姜洪偉，胡 琦，白鈺靈，王 舉，套格蘇，李海軍

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院 胃腸外科，內(nèi)蒙古 呼和浩特010017；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學研究生學院；3.赤峰市敖漢旗醫(yī)院 普外科;4.赤峰市醫(yī)院 肛腸外科)

既往研究關注腫瘤細胞本身基因突變、拷貝數(shù)異常、啟動子區(qū)域甲基化異常。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境 (TME)是影響腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要功能和結(jié)構(gòu)單元[1]。細胞外基質(zhì)(ECM) 指環(huán)繞細胞的整個細胞外環(huán)境，由多種復雜大分子物質(zhì)構(gòu)成。ECM同時也是TME的一部分，含有的主要蛋白成分有膠原蛋白、纖連蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、彈性蛋白等，另外還有蛋白聚糖與氨基聚糖等糖蛋白。COL3A1基因位于人2號染色體q24.3-q3區(qū)域，全長約44 kb，編碼Ⅲ型膠原α-1鏈[2]。Fagerberg等人[3]對來自95個個體的27個不同的人體器官和組織中的COL3A1的mRNA水平進行了測序。COL3A1表達的改變往往會導致機體內(nèi)結(jié)締組織相關病變，如發(fā)生撕裂或穿孔，進而引起一系列疾病。COL3A1的不同遺傳變異影響腦卒中[4]的復發(fā)和預后。COL3A1在腦皮層發(fā)育和中也起重要作用[5]。Horn Denise等人[6]報道了兩個家族中雙等位基因COL3A1變異的臨床和分子特征，這兩個家族中有特定的大腦異常和一個家族中的結(jié)締組織異常。并認為COL3A1的雙等位基因突變可以導致一種特殊的大腦表型，包括額頂突出的鵝卵石型多小腦回、小腦微囊腫和白質(zhì)改變，以及一些患者的發(fā)育遲緩和癲癇發(fā)作。COL3A1的功能變異還可導致其他心血管異常，如顱內(nèi)動脈瘤[7]。埃萊斯-當洛斯綜合征(EDS)又稱全身彈力纖維發(fā)育異常癥。這是一種罕見的、危及生命的遺傳疾病，常常影響到組織和血管的彈性使其變得更加脆弱而容易損傷，COL3A1基因編碼區(qū)或內(nèi)含子區(qū)突變可導致EDS，影響患者生存[8]。但目前關于COL3A1與胃癌關系的研究報道基本還只是停留在對已有癌癥數(shù)據(jù)庫的信息挖掘上，缺少進一步臨床、表型及分子機制的研究。因此本研究采用qRT-PCR及免疫組化法檢測胃癌及其正常組織中COL3A1的mRNA及蛋白表達水平，并初步探究COL3A1與胃癌臨床及病理特征的關系。

1 材料與方法

1.1 標本及臨床資料

收集2019-1-1至2020-12-1在內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院行胃癌根治術且術后病檢結(jié)果為胃癌患者的癌及其正常組織石蠟標本各50例，由2名高年資病理醫(yī)師顯微鏡下確定富含胃癌及正常組織的蠟塊，所有患者臨床病理資料完整，石蠟標本均由我院病理科進行固定、HE染色及包埋后進行免疫組化檢測。所研究的50例胃癌患者術后標本中：男性36例，女性14例；年齡在41-74歲范圍當中，<60歲的16例，≥60歲的34例；癌組織分化為中、高分化的23例，低分化的27例；出現(xiàn)周圍淋巴轉(zhuǎn)移38例，其余12例未發(fā)現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移；按照美國癌癥委員會( AJCC)的分期標準，其中Ⅰ-Ⅱ期20例，Ⅲ-Ⅳ期30例；按照浸潤程度分類：T1-T2期11例，T3-T4期39例；按照腫瘤大小進行劃分，其中超過5 cm的29例，不足5 cm的21例。另外收集10對新鮮胃癌組織及距離腫瘤>6 cm的正常組織作為對照，組織離體收集后立即用液氮運輸，在-80℃冰箱中儲存?；颊呔\斷為原發(fā)性胃癌，未經(jīng)過放療及化療，且病理組織學類型均為腺癌。該實驗經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審批允許開展。

