趙冬梅 侯曉丹 東曼 白家琪 范莎莎 楊志輝 朱杰華

摘要

由茄鏈格孢Alternaria solani引起的馬鈴薯早疫病是馬鈴薯生產上的重要病害之一，可導致馬鈴薯大面積減產，進而造成巨大的經濟損失。本研究在獲得缺失AsSod基因的茄鏈格孢突變株（ΔAsSod）的基礎上，對ΔAsSod進行了不同的脅迫處理。結果表明，相比于野生型菌株和回復株，突變株ΔAsSod對細胞壁脅迫因子SDS以及滲透脅迫因子KCl、NaCl、山梨醇的耐受性均減弱。進一步分析發(fā)現，ΔAsSod對外源過氧化物脅迫更敏感，胞內過氧化物酶和漆酶活性均顯著降低。在對突變株孢子萌發(fā)和致病力的研究中發(fā)現，突變株ΔAsSod的孢子萌發(fā)率顯著低于野生型菌株和回復株。同時，突變株ΔAsSod的致病力也顯著降低，表明AsSod基因在茄鏈格孢對外界脅迫的耐受性、孢子萌發(fā)和致病性方面發(fā)揮重要的作用。

??關鍵詞

馬鈴薯早疫病;茄鏈格孢;超氧化物歧化酶（SOD）;致病性

中圖分類號：

S435.32

文獻標識碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020564

AsSod gene regulates the pathogenicity of Alternaria solani and its response to stress

ZHAO Dongmei，HOU Xiaodan，DONG Man，BAI Jiaqi，FAN Shasha，YANG Zhihui，ZHU Jiehua*

（College of Plant Protection， Hebei Agricultural University， Baoding071000， China）

Abstract

Potato early blight caused by Alternaria solani is one of the most important diseases in potato production， which can greatly reduce the yield of potato. In the previous study， we obtained an AsSod deletion mutant of A.solani （ΔAsSod）， and different stress treatments were carried out on ΔAsSod. It was found that the tolerance of ΔAsSod to cell wall stress factors SDS and osmotic stress factors KCl， NaCl and sorbitol was weaker than that of wild and complementation strains. Furthermore， it was found that ΔAsSod was more sensitive to exogenous peroxide stress， and the activities of intracellular peroxidase and laccase in ΔAsSod decreased significantly. The spore germination rate of ΔAsSod was significantly lower than that of wild and complementation strains. At the same time， the pathogenicity of the ΔAsSod also decreased significantly， indicating that the AsSod plays an important role in the tolerance to external stress， spore germination and pathogenicity of A.solani.

Key words

potato early blight;Alternaria solani;superoxide dismutase （SOD）;pathogenicity

茄鏈格孢Alternaria solani是引起馬鈴薯早疫病的主要病原菌，其寄主范圍廣，除馬鈴薯外還可侵染番茄、煙草等多種作物。馬鈴薯早疫病在馬鈴薯整個生育期都會發(fā)生，對馬鈴薯的生產造成很大的危害，嚴重時會導致大面積的減產，是世界范圍內一種常見的馬鈴薯病害[1]。近年來早疫病在我國馬鈴薯產區(qū)頻繁發(fā)生，發(fā)生嚴重地塊減產約30%[2]。分泌蛋白（secreted proteins）是指在細胞內合成后分泌到細胞外起作用的蛋白質，參與生物體的發(fā)育及防御、細胞分化和凋亡的調控、細胞信號傳導等重要的生命活動[3]。許多研究表明，分泌蛋白在病原菌入侵、定殖和擴展過程中均發(fā)揮重要作用。 何佳昱[4]在茄鏈格孢全基因組測序的基礎上，應用BLASTp和病原菌 寄主互作蛋白數據庫（PHI database），從茄鏈格孢全基因組中預測得到138個潛在的病原菌寄主互作蛋白，其中含有一個編碼超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）的基因。

