L多菌靈、pH為6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，掃描電位為0～1.4 V，掃速為0.05 V/s，電聚合5圈，室溫晾干后得到多菌靈MIP/GCE電極。

1.4 洗脫與重結(jié)合

1.4.1 洗脫

將電聚合后的多菌靈MIP/GCE電極置于10 mmol/L NaOH溶液中，磁力攪拌15 min洗脫多菌靈，用蒸餾水沖洗后室溫晾干，得到洗脫后的MIP/GCE電極。該電極對(duì)多菌靈具有特異識(shí)別作用。

1.4.2 重結(jié)合

將洗脫后的MIP/GCE電極浸入不同濃度的多菌靈溶液中15 min，室溫干燥得到重結(jié)合后的MIP/GCE電極。

1.5 測(cè)試與表征

傳感器構(gòu)建條件優(yōu)化及性能研究均采用循環(huán)伏安法，以5 mmol/L K3Fe(CN)6溶液（含0.1 mol/L KCl）為探針，掃描電位為﹣0.2～0.6 V，掃描速度為0.10 V/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 吡咯與多菌靈比例優(yōu)化

參照以吡咯為功能單體電聚合制備MIP的文獻(xiàn)報(bào)道常用參數(shù)[4]，以GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極系統(tǒng)，分別置于含有5 mmol/L多菌靈和5、10、15、20 mmol/L吡咯以及pH為6.8的0.1 mol/L磷酸緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，在0～1.4 V以0.05 V/s掃描，電聚合5圈后，在GCE電極表面得到多菌靈MIP膜，即MIP/GCE電極，用10 mmol/L NaOH溶液洗脫MIP/GCE電極15 min后，以洗脫后的MIP/GCE電極為工作電極構(gòu)建三電極體系，在5 mmol/L鐵氰化鉀探針溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)定，記錄鐵氰化鉀的氧化峰電流值。如圖1所示，吡咯與多菌靈濃度比值為3，即多菌靈濃度為5 mmol/L、吡咯濃度為15 mmol/L時(shí)，得到的吡咯特異性識(shí)別位點(diǎn)最多。

圖1 吡咯與多菌靈比例優(yōu)化

2.2 電聚合圈數(shù)優(yōu)化

以含有5 mmol/L多菌靈和15 mmol/L吡咯、pH為5.2的0.1 mol/L磷酸緩沖液為電聚合溶液，電聚合方法和參數(shù)同2.1，分別在GCE電極表面電聚合3、4、5、6圈，得到多菌靈MIP膜，并研究鐵氰化鉀探針溶液在洗脫后的MIP/GCE電極表面的電化學(xué)響應(yīng)。如圖2所示，當(dāng)電聚合圈數(shù)為5圈時(shí)，鐵氰化鉀的氧化峰電流最大，多菌靈的特異性識(shí)別位點(diǎn)數(shù)量最多。

圖2 電聚合圈數(shù)優(yōu)化

2.3 洗脫及重結(jié)合時(shí)間優(yōu)化

以常用的NaOH溶液作為洗脫劑，將電聚合后的多菌靈MIP/GCE電極置于10 mmol/L NaOH溶液中，分別磁力攪拌洗脫5～20 min，用蒸餾水沖洗后室溫晾干，得到洗脫不同時(shí)間后的MIP/GCE電極。測(cè)定鐵氰化鉀探針溶液在洗脫不同時(shí)間后的MIP/GCE電極表面的電化學(xué)響應(yīng)，結(jié)果如圖3A所示，15 min為最佳洗脫時(shí)間。

圖3 洗脫（A）和重結(jié)合（B）時(shí)間優(yōu)化

將洗脫后的多菌靈MIP/GCE電極置于4×10-5mol/L多菌靈溶液中，分別孵化5～25 min。在探針溶液中測(cè)得如圖3B所示的循環(huán)伏安曲線。由測(cè)定結(jié)果可知：當(dāng)重結(jié)合時(shí)間為5～15 min時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化峰電流逐漸降低，這是因?yàn)殡姌O表面的部分分子印跡膜特異性識(shí)別結(jié)合位點(diǎn)被多菌靈重新占據(jù)，阻礙了探針的電子傳遞；當(dāng)重結(jié)合時(shí)間為20～25 min時(shí)，氧化峰電流與重結(jié)合15 min基本相同。因此，15 min為最佳重結(jié)合時(shí)間。

2.4 傳感器構(gòu)建過(guò)程表征

利用循環(huán)伏安法測(cè)定鐵氰化鉀探針在傳感器構(gòu)建過(guò)程中不同電極上的電化學(xué)響應(yīng)，以研究傳感器對(duì)多菌靈的識(shí)別作用。如圖4所示，多菌靈MIP/GCE電極（曲線b）的氧化峰電流值明顯小于GCE電極（曲線a），這是因?yàn)殡娋酆虾蟮碾姌O表面被致密的MIP膜占據(jù)，影響了鐵氰化鉀在電極表面的氧化還原反應(yīng)。重結(jié)合4×10-5mol/L多菌靈后電極（曲線d）的氧化峰電流值小于洗脫后的MIP/GCE電極（曲線c），因?yàn)橄疵摵箅姌O呈現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)，有利于鐵氰化鉀探針?lè)肿哟┻^(guò)、到達(dá)電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。重結(jié)合時(shí)，電極表面的立體空穴又會(huì)再次被多菌靈分子占據(jù)?；谝陨戏治觯狙芯克鶚?gòu)建的分子印跡電化學(xué)傳感器對(duì)多菌靈具有識(shí)別作用。

圖4 鐵氰化鉀探針在GCE電極（a）、MIP/GCE電極（b）、洗脫后的MIP/GCE電極（c）、重結(jié)合多菌靈后電極（d）上的循環(huán)伏安曲線

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用建好的傳感器測(cè)定1×10-3～1×10-9mol/L多菌靈溶液，先測(cè)定洗脫后多菌靈MIP/GCE電極在鐵氰化鉀探針溶液中的循環(huán)伏安氧化峰電流值I0，再將洗脫后的電極在不同濃度多菌靈溶液中孵化15 min，測(cè)得氧化峰電流值Ipa。記錄多菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c與ΔIpa(I0－Ipa)的關(guān)系，繪制如圖5所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到傳感器的線性方程：ΔIpa（μA）=1.621 7（μA）+0.154 9c（μmol/L），線性范圍為3×10-8～7×10-5mol/L，最低檢出限為2.13×10-8mol/L（S/N=3）。

圖5 傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)語(yǔ)

將分子印跡技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)方法結(jié)合，構(gòu)建多菌靈分子印跡電化學(xué)傳感器，采用電化學(xué)聚合法，以多菌靈為模板分子、吡咯為功能單體，在電極表面合成多菌靈MIP。通過(guò)對(duì)傳感器構(gòu)建過(guò)程實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將構(gòu)建的多菌靈分子印跡傳感器應(yīng)用于不同濃度多菌靈溶液的測(cè)定。該多菌靈分子印跡電化學(xué)傳感器具有穩(wěn)定性強(qiáng)、特異識(shí)別性強(qiáng)及測(cè)定高效等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的實(shí)際應(yīng)用潛力。