吳白駿 劉 恬 胡朝全

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是原發(fā)性肝癌最常見(jiàn)的病理類(lèi)型，是一種惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差以及具有難治性的異質(zhì)性疾病[1]。據(jù)報(bào)道2020 年原發(fā)性肝癌在全球癌癥發(fā)生率中排名第6位，病死率排名第3位[2]。由于大部分肝癌患者診斷即為晚期，因此很多人都失去了手術(shù)機(jī)會(huì)[3]。此外，索拉非尼等抗血管生成藥物臨床耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，需要尋找新療法突破肝癌治療瓶頸，實(shí)施個(gè)體化治療[4]。異常免疫微環(huán)境驅(qū)動(dòng)了肝癌發(fā)生、發(fā)展，因此免疫檢查點(diǎn)阻滯劑的使用在肝癌治療中發(fā)揮重要的作用[5]。近年來(lái)，貝伐單抗聯(lián)合阿特利珠單抗的成功應(yīng)用給難治性肝癌患者帶來(lái)了希望，標(biāo)志著肝癌一線治療的變化[6]。目前，臨床報(bào)道只有少數(shù)肝癌患者能夠獲益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑[7]。因此需要尋找能夠獲益于免疫治療的肝癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層，進(jìn)而對(duì)患者的免疫治療進(jìn)行療效預(yù)測(cè)。

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)和腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor, TNFR)超家族由19個(gè)配體和29個(gè)受體組成，大部分成員已經(jīng)被報(bào)道過(guò)與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[8]。TNF家族基因在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)和免疫細(xì)胞的增殖與分化方面發(fā)揮重要作用，能夠通過(guò)共抑制或共刺激方式作用于免疫系統(tǒng)[9]。因此，TNF家族基因的表達(dá)情況可能與腫瘤免疫治療有一定的相關(guān)性。然而，TNF家族成員在肝癌中的表達(dá)模式、免疫學(xué)特征和腫瘤微環(huán)境的研究較少，其功能有待于進(jìn)一步研究。

本研究評(píng)估了肝癌中TNF家族基因的腫瘤免疫微環(huán)境特征，并基于TNF家族基因的表達(dá)，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分型對(duì)肝癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層以識(shí)別能夠獲益于免疫治療的患者。并進(jìn)一步分析了兩型患者的腫瘤突變負(fù)荷和免疫特征如免疫細(xì)胞浸潤(rùn)能力、對(duì)免疫治療的反應(yīng)等。此外，筆者基于兩型的差異基因構(gòu)建了預(yù)測(cè)性能較好的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，該模型對(duì)評(píng)估肝癌患者的預(yù)后具有一定的意義。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)來(lái)源:肝癌轉(zhuǎn)錄組和臨床資料等公共數(shù)據(jù)主要下載自UCSC上的TCGA TARGET GTEx數(shù)據(jù)集，其中包括了371例肝癌樣本(命名為T(mén)CGA-LIHC數(shù)據(jù)集)與160例正常肝組織樣本。驗(yàn)證集ICGC-LIRI-JP肝癌數(shù)據(jù)主要下載自HCCDB數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括212例肝癌樣本。

2.基于TNF家族基因的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分型:基于定義明確的47種TNF基因的表達(dá)量，利用“ConsensuClusterPlus”R包中的k-means算法對(duì)TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集的肝癌患者進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分型[10]。主成分分析(principal component analysis, PCA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理以鑒定了TNF基因?qū)π路中偷膮^(qū)分能力。本研究肝癌新分型是指基于TNF家族基因的表達(dá)情況對(duì)肝癌患者進(jìn)行聚類(lèi)，分為了TNF家族基因表達(dá)水平較高的TNF-A型與表達(dá)水平較低的TNF-B型。既往報(bào)道了TNF家族基因高表達(dá)與較高的免疫浸潤(rùn)水平和較好的免疫治療反應(yīng)相關(guān)。

3.免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分:從TISIDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載28種免疫細(xì)胞各自的基因集，利用“GSVA”R包中的單樣本基因集富集分析(single sample gene set enrichment analysis, ssGSEA)評(píng)估TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中每個(gè)患者免疫細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分[11]。并且利用Spearman相關(guān)性分析分析TNF家族基因的表達(dá)量與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的相關(guān)性。

