劉 艷 梁 鋼 李曉蓉 閆文佳 肖 虹

卵巢漿液性癌(ovarian serous carcinoma, OSC)是卵巢癌最常見的組織病理學(xué)類型，75%以上的卵巢漿液性癌患者就診時已是晚期，5年生存率僅為29%[1, 2]。在WHO女性生殖器腫瘤分類中指出，卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展按照卵巢癌二元論的發(fā)病模型，分為低級別漿液性癌和高級別漿液性癌，并認為其絕大多數(shù)直接或間接起源于輸卵管傘端上皮[3]。中心體相關(guān)蛋白55(centrosomal protein 55kDa, CEP55)是一種調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂的蛋白，在多種腫瘤中表達增高，與腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。PLK1(polo-like kinase 1, PLK1)是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵蛋白，主要參與中心體復(fù)制、紡錘體組裝和胞質(zhì)分裂等過程。在有絲分裂過程中，PLK1介導(dǎo)CEP55進行磷酸化，維持CEP55有序地募集至中間體，確保順利完成胞質(zhì)分裂。目前，國內(nèi)外關(guān)于CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中的研究較少。因此，本研究應(yīng)用免疫組化聯(lián)合Western blot法探討CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌組織中的表達，分析兩者的表達與患者臨床病理因素的關(guān)系，旨在為卵巢漿液性癌的臨床靶向治療和預(yù)后評估提供一定的依據(jù)。

資料與方法

1.病例資料：收集山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2020年1月～2021年8月因盆腔腫物行手術(shù)切除的卵巢漿液性癌組織50例，其中，包括高級別漿液性癌組織30例和低級別漿液性癌組織20例，正常對照組為同一患者的正常輸卵管傘端上皮組織50例，術(shù)后病理結(jié)果證實無腫瘤性病變。所有收集的新鮮組織均分為兩部分，一部分制成石蠟組織標(biāo)本，另一部分置于液氮中速凍，置于-80℃冰箱保存。所有組織切片均由2名婦科病理專家診斷完成。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料記錄完整；②術(shù)前均未行放療和化療等抗腫瘤治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他惡性腫瘤的病史；②臨床資料不完整?；颊吣挲g38～70歲，平均年齡為55歲，<55歲者20例，≥55歲者30例，采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)的分期系統(tǒng)對腫瘤進行分期，Ⅰ+Ⅱ期16例，Ⅲ+Ⅳ期 34例，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例[4]。本研究經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審批(倫理審批號：2022-K024),所有患者知情同意。

2.免疫組織化學(xué)染色：兔抗人CEP55單克隆抗體購自英國Abcam公司，小鼠抗人PLK1單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。所選組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液常規(guī)固定、常規(guī)脫水、石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片。免疫組化染色采用EnVision法，陰性對照以PBS代替一抗。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇脫水后，分別置于pH值為9.0的EDTA緩沖液和pH值為6.0檸檬酸鹽緩沖液中120℃ 3min，放入3%過氧化氫溶液中進行封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，15min；加入一抗CEP55(1∶300)和PLK1(1∶50)，再置于37℃恒溫箱孵育1h；PBS沖洗3次，每次2min，再加入二抗，37℃恒溫箱孵育20min，PBS沖洗3次，每次2min；滴加DAB顯色劑，鏡檢后自來水沖洗阻斷顯色；最后蘇木精復(fù)染、分化、反藍、脫水和封片。

3.免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：染色判讀方法是根據(jù)陽性細胞的染色強度和陽性細胞占腫瘤細胞的染色百分率兩個方面進行綜合性判斷。CEP55蛋白表達主要定位在細胞質(zhì)[5]。按陽性細胞染色強度評分：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；按陽性細胞占腫瘤細胞的染色百分比例評分：陽性細胞百分比0為0分，1%～10% 為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。陽性細胞百分率與染色強度的乘積為最終結(jié)果，≥6分為高表達，<6分為低表達。PLK1表達定位在細胞質(zhì)或細胞核[6]。按陽性細胞染色強度評分：無著色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，深棕黃色為3分；按陽性細胞占腫瘤細胞的染色百分比例評分：0%～10%為0分，11%～25% 為1分，26%～50%為2分， 51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩項評分結(jié)果相加為最終結(jié)果，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為陽性(++)，>6分為強陽性(+++)；本研究中，<2分為陰性，≥2分為陽性。

