陶海英 孔祥靜 馬 翠

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的并發(fā)癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。在發(fā)展中國家，尤其在中國DN的發(fā)生率正在逐年增加[2]。然而，DN患者的臨床特征是持續(xù)性白蛋白尿、腎小球基膜厚度增加和細(xì)胞外基質(zhì)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致抑制細(xì)胞自噬和足細(xì)胞損傷等，最終發(fā)展成DN[3]。目前，DN患者的治療方式主要通過針對高血糖和血壓的管理，但治療效果十分有限[4]。FOXO1是一種轉(zhuǎn)錄因子，且FOXO1可通過誘導(dǎo)自噬體形成參與調(diào)控細(xì)胞分化[5]。筆者所在課題組前期研究表明，F(xiàn)OXO1對DN具有保護(hù)作用，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究從C57BL/6小鼠中分離出脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，構(gòu)建了過表達(dá)FOXO1的ADSCs細(xì)胞。進(jìn)一步探究過表達(dá)FOXO1的ADSCs細(xì)胞在DN中的作用，為DN患者尋找新的治療方向。

材料與方法

1.材料：C57BL/6小鼠來自于杭州醫(yī)學(xué)院；小鼠腎足細(xì)胞(MP5細(xì)胞)購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫(上海)；RPMI1640、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、膠原酶和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；慢病毒過表達(dá)FOXO1載體和空白對照載體由上海吉瑪生物公司構(gòu)建；FOXO1、CD29、CD90、CD34、CD45、Bax、Bcl-2、p62、LC3、β-actin和山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、胰島素、吲哚美辛、異丁基1甲基黃嘌呤、Triton x-100和多聚甲醛等購自北京Solarbio公司。

2.細(xì)胞分離和培養(yǎng)：收集C57BL/6小鼠腹股溝皮下脂肪組織，利用膠原酶消化法分離ADSCs。首先，脂肪組織切碎PBS洗滌2次，1200r/min離心10min。除去上清液將膠原酶加入沉淀中，在40min后加入完全培養(yǎng)基。然后，過濾細(xì)胞并用1500r/min離心8min，隨后用1640培養(yǎng)基重懸，最后得到ADSCs細(xì)胞。ADSCs 和 MPC5細(xì)胞體外間接共培養(yǎng)：取第3代ADSCs(1×105個(gè)/毫升)和 MPC5細(xì)胞(1×105個(gè)/毫升)按1∶1接種于Transwell系統(tǒng)的上室與培養(yǎng)板中間接共培養(yǎng)。過表達(dá)FOXO1載體和空白載體慢病毒感染ADSCs 48h后，得到ADSCs(FOXO1+)(過表達(dá)FOXO1的ADSCs 細(xì)胞)和ADSCs(轉(zhuǎn)染空白對照載體的ADSCs細(xì)胞)。

3.細(xì)胞分組：實(shí)驗(yàn)分為對照組、高糖組、高糖+ADSCs組、高糖+ADSCs(FOXO1+)組和高糖+ADSCs(FOXO1+)+自噬抑制劑3-MA組。對照組為5.5mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)的MPC5細(xì)胞；高糖組為30mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)的MPC5細(xì)胞；高溏+ADSCs組為轉(zhuǎn)染空白對照載體的ADSCs與MPC5在30mmol/L D-葡萄糖環(huán)境下間接共培養(yǎng)；高糖+ADSCs(FOXO1+)組為過表達(dá)FOXO1的ADSCs與MPC5在30mmol/L D-葡萄糖環(huán)境下間接共培養(yǎng)；高糖+ADSCs(FOXO1+)+自噬抑制劑3-MA組為過表達(dá)FOXO1的ADSCs與MPC5在30mmol/L D-葡萄糖環(huán)境下間接共培養(yǎng)，同時(shí)用自噬抑制劑3-MA處理。

4.ADSCs的成骨和成脂分化及鑒定：ADSCs成骨分化能力，將ADSCs傳代3次后接種于6孔板培養(yǎng)24h后，用成骨培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1μmol/L地塞米松、1μmol/L β-甘油磷酸鈉和50μg/ml抗壞血酸)誘導(dǎo)ADSCs 14天。將誘導(dǎo)ADSCs用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15min。然后，用0.2%茜素紅染色20min，洗滌后光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果并拍照。ADSCs成脂分化能力：將ADSCs在成脂培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1μmol/L地塞米松、60μmol/L吲哚美辛、0.5μmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和10μg/ml胰島素)中培養(yǎng)7天；然后，ADSCs經(jīng)PBS清洗，多聚甲醛固定5min，丙二醇中染色5min和油紅O染色15min。最后，ADSCs用油紅染色30s后顯微鏡觀察并拍攝圖片。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡：第3代ADSCs經(jīng)胰蛋白酶消化離心5min，取上清液用PBS重懸細(xì)胞，與一抗CD29、CD90、CD34和CD45孵育30min后，用10%正常山羊血清重懸細(xì)胞，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。按Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)方法，取MPC5細(xì)胞加入5μl Annexin Ⅴ-/FITC避光反應(yīng)20min后，再加入10μl PI避光孵育10min，采用流式細(xì)胞儀檢測染色MPC5細(xì)胞凋亡情況。

