李玉惠 王海生 鄧秀玲

我國(guó)是肝癌高發(fā)國(guó)，全球每年新發(fā)病例中有一半發(fā)生在我國(guó)[1]。近年來(lái)我國(guó)在肝癌治療方面逐步形成了以手術(shù)、介入治療為主的綜合模式[2]。但是由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已發(fā)展至進(jìn)展期或存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療和預(yù)后不佳[3]。傳統(tǒng)醫(yī)藥制劑治療腫瘤時(shí)能在改善臨床癥狀、緩解病情、減輕毒性不良反應(yīng)、提高生存質(zhì)量等方面發(fā)揮獨(dú)特的作用，已成為近年研究的關(guān)注點(diǎn)。阿拉嘎-斑布是一種傳統(tǒng)蒙藥，其蟲(chóng)體的有效成分為斑蝥素(cantharidin，CTD)，抗癌功效在1980年由Chen等[4]首次發(fā)現(xiàn)，之后的研究證實(shí)CTD可以抑制肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)，但作用機(jī)制尚不明確，特別是從改善機(jī)體免疫功能角度研究CTD作用機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道[5]。筆者課題組前期通過(guò)混合提取法從阿拉嘎-斑布蟲(chóng)體中提取到含量較高的斑蝥素，經(jīng)高效液相與標(biāo)準(zhǔn)品鑒定其純度為87.8%，同時(shí)觀(guān)察到其在體外可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、遷移[8]。因此，本研究擬從免疫檢測(cè)點(diǎn)分子程序性死亡因子受體-1(programmed death receptor 1，PD-1)及其配體(programmed death-ligand 1,PD-L1)角度，探究阿拉嘎-斑布有效提取物斑蝥素抗腫瘤的免疫機(jī)制，為斑蝥素抗腫瘤機(jī)制的闡明及將阿拉嘎-斑布開(kāi)發(fā)為蒙藥成藥用于臨床抗腫瘤提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株：雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量為20±2g，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010]。飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)鼠房，實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定。H22細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)(上海)，培養(yǎng)于1640培養(yǎng)基中，置于 37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.藥物：取前期經(jīng)混合提取法提取的10mg CTD，加100ml PBS(含0.1% DMSO)后超聲助溶3h后，配制成濃度為1mg/kg的原液，并稀釋為0.5mg/kg、0.25mg/kg的工作液，分裝后儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。

3.試劑：1640培養(yǎng)基(批號(hào)：8121074)、PBS(批號(hào)：8120335)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；5-氟尿嘧啶(批號(hào)：1209F021)購(gòu)自北京Solarbio公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR試劑盒(批號(hào)：RR820A)購(gòu)自日本TaKaRa公司；PD-1(批號(hào)：ab228857)、PD-L1(批號(hào)：ab238697)兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)(批號(hào)：AF1009)、PI3K(批號(hào)：AF6241)、Akt(批號(hào)：AF6261)兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；山羊抗兔熒光二抗(批號(hào)：A23920)購(gòu)自美國(guó)Abbkine公司。

4.肝癌H22荷瘤鼠模型的建立：無(wú)菌環(huán)境下，在BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)注射鼠源性肝癌細(xì)胞株H22，當(dāng)荷瘤小鼠腹部出現(xiàn)異常液體蓄積后，將其脫頸處死，無(wú)菌條件下取腹腔積液，離心，將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)到1×107個(gè)/毫升，冰上備用。小鼠的右腋皮下經(jīng)乙醇消毒后接種0.2ml細(xì)胞懸液，4～5天后健康小鼠腋下出現(xiàn)瘤體即為造模成功。

5.實(shí)驗(yàn)分組及給藥：將荷瘤鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、5-FU組和CTD高、中、低劑量組。CTD高、中、低劑量組每日分別按1mg/kg、0.5mg/kg、0.25mg/kg劑量腹腔注射給藥，5-FU組按25mg/kg每?jī)商熳⑸浣o藥，模型組每日注射1次0.9% NaCl溶液；給藥周期為15天?？瞻捉M不給藥。

6.小鼠體質(zhì)量、腫瘤體積及抑瘤率的計(jì)算：分別于給藥的第3、6、9、12、15天稱(chēng)重小鼠，記錄體質(zhì)量生長(zhǎng)曲線(xiàn)；用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤的長(zhǎng)徑(a) 和短徑(b)，根據(jù)公式：V=ab2/2，計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。給藥結(jié)束后處死小鼠，剝?nèi)∫覆科は履[瘤組織，電子天平稱(chēng)取瘤質(zhì)量，根據(jù)公式計(jì)算各組抑瘤率，抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

7.小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化：將組織塊脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋，切片后行常規(guī)HE染色，中性樹(shù)膠封片后鏡檢。