4.新分型的腫瘤突變負(fù)荷:從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載肝癌患者的突變數(shù)據(jù)，得到肝癌基因突變頻率，利用“waterfalls”R包將結(jié)果以瀑布圖顯示。同時(shí)應(yīng)用“maftools”R包評(píng)估每個(gè)患者的腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutational burden, TMB)。TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中每個(gè)肝癌患者是否發(fā)生TP53、CTNNB1和TTN的突變數(shù)據(jù)下載自cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)。

5.免疫逃逸與免疫反應(yīng):腫瘤免疫功能障礙和排斥(tumor immune dysfunction and exclusion, TIDE)評(píng)分是2018年報(bào)道的一種新型的、能夠較好預(yù)測(cè)免疫逃逸能力和對(duì)免疫治療反應(yīng)的一種評(píng)分系統(tǒng)，其中，TIDE分值越高提示發(fā)生免疫逃逸的可能性越大，免疫治療效果越差[12]。將TCGA-LIHC肝癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達(dá)矩陣輸入到TIDE官網(wǎng)中可以得到每例肝癌患者的TIDE得分和對(duì)免疫治療的反應(yīng)能力。

6.風(fēng)險(xiǎn)模型的建立:應(yīng)用“edgeR”R包對(duì)TNF-A型與TNF-B型的兩組患者進(jìn)行差異基因分析，差異基因的顯著性標(biāo)準(zhǔn)為|log2(差異倍數(shù))|>1，P<0.05。接下來(lái)利用COX單因素回歸分析得到差異基因中與預(yù)后顯著相關(guān)的基因，并應(yīng)用LASSO回歸分析(“glmnet”R包)縮小基因范圍，得到構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)模型的基因相關(guān)系數(shù)，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(risk score)計(jì)算公式：Risk score=∑βi×expi。其中，βi代表基因的系數(shù)，expi代表基因的mRNA表達(dá)量。以風(fēng)險(xiǎn)得分的中位數(shù)為閾值將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。

7.生存分析：Kaplan-Meier生存曲線利用“survival”和“survminer”R包中的Log-rank檢驗(yàn)，并且利用“timeROC”R包評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用 R 3.6.2統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。兩組間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，生存曲線的組間差異采用Log-rank檢驗(yàn)。采用單因素COX回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(hazard ratio, HR)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.TNF家族在肝癌中的免疫特征:為了評(píng)估TNF家族基因在肝癌中的表達(dá)水平，箱線圖(圖1A)表明47種TNF家族基因中大部分基因mRNA水平在癌組織中高于正常組織。進(jìn)一步分析在肝癌中TNF家族基因分別與28種免疫細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)大部分TNF基因與28種免疫細(xì)胞呈正相關(guān)(圖1B)。

圖1 TNF家族在肝癌中的表達(dá)水平及免疫特征A.TNF家族基因在肝癌與癌旁的mRNA表達(dá)水平;B.TNF家族基因與28種免疫細(xì)胞的相關(guān)性

2.基于TNF家族基因構(gòu)建肝癌新分型:接下來(lái)，基于肝癌中TNF基因的表達(dá)量進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析，對(duì)TCGA-LIHC肝癌患者進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)分為兩型時(shí)效果最好，命名為T(mén)NF-免疫分型包括TNF-A型和TNF-B型(圖2A)。PCA發(fā)現(xiàn)新分型能夠?qū)CGA-LIHC患者較好的分開(kāi)(圖2B)。箱線圖(圖2C)顯示，TNF家族基因分別在兩分型中的表達(dá)量情況，結(jié)果提示幾乎所有的TNF家族基因在TNF-A型中顯著上調(diào)。生存分析(圖2D)表明TNF-A型與TNF-B型相比具有較長(zhǎng)的無(wú)進(jìn)展間期(progression-free interval, PFI)和無(wú)病間隔期(disease free interval, DFI)，而總生存期(overall survival, OS)在TNF-A和TNF-B兩型中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 基于TNF家族基因肝癌新分型的建立A.無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分型對(duì)肝癌進(jìn)行分型；B.PCA分析；C.兩種分型中TNF家族基因的表達(dá)量比較(*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001)；D.Kaplan-Meier曲線比較兩種分型的預(yù)后情況

3.TNF免疫分型中基因突變特征:接下來(lái)結(jié)合肝癌患者的基因突變特征對(duì)TNF肝癌新分型進(jìn)行更細(xì)致的分析，小提琴箱線圖(圖3A)表明TNF-B型中的TMB明顯高于TNF-A型。瀑布圖(圖3B)顯示肝癌患者基因突變頻率排名前3位的基因分別是TP53(30%)、CTNNB1(25%)和TTN(24%)。進(jìn)一步分析，堆積圖表明TNF-B型具有較高的CTNNB1和TTN突變可能，而TP53突變?cè)趦尚椭胁町悷o(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)?；颊咻^高的基因突變常提示預(yù)后不良，這與TNF-A型的預(yù)后優(yōu)于TNF-B型的結(jié)果相一致。