4.Western blot法：使用細胞裂解液提取30例高級別漿液性癌、20例低級別漿液性癌和50例正常輸卵管傘端上皮的新鮮組織中的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度；將每對蛋白樣本進行等量上樣，在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳和轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再經(jīng)5%脫脂奶室溫封閉1h，并加入一抗CEP55(1∶5000)和PLK1(1∶500)進行4℃搖床過夜孵育，次日回收一抗，洗滌后加入二抗在室溫孵育1h，顯影后用Image-Pro Plus軟件進行觀察。最后，通過計算CEP55和PLK1蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值及灰度值比值來分析CEP55和PLK1蛋白的表達水平。CEP55的相對分子質(zhì)量為55kDa，PLK1的相對分子質(zhì)量為68kDa，內(nèi)參GAPDH的相對分子質(zhì)量為36kDa。

結(jié) 果

1.免疫組化法檢測CEP55和PLK1蛋白的表達： CEP55蛋白在卵巢漿液性癌組織中高表達率為60%(30/50)，其中，高級別漿液性癌中高表達率為80%(24/30)，低級別漿液性癌中高表達率為30%(6/20)；在正常輸卵管傘端上皮組織中高表達率為14%(7/50)。CEP55在卵巢漿液性癌組織中的蛋白表達高于正常輸卵管傘端上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=22.694，P<0.001，圖1)。PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中陽性率為64%(32/50)，其中，高級別漿液性癌中陽性率為90%(27/30)，低級別漿液性癌中陽性率為25%(5/20)；在正常輸卵管傘端上皮組織中陽性率為10%(5/50)。PLK1在卵巢漿液性癌組織中的蛋白表達高于正常輸卵管傘端上皮組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=31.274，P<0.001，圖2)。

圖1 免疫組化檢測CEP55在3種組織中的表達(EnVision，×200)A.正常輸卵管傘端上皮；B.低級別漿液性癌；C.高級別漿液性癌

圖2 免疫組化檢測PLK1在3種組織中的表達(EnVision，×200)A.正常輸卵管傘端上皮；B.低級別漿液性癌；C.高級別漿液性癌

2.Western blot法檢測CEP55和PLK1的蛋白表達： CEP55蛋白在卵巢漿液性癌組織中的相對表達量(1.043±0.162)高于正常輸卵管傘端上皮組織(0.457±0.061)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.803，P<0.05)。其中，CEP55蛋白在高級別漿液性癌組織中的相對表達量(1.500±0.150)高于低級別漿液性癌組織(0.587±0.087)和正常輸卵管傘端上皮組織(0.457±0.061)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.662，P<0.001)。CEP55蛋白在低級別漿液性癌和正常輸卵管傘端上皮組織中的相對表達量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3中A、B)。PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中的相對表達量(0.648±0.073)高于正常輸卵管傘端上皮組織(0.177±0.022)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.869，P<0.05)。其中，PLK1蛋白在高級別漿液性癌組織中的相對表達量(1.046±0.166)高于低級別漿液性癌組織(0.251±0.080)和正常輸卵管傘端上皮組織(0.177±0.022)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=60.601，P<0.001)。低級別漿液性癌和正常輸卵管傘端上皮組織的PLK1蛋白的相對表達量，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3中A、C)。

圖3 Western blot法檢測CEP55和PLK1在3種組織中的蛋白表達量A.Western blot 法結(jié)果圖(1.正常輸卵管傘端上皮；2.低級別漿液性癌；3.高級別漿液性癌)；B.CEP55相對表達量；C.PLK1相對表達量。*P<0.001