8.脾臟中PD-1 mRNA和腫瘤組織中PD-L1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)：按說(shuō)明書(shū)方法提取組織RNA，測(cè)濃度和純度后將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PD-1引物序列：上游引物：5′-GAGCTGGAAGCAAGGACGAC-3′,下游引物：5′-GTCCAGCTCCTCATAGGCCA-3′。PD-L1引物序列：上游引物：5′-CTGGACCTGCTTGCGTTAGTGG-3′,下游引物：5′-CCCCTGAAGTTGCTGTGCTGAG-3′。內(nèi)參GAPDH引物序列：上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′,下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。qPCR反應(yīng)(20μl體系)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10μl，上游引物 0.8μl，下游引物 0.8μl，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl，cDNA 2.0μl，滅菌水6.0μl。反應(yīng)條件：95℃變性30s；40次循環(huán)：95℃ 3s、60℃ 30s；程序默認(rèn)熔解段。重復(fù)3次。PCR儀程序結(jié)束后，用2-△△Ct方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

9.脾臟中PD-1、腫瘤組織中PD-L1、PI3K/Akt、HIF-1α蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：提取組織總蛋白后進(jìn)行蛋白定量、變性，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后一抗(PD-1:1∶2000，PD-L1:1∶1000，PI3K:1∶2000，Akt:1∶2000， HIF-1α:1∶2000，GAPDH:1∶5000)4℃過(guò)夜，二抗避光孵育后上機(jī)掃描條帶并分析灰度值。目的蛋白/GAPDH代表因子的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣本重復(fù)3次。

結(jié) 果

1.斑蝥素對(duì)荷瘤鼠體質(zhì)量的影響：各組小鼠給藥期間體質(zhì)量變化結(jié)果顯示，空白組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)趨勢(shì)平穩(wěn)；與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量有明顯增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，5-FU組小鼠體質(zhì)量增加不明顯(P>0.05)，CTD各劑量組小鼠體質(zhì)量均有增加(P<0.05)；與模型組比較，5-FU組和CTD高、中、低劑量組小鼠體質(zhì)量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1，圖1)。

圖1 各組小鼠體質(zhì)量變化曲線(xiàn)

表1 各組小鼠最終體質(zhì)量

2.斑蝥素對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響：荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)結(jié)果如表2、圖2所示，模型組小鼠腫瘤生長(zhǎng)最快，體積、質(zhì)量最大，與模型組比較，各給藥組小鼠腫瘤生長(zhǎng)稍緩，5-FU組小鼠腫瘤質(zhì)量顯著減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，對(duì)腫瘤的抑制率為45.09%，CTD各組中高劑量組對(duì)腫瘤抑制最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑瘤率為38.96%，效果與5-FU最為相似。

表2 各實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤體積、重量及抑瘤率

圖2 各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

3.各組小鼠腫瘤病理學(xué)染色結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤體組織結(jié)構(gòu)的變化詳見(jiàn)圖3，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察到模型組腫瘤細(xì)胞數(shù)量多、分布均勻而緊密，細(xì)胞質(zhì)少，偶有空泡，細(xì)胞核呈多形性且藍(lán)染較深；與模型組比較，5-FU組和CTD各劑量組腫瘤細(xì)胞數(shù)量明顯減小，空泡數(shù)量增多，結(jié)締組織增多，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)了不同程度的壞死和凋亡，CTD高劑量組較中、低劑量組更為明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，斑蝥素對(duì)肝癌腫瘤的生長(zhǎng)有抑制作用，以高劑量效果最優(yōu)，故本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用斑蝥素劑量為高劑量(后續(xù)CTD組指CTD高劑量組)。

圖3 各組小鼠瘤體組織(HE,×200)A.模型組；B.5-FU組；C.CTD高劑量組；D.CTD中劑量組；E.CTD低劑量組

4.斑蝥素對(duì)荷瘤鼠PD-1、PD-L1 mRNA表達(dá)的變化：與模型組比較，5-FU組和CTD組中PD-1 mRNA和PD-L1 mRNA的含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4、圖5)。

圖4 小鼠PD-1及PD-L1mRNA熔解曲線(xiàn)A.PD-1熔解曲線(xiàn)；B.PD-L1熔解曲線(xiàn)

圖5 各組小鼠PD-1及PD-L1 mRNA表達(dá)情況與模型組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05

5.斑蝥素給藥后PD-1、PD-L1、HIF-1α、PI3K/Akt蛋白表達(dá)的變化：與模型組比較，5-FU組和CTD組脾臟組織中PD-1蛋白的表達(dá)水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU組和CTD組腫瘤組織中PD-L1蛋白表達(dá)較模型組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。與模型組比較，5-FU組和CTD組中PI3K蛋白的表達(dá)水平均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；5-FU組和CTD組中Akt蛋白的表達(dá)量較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，5-FU組中HIF-1α蛋白的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CTD組HIF-1α蛋白的表達(dá)也有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)。