1.2 實驗試劑

1．3 實驗方法

1．3.1免疫組織化學染色 先對蠟塊標本進行修整，然后進行切片。切片放于60℃烤片機上烤片，干燥后，取出，室溫保存。切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復后，使用3%的過氧化氫溶液浸潤切片以封閉其內(nèi)源性過氧化物酶，切片滴加COL3A1抗體4℃過夜孵育。放入蘇木素中復染，分別使用75%、85%、95%濃度的酒精脫水，封片。免疫組化的染色結(jié)果判定：使用陽性染色區(qū)域所占百分比(<5%：0分；5%-25%：1分；26%-50%：2分；50%-75%：3分；>75%：4分)和染色強度(未著色：0分；淡黃色：1分；黃色：2分；棕黃色：3分)兩個指標的乘積作為總得分用于評估切片，每個切片均在400倍鏡下選擇5個不同區(qū)域進行染色評估，且整個評估過程均由2名副高以上病理科醫(yī)師獨立雙盲進行。總得分≥6分定義為高表達。

1．3.2qRT-PCR法檢測COL3A1mRNA表達水平 根據(jù)TAKARA PrimeScriptTMRT reagent Kitwith gDNA Eraser試劑盒的標準操作步驟進行，提取 total RNA，3%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計用來測定RNA濃度和純度,A260/A280比值在1.8-2.0之間。反轉(zhuǎn)錄后以 cDNA 為模板進行熒光定量 PCR。COL3A1引物序列：正向TTGAAGGAGGATGTTCCCATCT，反向ACAGACACATATTTGGCATGGTT。GAPDH引物序列：GAGTCAACGGATTTGGTCGT，反向TTGATTTTGGAGGGATCTCG。反應體系為cDNA 2 μl、PCR 上游引物 0.4 μl、PCR 下游引物 0.4 μl、SYBR Green solution 10 μl、滅菌雙蒸水 7.2 μl。待反應結(jié)束后，通過溶解曲線對反應過程是否特異進行判定，每個樣品mRNA相對表達量通過計算其各自的Ct值計算得出。

1．4 統(tǒng)計學分析

實驗所得數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示，數(shù)據(jù)處理軟件為GraphPad Prism 6及SPSS 22.0，所得數(shù)據(jù)采用t檢驗和χ2檢驗進行分析，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測癌及正常組織中COL3A1的mRNA表達

檢測結(jié)果表明，胃癌組織中COL3A1的mRNA表達水平(6.86±3.07)更高，顯著高于正常組織(2.48±1.25)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.181，P=0.0013)(圖1)。此外，還通過免疫組化方法對50例胃癌患者的石蠟切片進行了進一步的驗證。結(jié)果顯示COL3A1蛋白主要定位于細胞外基質(zhì)中，表現(xiàn)為細胞外網(wǎng)狀或條狀纖維。在癌及正常組織中均有表達。癌組織中可見染色增強，纖維增粗、紊亂、排列不規(guī)則。在胃癌組織及正常組織中，COL3A 1蛋白的高表達分別出現(xiàn)32例、16例，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.256,P=0.001)(表1、圖2、圖3)。

圖1 COL3A1分別在胃癌及正常組織中的mRNA表達水平

圖2 免疫組化法檢測COL3A1蛋白在正常組織中低表達(左圖，200×；右圖400×)

圖3 免疫組化法檢測COL3A1蛋白在胃癌組織中高表達(左圖，200×；右圖400×)

表1 COL3A1蛋白在胃癌及正常組織中的表達

2.2 COL3A1表達與胃癌各臨床病理特征的關系我們發(fā)現(xiàn)COL3A1蛋白表達水平與AJCC 分期(P<0.001)、浸潤深度(P=0.012)有關，而與性別(P=0.529)、年齡(P=0.880)、分化程度(P=0.869)、腫瘤大小(P=0.145)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.416)等因素無關(表2)。

表2 COL3A1蛋白表達與胃癌各臨床病理特征的關系

3 討論

胃癌屬于全世界惡性腫瘤中較為常見的一種，組織學上可分為腺癌、印戒細胞癌和未分化癌等[9]，以腺癌最多見。根據(jù)對胃癌的發(fā)病數(shù)據(jù)統(tǒng)計，我國每年有超過41萬例的新確診病例[10]。隨著內(nèi)鏡儀器和診斷技術及微創(chuàng)手術的發(fā)展，患者在早期可行內(nèi)鏡切除或腹腔鏡胃切除術。但胃癌患者的生存率仍不樂觀。隨著對胃癌發(fā)病相關機制的進一步研究，如何做出更準確方便的早期診斷，評估胃癌患者的預后，并為胃癌患者提供合適的輔助治療已經(jīng)引起了研究者的廣泛關注。