3.CEP55和PLK1表達與卵巢漿液性癌患者的臨床病理特征的關(guān)系：CEP55的表達與患者的臨床病理資料的分析結(jié)果顯示，CEP55蛋白表達與組織學(xué)分級(χ2=12.500，P<0.001)、FIGO分期(χ2=7.414，P=0.006)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.975，P=0.026)有關(guān)，與患者的年齡(χ2=0.347，P=0.556)無關(guān)。PLK1的表達與臨床病理資料的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PLK1蛋白表達與組織學(xué)分級(χ2=22.005，P<0.001)相關(guān)，但與患者的年齡(χ2=0.521，P=0.470)、FIGO分期(χ2=0.230，P=0.631)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=1.576，P=0.209)無關(guān)(表1)。應(yīng)用Spearman分析CEP55和PLK1蛋白在卵巢漿液性癌組織中表達的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在卵巢漿液性癌組織中CEP55和PLK1的蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)。

表1 CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中表達與患者臨床病理特征的關(guān)系

討 論

CEP55是由Fabbro等[7]在2005年發(fā)現(xiàn)的一種EST FLJ10540編碼的中心體相關(guān)蛋白，相對分子質(zhì)量為55kDa，主要定位于人類染色體10q23.33。CEP55長期以來被認為是胞質(zhì)分裂進行脫落的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，負責(zé)調(diào)節(jié)兩個子細胞的分離[8]。研究發(fā)現(xiàn)，CEP55過表達會引起胞質(zhì)分裂紊亂，導(dǎo)致染色體錯誤分離和基因組不穩(wěn)定，促進細胞進行腫瘤性增殖，提示CEP55過表達可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的早期事件[9]。有研究表明，CEP55通過參與PI3K/Akt通路、JAK2/STAT3 通路和Akt/FoxM1通路等多種信號通路來促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲[10～14]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CEP55在結(jié)直腸癌、食管、腎和卵巢癌等多種惡性腫瘤中呈高表達，高表達率的波動范圍為40%～65%[5, 12, 15, 16]。本研究結(jié)果顯示，CEP55在卵巢漿液性癌中的蛋白表達與正常輸卵管傘端上皮組織比較顯著增高，CEP55高表達率為60%，提示CEP55蛋白表達與卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展有一定的相關(guān)性。進一步分析發(fā)現(xiàn)，CEP55的表達與組織學(xué)分級、FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，即CEP55在高級別漿液性癌中的高表達率顯著高于低級別漿液性癌，CEP55表達率越高，患者的FIGO分期越晚且易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這一結(jié)果與既往研究報道相一致，意味著CEP55高表達的卵巢漿液性癌患者的預(yù)后較差。

PLK1是一種保守的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，由一個N端的激酶結(jié)構(gòu)域和一個C端的Polo-box結(jié)構(gòu)域組成[17]。PLK1作為有絲分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)CDK1/Cyclin B復(fù)合物的活性來驅(qū)動細胞從G2期過渡到M期，參與調(diào)控細胞周期。PLK1表達上調(diào)會破壞G2/M檢查點，引起細胞進行異常分裂和增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[17]。近期研究表明，PLK1在卵巢癌和淋巴瘤等惡性腫瘤中表達增高[18, 19]。在卵巢癌研究中，PLK1的陽性率波動范圍較大，為38.0%～80.8%，且PLK1過表達是卵巢癌預(yù)后不良的影響因素[6, 18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢漿液性癌中，PLK1的陽性率為64%，相對于正常輸卵管傘端上皮組織顯著增高，這與相關(guān)文獻報道相一致。PLK1的表達在低級別漿液性癌中的陽性率要低于高級別漿液性癌，這可能預(yù)示著PLK1陽性率越高的卵巢漿液性癌患者的惡性程度越高；但與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，這可能與樣本量較小有關(guān)，今后還需擴大樣本量進行進一步研究。