圖6 各組小鼠PD-1、PD-L1蛋白表達(dá)情況與模型組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05

圖7 各組小鼠腫瘤組織中PI3K/AKT、HIF-1α蛋白表達(dá)情況與模型組比較，*P<0.05,**P<0.05;與5-FU組比較，#P<0.05

討 論

斑蝥是一種芫菁科昆蟲(chóng)，在蒙醫(yī)藥中稱(chēng)之為阿拉嘎-斑布，常被制成各種劑型用于治療斑禿、面部軟疣等疾病[9,10]。研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥的有效成分斑蝥素具有抗腫瘤的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)控制炎癥微環(huán)境、細(xì)胞增殖與程序性細(xì)胞死亡、血管生成渠道及細(xì)胞附著等方面來(lái)實(shí)現(xiàn)的[11～13]。斑蝥素的相關(guān)制劑已被臨床用于肝癌的治療，但其治療肝癌的作用機(jī)制尚未明確。腫瘤發(fā)生、發(fā)展主要由免疫抑制和免疫逃逸導(dǎo)致，研究表明，免疫抑制和免疫逃逸與腫瘤細(xì)胞PD-L1的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)[14]。PD-L1是機(jī)體T淋巴細(xì)胞活化的共抑制分子，在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)[15～17]。腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1能夠與T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷性信號(hào)，使T細(xì)胞的活化受到抑制，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫耐受性，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[18]。HIF-1α是PD-L1主要的上游調(diào)控因子，低氧狀態(tài)下對(duì)PD-L1的表達(dá)有正向調(diào)節(jié)作用，使免疫細(xì)胞的活性下降，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。

本研究通過(guò)觀(guān)察斑蝥素對(duì)荷瘤鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速，體積增大最明顯，斑蝥素對(duì)肝癌移植瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，以高劑量的抑瘤效果最佳，抑制率為38.96%，與5-FU最為相似。各組腫瘤組織HE染色結(jié)果顯示，模型組腫瘤細(xì)胞數(shù)量多、排列緊密、不規(guī)則，胞質(zhì)少。與模型組比較，5-FU組和CTD各組腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少，空泡及結(jié)締組織增多，腫瘤細(xì)胞壞死數(shù)目增多，CTD各組里以高劑量組最為顯著?？紤]CTD可能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞破裂來(lái)減少腫瘤細(xì)胞數(shù)量、導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，且為本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用斑蝥素最佳劑量提供依據(jù)。

通過(guò)對(duì)荷瘤鼠脾臟PD-1和腫瘤組織PD-L1 mRNA及蛋白表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示PD-1、PD-L1 在肝癌荷瘤鼠中呈高表達(dá)狀態(tài)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[19]。與模型組比較，經(jīng)斑蝥素處理后的荷瘤鼠體內(nèi)PD-1、PD-L1 mRNA及蛋白水平顯著下降。PD-1/PD-L1通路上下游的HIF-1α、PI3K/Akt分子表達(dá)降低，提示一定劑量的斑蝥素對(duì)肝癌荷瘤鼠具有抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用?？紤]是腫瘤的發(fā)生使小鼠體內(nèi)環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，從而高表達(dá)HIF-1α，促進(jìn)肝癌細(xì)胞高表達(dá)PD-L1；PD-1與PD-L1 結(jié)合，使PD-L1 胞質(zhì)區(qū)的免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(ITSM) 募集磷酸酶(SHP)-2，引起下游蛋白激酶PI3K 的去磷酸化，激活 PI3K/Akt通路，抑制T淋巴細(xì)胞和一些炎性細(xì)胞發(fā)揮免疫效應(yīng)，使機(jī)體的自身防御機(jī)制出現(xiàn)異常甚至下降，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。而斑蝥素作用后PD-1、PD-L1、HIF-1α及PI3K/Akt的表達(dá)均下調(diào)，推測(cè)可能是斑蝥素通過(guò)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)抑制了PD-1/PD-L1信號(hào)通路的發(fā)展，并阻礙PI3K/Akt的磷酸化過(guò)程，激活機(jī)體的自身防御機(jī)制，正向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究初步觀(guān)察到阿拉嘎斑布有效提取物斑蝥素可下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，通過(guò)PD-1/PD-L1參與肝癌小鼠的免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長(zhǎng)，這為斑蝥素抗腫瘤機(jī)制的闡明及將阿拉嘎-斑布開(kāi)發(fā)為蒙藥成藥用于臨床抗腫瘤提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但斑蝥素作用于PD-1/PD-L1和免疫系統(tǒng)的具體機(jī)制仍值得更深入的探討。