超氧化物歧化酶是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛存在于各種生物體內，能夠清除機體內的氧自由基，有助于提升微生物的抗逆性，延緩老化。SOD作為生物體抗氧化體系中最主要的成員，在真菌的生理過程中發(fā)揮著重要的作用。目前，隨著真菌全基因組數據的不斷豐富以及功能基因組學研究技術的不斷發(fā)展，真菌SOD的生物學功能也不斷被解析[5]。研究表明，真菌SOD基因缺失的突變株對氧自由基產生、高溫、高滲等脅迫條件的敏感性增強[6 -10]。Hwang等[6]發(fā)現白色念珠菌Candida albicans 線粒體MnSOD（Sod2）缺失會導致其對氧化脅迫、熱脅迫、乙醇脅迫及高滲脅迫的耐受性降低，同時該基因的回復互補能恢復菌株的抗逆性。2007年，Li等[7]在畢赤酵母Pichia pastoris中過表達釀酒 酵母Saccharomyces cerevisiae Cu，ZnSod （Sod1）基因增強了重組菌株對氧化脅迫的抗性。Giles等[8]發(fā)現新生隱球菌Cryptococcus neoformans中的Sod2基因是其應對高溫及氧化脅迫下所必需的，同時，Sod2基因的缺失會使新生隱球菌喪失毒力。Cortez[9]在研究莢膜紅細菌Rhodobacter capsulatus時發(fā)現sodB基因的表達量與氧氣含量呈正相關，含氧環(huán)境下的表達量比缺氧條件下提高了10倍。2007年，李森[10]將Sod基因轉化到哈茨木霉Trichoderma harzianum中，發(fā)現Sod基因的表達使哈茨木霉對高溫和高鹽環(huán)境的抗性增強。

真菌中抵抗寄主生物體內高溫、高滲、高氧自由基等逆境相關的基因在一定程度上可影響真菌的侵染力，是潛在毒力影響因子。Rolke等[11]發(fā)現BCSod1基因的缺失會導致灰葡萄孢Botrytis cinerea對大豆的致病力減弱。Moore等[12]研究麥角菌Claviceps purpurea時發(fā)現，與野生型菌株相比，缺失Sod1基因的突變株在侵染初期致病性減弱，表明Sod1基因在病原菌的侵染前期發(fā)揮一定的作用。高士剛[13]利用qRTPCR研究玉米彎孢葉斑菌Curvularia lunata致病性分化相關基因時發(fā)現Sod基因在強、中等致病力菌株中表達量較高，在弱、特殊致病類型菌株中表達量相對較低，同時發(fā)現缺失Sod基因的突變株不僅影響黑色素的形成，在侵染初期致病力減弱。Zhang等[14]研究發(fā)現茄鏈格孢缺失AsSod基因的突變株產孢量下降，菌絲分支減少，與野生型菌株HWC168和回復株相比，SOD含量明顯下降。

本研究前期通過同源重組和原生質體轉化技術獲得了茄鏈格孢AsSod基因缺失突變株，在此基礎上，為了探明基因缺失是否對早疫病菌應答脅迫產生影響，測定了不同脅迫因子下突變株生長的抑制率，胞外酶活性以及突變株的孢子萌發(fā)率與致病性，為進一步明確AsSod基因在茄鏈格孢中的功能提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

茄鏈格孢A.solani野生型菌株HWC168，AsSod基因缺失突變株ΔAsSod，回補AsSod基因的回復株ΔAsSodC，均由河北農業(yè)大學馬鈴薯病害研究室分離、構建和保存。所有菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)備用。

1.2AsSod基因對茄鏈格孢氧化應激性的影響

將野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC接種在含30 mmol/L H2O2的PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，計算野生型菌株、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的相對生長抑制率。相對生長抑制率[15]=（對照菌落直徑 處理菌落直徑）/（處理菌落直徑 菌餅直徑）×100%。每個處理設置3個重復，共進行3次生物學重復。

1.3ΔAsSod對細胞壁脅迫因子的敏感性測定

將野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC接種在含0.2 mg/mL SDS的PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，計算野生型菌株、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的相對生長抑制率。每個處理設置3個重復，共進行3次生物學重復。

1.4ΔAsSod對滲透脅迫因子的敏感性測定

將野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC接種在含0.5 mol/L NaCl、0.5 mol/L KCl和0.3 mol/L山梨醇的PDA平板上，25℃培養(yǎng)7 d，測量菌落直徑，計算野生型菌株、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的相對生長抑制率。每個處理設置3個重復，共進行3次生物學重復。

1.5AsSod基因對茄鏈格孢胞外酶活性的影響

漆酶活性的測定：將野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod及回復株ΔAsSodC接種到80 mL PD培養(yǎng)液中，25℃，120 r/min，培養(yǎng)48 h;過濾收集菌絲，并用吸水紙除去多余水分，置于 80℃，冷凍24 h，冷凍抽干24 h，稱量干重。取1 mL濾液，4℃， 3 500 r/min，離心10 min;在2 mL EP管中加入100 μL? 500 mmol/L的醋酸、100 μL 10 mg/mL的ABTS、200 μL離心后的濾液、600 μL ddH2O，室溫放置5 min，立即插入冰上終止反應，用分光光度計測定其在420 nm的吸光值，將最終單位換算為吸光值/g，用以表示漆酶活性。共進行3次生物學重復。