在有絲分裂期間，PLK1是CEP55的正向調(diào)節(jié)因子，通過介導(dǎo)CEP55在殘基S436上進行磷酸化，促進CEP55按照一定的時空順序募集至中間體，維持細胞正常進行胞質(zhì)分裂和脫落過程[10]。Bastos等[20]研究報道，PLK1 降解過快會使CEP55 過早募集至中間體，引起胞質(zhì)分裂失敗，導(dǎo)致非整倍體細胞形成和染色體不穩(wěn)定，最終抑制細胞凋亡和促進細胞異常增殖。另外有研究發(fā)現(xiàn)PLK1、p53和CEP55存在著p53-PLK1-CEP55的反饋調(diào)節(jié)軸，PLK1作為p53的直接轉(zhuǎn)錄靶點，p53能結(jié)合PLK1啟動子來抑制PLK1的轉(zhuǎn)錄活性，從而進一步抑制CEP55的蛋白表達，當(dāng)TP53基因發(fā)生突變時，會使p53轉(zhuǎn)錄的抑制功能喪失，引起PLK1和CEP55蛋白表達上調(diào)，導(dǎo)致細胞周期異常進行，促使腫瘤細胞的增殖和生長[21]。本研究證實了CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.408，P<0.05)，筆者推測CEP55和PLK1在卵巢漿液性癌的進展中發(fā)揮協(xié)同作用。此外，免疫組化聯(lián)合Western blot法共同檢測出PLK1和CEP55在高級別漿液性癌中的蛋白表達水平高于低級別漿液性癌，這可能與高級別漿液性癌常發(fā)生TP53突變有關(guān)，具體分子機制有待于進一步研究。

近年來，PLK1抑制劑在許多腫瘤模型中取得了顯著的抗腫瘤活性，主要通過誘導(dǎo)腫瘤細胞在G2/M期發(fā)生有絲分裂停滯，抑制腫瘤細胞增殖和促進細胞凋亡，從而改善患者的預(yù)后[22]。Raab等[23]研究表明，PLK1抑制劑Volasertib聯(lián)合紫杉醇會導(dǎo)致卵巢癌細胞的有絲分裂停滯，抑制腫瘤細胞增殖和核內(nèi)復(fù)制，誘導(dǎo)其發(fā)生死亡。目前，Volasertib已被用于急性髓性白血病患者的臨床研究階段，Zeidan等[24]將Volasertib聯(lián)合地西他濱藥物用于治療23例復(fù)發(fā)性或難治性的急性髓性白血病患者的臨床一期研究中，結(jié)果顯示患者未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng)。因此Volasertib有可能成為卵巢漿液性癌患者的靶向治療藥物。除此之外，有研究報道，CEP55過表達可以保護退出有絲分裂停滯的非整倍體細胞，避免腫瘤細胞死亡，導(dǎo)致抗有絲分裂藥物產(chǎn)生耐藥性[25]。然而，使用MEK1/2抑制劑來降低CEP55過表達對非整倍體細胞的保護作用后，可提高腫瘤細胞對抗有絲分裂PLK1抑制劑的敏感度，進而有效地促進腫瘤細胞死亡[26]。在本研究中，CEP55在卵巢漿液性癌組織中過表達，與影響預(yù)后的臨床病理因素有關(guān)，因此，CEP55有望成為卵巢漿液性癌患者治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。

綜上所述，PLK1和CEP55在低級別漿液性癌與正常輸卵管傘端上皮組織中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但兩者均有略增高的趨勢，這可能與樣本量較小有關(guān)，日后還會收集更多的臨床數(shù)據(jù)來進一步分析。此外，從CEP55和PLK1的蛋白表達及兩者的表達與卵巢漿液性癌患者的臨床病理特征的相關(guān)性上來說，兩者在卵巢漿液性癌的表達顯著高于正常輸卵管傘端上皮組織，并且兩者的過表達與較差的生物學(xué)行為相關(guān)，這預(yù)示著卵巢漿液性癌患者的預(yù)后較差。因此，CEP55和PLK1可能協(xié)同參與卵巢漿液性癌的發(fā)生、發(fā)展，未來有望成為卵巢漿液性癌潛在的治療靶點，但還需開展更多的基礎(chǔ)實驗和臨床研究予以證實。