圖3 TNF免疫分型中基因突變特征A.比較兩型的腫瘤突變負(fù)荷；B.肝癌中基因突變頻率排名；C.比較兩型中TP53、CTNNB1和TNN基因突變比例

4.TNF免疫分型的免疫特征:TNF家族基因在免疫過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，接下來(lái)，用ssGSEA算法評(píng)估28種免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)程度，小提琴箱線圖(圖4A)表明，TNF-A型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度較高，包括活化的CD4 T細(xì)胞、活化的CD8 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK cell)等。其中，生存分析(圖4B)發(fā)現(xiàn)，活化的CD8 T細(xì)胞和效應(yīng)記憶CD8 T細(xì)胞浸潤(rùn)程度越高的患者預(yù)后越好，這與TNF-A型患者預(yù)后優(yōu)于TNF-B型相一致?？紤]到免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)與免疫反應(yīng)相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PD-1、PD-L1、LAG3和CTLA4在TNF-A型的mRNA表達(dá)水平均顯著升高(圖4C)。堆積圖提示在TNF-A型中患者對(duì)免疫治療反應(yīng)率高于TNF-B型(圖4D)。箱線圖(圖4E)提示TNF-A型中患者TIDE得分值低于TNF-B型。以上分析均提示TNF-A型的患者可能對(duì)免疫治療較敏感。

圖4 TNF免疫分型的免疫特征A.兩型之間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度的比較；B.免疫細(xì)胞的生存分析；C.兩種亞型之間免疫檢查點(diǎn)分子表達(dá)量的比較；D.兩種亞型之間對(duì)免疫治療反應(yīng)與不反應(yīng)患者所占的比例；E.兩種亞型之間TIDE得分的比較

5.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的構(gòu)建及其臨床價(jià)值:為了對(duì)TNF家族基因在肝癌中的作用進(jìn)行個(gè)性化評(píng)估，筆者基于TNF免疫分型進(jìn)一步構(gòu)建了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分系統(tǒng)。首先，對(duì)TNF-A型與TNF-B型患者進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)在TNF-A型中有866個(gè)上調(diào)的基因與167個(gè)下調(diào)的基因(圖5A)。根據(jù)差異倍數(shù)進(jìn)行排序，篩選出上調(diào)基因中排序前100的基因和下調(diào)基因中排序前100的基因進(jìn)行COX與LASSO回歸分析。COX單因素回歸分析聯(lián)合LASSO回歸分析縮小基因范圍，篩選出有14個(gè)基因(圖5B)被納入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型。森林圖(圖5C)顯示構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的14個(gè)基因的預(yù)后價(jià)值，HR>1表明該基因?yàn)轱L(fēng)險(xiǎn)因子，否則為保護(hù)因子。生存分析提示高風(fēng)險(xiǎn)組較低分險(xiǎn)組的患者預(yù)后不良，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5D)。其中，1年、3年和4年患者總生存期的受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線的曲線下面積(area under the curve, AUC)分別為0.758、0.789 和 0.768，證明預(yù)測(cè)模型較為準(zhǔn)確(圖5E)。接下來(lái)，利用ICGC-JP數(shù)據(jù)集進(jìn)行外部驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)得分較高的分組其預(yù)后也顯著較差(圖5F)，且1年、3年和4年ROC的AUC分別為0.674、0.713和0.710，也證明了預(yù)測(cè)模型較好(圖5G)。熱圖(圖5H)表明，較高的G分級(jí)、M轉(zhuǎn)移、N轉(zhuǎn)移、T分期與TNM分期出現(xiàn)在高風(fēng)險(xiǎn)組中，且T分期與TNM分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的構(gòu)建和臨床價(jià)值的評(píng)估A.TNF-A型與TNF-B型的差異分析；B.LASSO回歸分析得到構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的基因；C.構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的基因的風(fēng)險(xiǎn)比；D.高低風(fēng)險(xiǎn)組的生存分析；E.風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的ROC曲線；F.ICGC-JP驗(yàn)證集中高低分險(xiǎn)組的生存分析；G.ICGC-JP驗(yàn)證集的ROC曲線；H.TCGA-LIHC數(shù)據(jù)集中高低風(fēng)險(xiǎn)組臨床病理特征的評(píng)估(*P<0.001)