我們通過qRT-PCR檢測10例新鮮的胃癌標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中COL3A1的mRNA表達水平顯著高于正常組織。然后對50例患者的病理石蠟切片行免疫組化實驗，結(jié)果顯示COL3A1主要定位于細胞外基質(zhì)中，表現(xiàn)為細胞外網(wǎng)狀或條狀纖維。COL3A1在癌組織中染色增強，纖維增粗、不規(guī)則，在正常組織亦有表達。分析發(fā)現(xiàn)COL3A1在胃癌組織蛋白表達高于其正常組織。根據(jù)我們收集的患者臨床病理資料，我們發(fā)現(xiàn)COL3A1蛋白表達水平與TNM 分期及浸潤深度有關，而與別的因素無關。上述實驗提示COL3A1在胃癌組織中的mRNA及蛋白水平均高于正常組織。關于COL3A1在惡性腫瘤中的作用，有一些與我們相似的研究。TianDing Shen[11]等用表皮生長因子(Epidermal growth factor EGF)處理人體成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase MAPK)家族成員的表達趨勢同COL3A1一樣升高。由此認為EGF可以通過激活MAPK來促進COL3A1的表達增加。王頡等學者[12]使用Western blot法檢測結(jié)直腸癌中COL3A1及蛋白激酶B (protein kinase B,PKB)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路蛋白水平的變化，過表達COL3A1后PKB/mTOR信號通路中的關鍵分子mTOR和PKB磷酸化程度顯著增高，同時促進下游基因的表達。與其正常組織相比，結(jié)腸癌組織COL3A1的蛋白表達水平明顯增高，且隨腫瘤惡化程度的增高而增加，這表明COL3A1在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促腫瘤生長的作用。Wang Xiao-Qing[13]等同樣對COL3A1與結(jié)腸癌的關系進行了分析，發(fā)現(xiàn)COL3A1在結(jié)直腸癌上皮細胞中的高表達是影響預后的危險因素；體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)COL3A1通過刺激磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K) -AKT信號通路促進結(jié)腸癌細胞增殖，提示COL3A1可能是一個結(jié)腸癌潛在的治療靶點。在一項對33個膠質(zhì)瘤組織樣本進行分析的研究[14]中，發(fā)現(xiàn)COL3A1 基因mRNA水平顯著升高，且升高的表達與高表達級別膠質(zhì)瘤的腫瘤級別相關。膠質(zhì)瘤組織的免疫組織學染色在蛋白水平上顯示了相同的結(jié)果。Becky[15]等人通過對小鼠的乳腺癌模型進行研究，發(fā)現(xiàn)COL3A1缺乏抑制了粘附、侵襲和遷移，但增加了乳腺癌細胞的增殖。上述研究結(jié)果與我們的結(jié)果相似，均提示COL3A1在惡性腫瘤中表達增加。有趣的是，在艾爾肯·肉孜比拉力[16]的研究中，她們發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與我們相反，她們的免疫組化結(jié)果顯示COL3A1在宮頸癌中表達低于正常宮頸組織，且人乳頭狀瘤病毒(HPV)陰性的宮頸癌細胞COL3A1的表達水平更高。過表達COL3A1后的宮頸癌細胞遷徙能力下降。Yu Shi[17]等人發(fā)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白3 (METTL3)可以通過增加COL3A1的m6A甲基化而下調(diào)其表達，最終抑制三陰性乳腺癌 (TNBC)細胞的轉(zhuǎn)移。這提示 COL3A1 在不同腫瘤中可能存在不同的功能，引起這種不同結(jié)果的原因可能是ECM與腫瘤細胞間的動態(tài)作用所致。綜上所述，COL3A1在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，這為探究微環(huán)境與腫瘤細胞之間的相互作用提供了新的思路。

這些研究結(jié)果可能為指導胃癌的臨床治療提供新的依據(jù)，但是COL3A1與胃癌的關系還是有待進一步的深入研究。