過氧化物酶活性測定：在上述步驟2 mL EP管中再加入3.4 μL 30% H2O2（m/m），測定其在420 nm處的吸光值，再將最終單位換算成吸光值/g，用以表示過氧化物酶的活性。共進行3次生物學重復。

1.6AsSod基因對茄鏈格孢分生孢子萌發(fā)的影響

茄鏈格孢在人工培養(yǎng)條件下不易產孢，本研究參考劉麗麗[16]的方法對HWC168、ΔAsSod及ΔAsSodC進行誘導產孢。將得到的孢子配制成1×103個/mL的孢子懸浮液，取500 μL均勻地涂抹在1%的水瓊脂培養(yǎng)基上，放置在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2 h后觀察分生孢子萌發(fā)情況，若1個孢子產生多個芽管或芽管與孢子等長時認為分生孢子萌發(fā)。同時對孢子懸浮液進行熱脅迫處理，42℃水浴15 min，再將孢子懸浮液均勻地涂抹在1%的水瓊脂平板上，2 h后觀察熱脅迫后HWC168、ΔAsSod及ΔAsSodC分生孢子的萌發(fā)情況。每個處理統(tǒng)計的孢子數為50個，每個菌株設置3個重復，共進行3次生物學重復，計算分生孢子的萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數/統(tǒng)計孢子數×100%。

1.7AsSod基因對茄鏈格孢致病力的影響

采用離體葉片接種法測定茄鏈格孢野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod及回復株ΔAsSodC的致病力。取葉齡、葉位、大小一致的馬鈴薯健康葉片， 使葉片正面向上，將葉柄插入含有10.7 μmol/L萘乙酸（NAA）和10 μg/mL鹽酸四環(huán)素的1%水瓊脂平板中。將野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod和回復株ΔAsSodC分生孢子懸浮液的濃度均調整至1×104個/mL，用移液槍吸取25 μL孢子懸浮液，接種在葉片正面中部的主脈附近，蓋上皿蓋，在25℃光照培養(yǎng)箱中L∥D=12 h∥12 h條件下培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量病斑的長度和寬度，并觀察病斑特征。共進行3次生物學重復，每個重復接種5～8個葉片。

1.8數據統(tǒng)計

本研究中，所有試驗均進行3次生物學重復，每次重復設置3個平行處理（致病力測定試驗中每個重復接種5～8片葉片）。本試驗所有數據均使用DPS數據處理軟件中的Duncan氏新復極差法進行統(tǒng)計分析，顯著水平設置為0.05。用Excel對統(tǒng)計結果繪制柱狀圖。

2結果與分析

2.1AsSod基因對茄鏈格孢氧化應激性的影響

25℃下，野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、 回復株ΔAsSodC在含30 mmol/L H2O2的PDA平板上的生長均受到抑制。 培養(yǎng)7 d后，野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的相對生長抑制率分別為38.11%，90.21%和37.49%， 突變株ΔAsSod的相對生長抑制率顯著大于野生型菌株和回復株（圖1），由此推測， AsSod基因的缺失導致突變株對過氧化物的耐受力降低。

2.2 AsSod參與調控茄鏈格孢對細胞壁脅迫的應答

野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC在含0.2 mg/mL SDS的PDA平板上生長受到抑制，25℃，培養(yǎng)7 d，其相對生長抑制率分別為25.54%、33.06%和26.68%，SDS對突變株ΔAsSod的生長較野生型菌株和回復株具有更顯著的抑制效果（圖2）。由此推測：AsSod參與調控茄鏈格孢對細胞壁脅迫的應答。

2.3AsSod參與調控茄鏈格孢對滲透脅迫的應答

野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株 ΔAsSodC在含NaCl（0.5 mol/L）、KCl（0.5 mol/L） 和山梨醇（0.3 mol/L）的PDA平板上生長均受到了抑制。25℃，培養(yǎng)7 d，NaCl和KCl對突變株ΔAsSod的抑制明顯高于野生型菌株和回復株（圖3）。與NaCl和KCl相比，山梨醇對野生型菌株、突變株和回復株的相對生長抑制率差異較小，野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的相對生長抑制率分別為8.29%、11.34%和7.94%。

2.4AsSod調控茄鏈格孢漆酶的分泌

為了進一步驗證AsSod是否參與調控馬鈴薯早疫病菌過氧化物酶和漆酶的分泌，檢測液體培養(yǎng)ΔAsSod濾液中過氧化物酶及漆酶活性的變化情況，發(fā)現ΔAsSod濾液中漆酶的活性低于HWC168及ΔAsSodC（圖4），但ΔAsSod濾液中過氧化物酶的活性與HWC168及ΔAsSodC沒有顯著差異，表明AsSod可能參與調控茄鏈格孢漆酶的分泌。