6.CCK-8法檢測細(xì)胞活力:按照CCK-8試劑盒說明來檢測各組MPC5細(xì)胞增殖情況，將MPC5細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)接種于96孔板中，培養(yǎng)結(jié)束后加入CCK-8溶液培養(yǎng)4h后通過酶標(biāo)儀檢測450nm處的A值。細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值)×100%。

7.免疫熒光：各組MPC5細(xì)胞用-20℃預(yù)冷的甲醇溶液固定30min，后用PBS洗滌3次。細(xì)胞用0.1% Triton X-100處理15min，用5% BSA封閉1h。MPC5細(xì)胞和與一抗LC3(1∶200)在4℃孵育過夜。后與二抗山羊抗兔IgG孵育1h后DAPI染色5min，最后采用共聚焦激光掃描顯微鏡(日本Olympus公司，F(xiàn)V1200)觀察并拍照。

8.Western blot法檢測：各組細(xì)胞采用裂解液提取總蛋白質(zhì)，通過BCA試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移至PDVF膜中，用5%脫脂牛奶封閉1h后并與一抗(FOXO1：1∶1000，Bax：1∶1000，Bcl-2：1∶1000，p62：1∶1000，LC3：1∶500，β-actin：1∶1000)在4℃過夜，后與二抗山羊抗兔IgG(1∶2000)反應(yīng)1h，隨后通過ECL顯色來獲取顯色蛋白條帶。

結(jié) 果

1．ADSCs鑒定：ADSCs分離自C57BL/6小鼠的皮下脂肪組織。ADSCs傳代3次后采用ADSCs的陽性標(biāo)志物CD29、CD90以及陰性標(biāo)志物CD34、CD45進(jìn)行流式染色檢測，來評估ADSCs純度。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CD29(98.1%)和CD90(97.6%)在ADSCs中均高表達(dá)，而CD34(1.9%)和CD45(1.1%)表達(dá)極低，此結(jié)果表明該ADSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性(圖1A)。另外，為了證實(shí)ADSCs的分化能力，將ADSCs在成骨培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，茜素紅染色結(jié)果表明成骨培養(yǎng)基顯著誘導(dǎo)了茜素紅染色陽性細(xì)胞的數(shù)量(圖1B)。同時(shí)，油紅O染色結(jié)果顯示，ADSCs具有較高的成脂潛力(圖1C)。以上結(jié)果證實(shí)ADSCs分離成功。

圖1 ADSCs鑒定A.流式細(xì)胞術(shù)檢測ADSCs中CD29、CD90、CD34和CD45的表達(dá)；B.ADSCs細(xì)胞的茜素紅染色圖(×100)；C.ADSCs細(xì)胞的油紅O染色圖(×100)

2.FOXO1蛋白表達(dá)：研究表明，F(xiàn)OXO1可以調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化[6]。筆者重點(diǎn)研究了FOXO1在高糖環(huán)境中誘導(dǎo)足細(xì)胞MPC5的調(diào)控機(jī)制，Western blot法檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，F(xiàn)OXO1在高糖組MPC5中表達(dá)下調(diào)(圖2B)。此外，筆者構(gòu)建了過表達(dá)FOXO1的ADSCs細(xì)胞。Western blot法檢測結(jié)果表明，與ADSCs比較，F(xiàn)OXO1在ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞中高表達(dá)(圖2A)，這表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了過表達(dá)FOXO1的ADSCs細(xì)胞[ADSCs(FOXO1+)]。

圖2 FOXO1蛋白表達(dá)分析A.Western blot法檢測MPC5中FOXO1的表達(dá)；B.Western blot法檢測ADSCs中FOXO1的表達(dá)

3.ADSCs(FOXO1+)可有效抑制高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡：高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致糖尿病腎病中足細(xì)胞損傷。因此，通過CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組MPC5細(xì)胞活力顯著降低，MPC5細(xì)胞凋亡顯著上升，這驗(yàn)證了高糖能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡(圖3中A和B)。另外，高糖處理的MPC5細(xì)胞與ADSCs間接共培養(yǎng)后，檢測發(fā)現(xiàn)MPC5細(xì)胞凋亡率下降，而細(xì)胞活力增加；高糖處理的MPC5細(xì)胞與ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞間接共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步降低，這表明ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞抑制高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡(圖3C)。

圖3 ADSCs(FOXO1+)抑制高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡A.流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC5細(xì)胞凋亡；B.CCK-8檢測MPC5細(xì)胞活力，與對照組比較，*P<0.001；與高糖組比較，#P<0.01；與高糖+ADSCs組比較，ΔP<0.05；C.Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.001；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+ADSCs組比較，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01

4.ADSCs(FOXO1+)促進(jìn)MPC5細(xì)胞自噬：FOXO1在細(xì)胞自噬誘導(dǎo)中發(fā)揮作用[7]。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，高糖組MPC5細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3顯著降低(圖4A)。此外，將高糖處理的MPC5細(xì)胞與ADSCs間接共培養(yǎng)后，MPC5細(xì)胞的自噬水平增加；同時(shí)，高糖處理的MPC5細(xì)胞與ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞間接共培養(yǎng)后，MPC5細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)進(jìn)一步增加；以上結(jié)果表明ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞可促進(jìn)高糖抑制的MPC5細(xì)胞自噬(圖4B)。