討 論

肝癌是一種異質(zhì)性的疾病，該疾病的主要風(fēng)險(xiǎn)因素包括病毒感染(乙型病毒性肝炎為主)，非酒精性脂肪性肝病和糖尿病等[13]。由于大部分肝癌患者術(shù)后易復(fù)發(fā)，并且抗血管生成藥物的耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，因此免疫治療在肝癌治療中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用[14]。但由于只有少部分肝癌患者能夠獲益于免疫治療，因此亟需構(gòu)建肝癌新分型以篩選免疫治療獲益人群，實(shí)施個(gè)體化治療。本研究是首次基于TNF家族基因?qū)Ω伟┗颊哌M(jìn)行分型，比較兩個(gè)分型的腫瘤突變特征和免疫學(xué)特征，并進(jìn)一步構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型以尋找新型生物學(xué)標(biāo)志物預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。

TNF家族已經(jīng)被報(bào)道能夠通過(guò)增加TNFR超家族成員信號(hào)以增強(qiáng)腫瘤的免疫反應(yīng)或者藥物通過(guò)結(jié)合TNF家族成員直接殺死腫瘤[15]。本研究比較了47種TNF家族基因在肝癌與癌旁組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)大部分基因在肝癌中顯著上調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TNF家族基因與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)大部分呈正相關(guān)，這些結(jié)果均表明肝癌中TNF基因可能影響免疫特征。

目前，已經(jīng)報(bào)道的肝癌分型有G1～G6分型、S1～S3分型和iC1～iC3分型等[16～18]。但是沒(méi)有報(bào)道過(guò)基于TNF表達(dá)模式建立的肝癌分型，且報(bào)道的能夠用來(lái)區(qū)分對(duì)免疫治療是否敏感的分型較少[19]。因此，筆者以TNF表達(dá)量為依據(jù)，采用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)的方式將TCGA-LIHC患者分為兩種具有不同免疫特征及腫瘤突變特征的分型，其中，TNF-A型預(yù)后好。基因突變促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，已有研究報(bào)道TP53突變、CTNNB1突變或TTN突變驅(qū)動(dòng)肝癌的發(fā)生、發(fā)展且往往預(yù)示患者預(yù)后差[20～22]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，TNF-B型的CTNNB1突變和TTN突變較高且預(yù)后差。

腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞的相互調(diào)節(jié)作用決定了免疫治療反應(yīng)，并且TNF家族基因與免疫特征相關(guān)，因此本研究進(jìn)一步分析比較了TNF-A型與TNF-B型的免疫特征以尋找能夠獲益于免疫治療的人群[23]。近年來(lái)有研究報(bào)道，在肝癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度高(例如B淋巴細(xì)胞浸潤(rùn))被確定為獨(dú)立的積極預(yù)后因素[24]。免疫檢查點(diǎn)分子(PD-1、PD-L1、LAG3和CTLA4)已被確定為免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)模式與治療反應(yīng)密切相關(guān)，為藥物的選擇提供了有效的指導(dǎo)[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-A型的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度強(qiáng)、免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)高、免疫逃逸能力弱和對(duì)免疫治療敏感，這與TNF-A型預(yù)后較好相符合，而且TNF-B型中CTNNB1突變頻率高，高CTNNB1突變促進(jìn)了免疫逃逸以及對(duì)免疫治療反應(yīng)弱[26]。以上結(jié)果均提示TNF-A型是一種“熱”腫瘤，對(duì)免疫治療敏感。

考慮到本研究的臨床意義，筆者利用TNF-A型與TNF-B型的差異基因構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型以篩選新型生物學(xué)標(biāo)志物評(píng)估肝癌患者的風(fēng)險(xiǎn)。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高的患者往往預(yù)后不良。此外，該模型也能用來(lái)評(píng)估患者的臨床特征，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者具有較高的T分期和TNM分期。

綜述所述，本研究基于TNF家族基因建立肝癌TNF免疫新分型，能夠用來(lái)區(qū)分患者的免疫特征以及對(duì)免疫治療的反應(yīng)。并進(jìn)一步構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，識(shí)別新型生物學(xué)標(biāo)志物以預(yù)測(cè)肝癌患者的預(yù)后及臨床病理特征，但具體的作用機(jī)制還需要開(kāi)展進(jìn)一步研究。