2.5AsSod參與調控早疫病菌孢子萌發(fā)

孢子懸浮液25℃培養(yǎng)2 h后，野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的孢子萌發(fā)率分別為53.33%、31.56%和52.22%（表1）。突變株ΔAsSod的孢子萌發(fā)數量顯著低于野生型菌株和回復株，表明AsSod基因的缺失對茄鏈格孢分生孢子的萌發(fā)有顯著的抑制作用。分生孢子在熱脅迫處理后培養(yǎng)2 h，野生型菌株HWC168、突變株ΔAsSod、回復株ΔAsSodC的分生孢子萌發(fā)率相對于正常情況下的孢子萌發(fā)率分別下降了22.66、14、20百分點。

2.6AsSod參與調控茄鏈格孢的致病力

為了闡明AsSod是否參與茄鏈格孢的致病過程，對ΔAsSod進行了致病性測定。利用茄鏈格孢孢子懸浮液離體接種馬鈴薯葉片，結果顯示，接種HWC168和ΔAsSodC的葉片病斑平均直徑分別約為1.77 cm和1.62 cm，接種突變株ΔAsSod的葉片病斑平均直徑約為1.32 cm，比接種HWC168和ΔAsSodC葉片發(fā)病減弱，且病斑直徑具有顯著性差異（圖5），表明AsSod基因缺失的茄鏈格孢致病力減弱。

3討論

病原菌在生長和侵染寄主植物過程中會受到環(huán)境及寄主細胞防衛(wèi)反應產生的過氧化物等因素的脅迫，而病原菌對于脅迫的應答與其生長發(fā)育及致病力有著重要的聯(lián)系。為了探明AsSod基因缺失是否影響茄鏈格孢對外界脅迫的應答，本研究測定了不同脅迫因子對突變株的生長抑制率。結果表明，AsSod基因缺失后茄鏈格孢對滲透脅迫、氧化脅迫及細胞壁脅迫更加敏感，表明AsSod參與茄鏈格孢對外界脅迫的應答。

細胞壁在維持病原菌細胞形態(tài)、信號傳遞及生長分化中起重要作用[17]。本研究發(fā)現，在細胞壁脅迫因子SDS的作用下，茄鏈格孢菌落生長受到了抑制，而且對突變株的抑制大于野生型菌株和回復株，這可能是由于AsSod的缺失影響了茄鏈格孢細胞壁的完整性，進而影響了菌株對脅迫因子的耐受能力。張小華等[18]研究表明，Sod1基因編碼的銅鋅超氧化物歧化酶是酵母細胞中最重要的抗氧化酶，Sod1基因缺失導致酵母細胞對真菌細胞壁抑制劑剛果紅的敏感性增加，表明Sod1基因的缺失影響了酵母細胞壁的穩(wěn)定性。同時本研究中也發(fā)現，突變株ΔAsSod相比野生型菌株和回復株對于滲透脅迫因子的敏感性增強，這可能也是由于AsSod的缺失影響了細胞壁的完整性所導致的。

Sod基因除了調控病原菌對外界脅迫的應答外，對病原菌的致病力也有一定的影響。缺失Sod基因對病原菌致病力的影響在灰葡萄孢和麥角菌中均有報道[11-12]。本研究中，突變株ΔAsSod在馬鈴薯葉片上引起的病斑面積顯著小于野生型菌株和回復株。在玉米大斑病菌Setosphaeria turcica[19]和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae [20]侵染寄主植物的研究中發(fā)現，病原菌在寄主表面萌發(fā)后形成附著孢，附著孢再形成侵染釘，然后侵染釘利用附著孢內部的膨壓穿透表皮角質層，完成侵染過程。在本研究中發(fā)現，突變株ΔAsSod的分生孢子萌發(fā)率較野生型菌株和回復株顯著下降，這可能是導致ΔAsSod突變株致病力減弱的原因之一。

植物在受到病原菌的侵染時，表面會產生大量的活性氧來抵抗病原菌的侵染，而此時病原菌通過產生大量的過氧化物酶降解植物表面的活性氧，進而達到成功侵染的目的[21-23]。在本試驗中，突變株ΔAsSod中胞外漆酶活性降低，我們推測AsAod影響了胞外漆酶的分泌，進而干擾了突變株降解寄主木質素的能力，導致突變株致病性降低。具體如何調控還需要進一步的研究。

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收稿日期：2020- 10- 27修訂日期：2021- 01- 05

基金項目：

河北省教育廳青年基金（QN2019156）;國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項（CARS-09-P18）

* 通信作者

E-mail：zhujiehua356@126.com