圖4 ADSCs(FOXO1+)促進(jìn)MPC5細(xì)胞自噬A.免疫熒光檢測MPC5細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)；B.Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白p62和LC3-Ⅱ的表達(dá)，與對照組比較，*P<0.001;與高糖組比較，#P<0.05;與高糖+ADSCs組比較，ΔP<0.05

5.ADSCs(FOXO1+)通過促進(jìn)細(xì)胞自噬有效抑制高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡：FOXO1過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)高糖抑制的MPC5細(xì)胞自噬和凋亡。本研究通過在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加自噬抑制劑3-MA(5mmol/L)來抑制MPC5細(xì)胞自噬。免疫熒光檢測顯示，與高糖+ ADSCs(FOXO1+)組比較，高糖+ ADSCs (FOXO1+)+自噬抑制劑3-MA組的MPC5細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3顯著降低(圖5A)。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與高糖組比較，高糖+ADSCs(FOXO1+)組的細(xì)胞凋亡明顯降低，但同時(shí)添加3-MA抑制細(xì)胞自噬后，發(fā)現(xiàn)ADSCs(FOXO1+)對高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)，這表明ADSCs(FOXO1+)細(xì)胞抑制高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡依賴于細(xì)胞自噬(圖5B)。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，與高糖+ADSCs(FOXO1+)組比較，高糖+ADSCs(FOXO1+)+自噬抑制劑3-MA組的MPC5細(xì)胞活力有所下降，提示ADSCs(FOXO1+)影響MPC5的細(xì)胞活力依賴于細(xì)胞自噬(圖5C)。與此同時(shí)，Western blot法檢測驗(yàn)證了抑制MPC5細(xì)胞自噬能夠促進(jìn)MPC5細(xì)胞凋亡(圖5D)。

圖5 ADSCs(FOXO1+)抑制高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制A.免疫熒光檢測MPC5細(xì)胞的自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)；B.流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC5細(xì)胞凋亡；C.CCK-8檢測MPC5細(xì)胞活力，與對照組比較，*P<0.001；與高糖組比較，#P<0.01；與高糖+ADSCs組比較，ΔP<0.05； D.Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、p62和LC3-Ⅱ表達(dá)，與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05；與高糖+ADSCs(FOXO1+)組比較，ΔP<0.05

討 論

DN是以代謝紊亂和慢性炎癥為特征的糖尿病并發(fā)癥，同時(shí)DN足細(xì)胞功能障礙會(huì)加重糖尿病腎臟損傷[8]。因此，迫切需要新的治療策略來改善DN損傷。本研究發(fā)現(xiàn)FOXO1通過調(diào)控自噬改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，為DN損傷的治療提供了新的思路。

ADSCs已被證明對腎臟損傷具有保護(hù)作用，ADSCs也具有促進(jìn)糖尿病大鼠腎臟細(xì)胞修復(fù)的潛能[9]。研究表明，ADSCs能夠有效抑制DN足細(xì)胞凋亡，且ADSCs可以通過促進(jìn)自噬和抑制足細(xì)胞凋亡來減輕DN[10,11]。本研究通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了ADSCs與MPC5細(xì)胞間接共培養(yǎng)能夠降低高糖誘導(dǎo)MPC5細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而改善足細(xì)胞的損傷。本研究結(jié)果與既往研究報(bào)道具有一致性。

已有研究表明，自噬是細(xì)胞分解自身成分逃避多種應(yīng)激條件來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而自噬也參與某些人類疾病的發(fā)展和分化[12]。在DN中增強(qiáng)細(xì)胞自噬能夠保護(hù)細(xì)胞凋亡，且高糖能夠誘導(dǎo)MPC5細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)[13,14]。這些結(jié)論揭示增強(qiáng)細(xì)胞自噬能夠改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，而在本研究中，高表達(dá)FOXO1的ADSCs可以促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞的自噬，使MPC5細(xì)胞活力增加，這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

研究顯示，激活FOXO1可以改善糖尿病大鼠腎細(xì)胞的損傷，而過表達(dá)FOXO1能夠調(diào)控TXNIP來減少DN小鼠腎細(xì)胞凋亡[15,16]。同時(shí)，F(xiàn)OXO1通過影響脂肪干細(xì)胞在自噬過程中發(fā)揮重要作用[17]。因此，本研究著重探究高表達(dá)FOXO1的ADSCs對MPC5細(xì)胞的自噬影響。筆者的結(jié)果證實(shí)了過表達(dá)FOXO1的ADSCs能夠促進(jìn)高糖抑制的MPC5細(xì)胞自噬進(jìn)而修復(fù)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，但其具體的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究表明,過表達(dá)FOXO1的脂肪干細(xì)胞通過調(diào)控足細(xì)胞自噬,從而改善高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，為糖尿病腎病患者提供了新的治療方向。