張春雨 李小宇 王晨 戰(zhàn)笑蕾 劉建青 王永志

摘要

本研究利用小RNA深度測(cè)序法在大豆葉片上檢測(cè)到1株花生斑駁病毒Peanut mottle virus （PeMoV），根據(jù)小RNA深度測(cè)序結(jié)果和GenBank公布的PeMoV基因組序列設(shè)計(jì)引物克隆了PeMoV公主嶺分離物（PeMoVGongzhuling）的基因組序列。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后獲得了PeMoVGongzhuling基因組，大小為9 709個(gè)核苷酸（GenBank登錄號(hào)：MT790744）。該基因組在第123位—第9 422位存在1個(gè)大的開放閱讀框（ORF），編碼1個(gè)多聚蛋白（分子量351.28 kD）。PeMoVGongzhuling與GenBank中已登錄的其他PeMoV分離物的基因組的核苷酸序列一致性為95.88%～99.53%，氨基酸序列一致性為97.39%～99.84%，其中與韓國(guó)分離物GYBU92 （MT603819）在核苷酸和氨基酸水平上的一致性均為最高。

??關(guān)鍵詞

花生斑駁病毒;基因組;大豆

中圖分類號(hào)：

S435.29

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.16688/j.zwbh.2020544

Sequencing and analysis of the genome of Peanut mottle virus （PeMoV） Gongzhuling isolate infecting soybean

ZHANG Chunyu1，LI Xiaoyu1，WANG Chen1，2，ZHAN Xiaolei1，3，LIU Jianqing1，3，WANG Yongzhi1*

（1. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling136100， China; 2. Jilin Agricultural University，

Changchun130118， China; 3. Changchun Normal University， Changchun130032， China）

Abstract

In this study， the Peanut mottle virus （PeMoV） from soybean leaves was detected by small RNA deep sequencing. Primers were designed according to results of sRNA deep sequencing and the published genome sequences of PeMoV on GenBank， and the segments of genome of PeMoV Gongzhuling isolate （PeMoVGongzhuling） was amplified by RTPCR. The assembled genome of PeMoVGongzhuling was 9 709 nucleotides （GenBank accession no. MT790744）. A large open reading frame （ORF） was found located between the 123th and the 9422th nucleotides， which encoded a polypeptide of 351.28 kD. By comparing it with other isolates of PeMoV， the nucleotide identity was 95.88% 99.53%， and the amino acid identity was 97.39% 99.84%， and it shared the highest identity with the South Korea isolate GYBU92 （MT603819）.

Key words

Peanut mottle virus（PeMoV）;genome;soybean

花生斑駁病毒Peanut mottle virus （PeMoV）是馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus成員，主要靠汁液接觸、種子或由蚜蟲以非持久方式傳播。PeMoV除嚴(yán)重危害花生外，其寄主范圍僅局限于豆科植物，例如菜豆、大豆、豌豆、豇豆等[1]。 1972年Kuhn等[2]首次在美國(guó)佐治亞州發(fā)現(xiàn)PeMoV侵染大豆;之后陸續(xù)在美國(guó)的弗吉尼亞州、南卡羅萊納州，澳大利亞，東非等地發(fā)現(xiàn)PeMoV侵染大豆[3 4];1984年薛寶娣等[5]首次報(bào)道了PeMoV 在我國(guó)大豆上的侵染情況，并進(jìn)行了PeMoV對(duì)不同品種大豆的侵染試驗(yàn);2014年Lim等[6]在韓國(guó)首次發(fā)現(xiàn)PeMoV侵染大豆并獲得了全基因組序列。PeMoV侵染大豆后葉片表現(xiàn)為明脈、花葉、黃脈、壞死等癥狀，一般可導(dǎo)致大豆減產(chǎn)12%～28%[4]，一些感病品種可達(dá)到41%，還會(huì)導(dǎo)致大豆含油量降低，品質(zhì)下降[3]。

本研究利用小RNA深度測(cè)序方法在感病大豆葉片上檢測(cè)到1株花生斑駁病毒，分段克隆測(cè)序獲得了全基因組序列并進(jìn)行了同源性分析，為大豆花生斑駁病毒病的防控提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

感病大豆葉片采自吉林省長(zhǎng)春市公主嶺市（124°4′E，43°31′N）， 80℃保存。

1.2感病大豆葉片總RNA提取

參照TRIzol（Invitrogen）說明書提取感病大豆葉片總RNA，NanoDrop微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀（Thermo Scientific）測(cè)定濃度。

1.3小RNA文庫(kù)建立、測(cè)序及分析

樣品總RNA（2個(gè)重復(fù)）質(zhì)量由北京諾禾致源科技股份有限公司檢測(cè)，質(zhì)量合格后使用Small RNA Sample Pre Kit構(gòu)建文庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建完成后先使用Qubit 2.0初步定量，再使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)中插入片段的大?。╥nsert size）進(jìn)行檢測(cè)，插入片段大小符合預(yù)期后使用qPCR對(duì)文庫(kù)有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫(kù)質(zhì)量。文庫(kù)檢測(cè)合格后進(jìn)行HiSeq/MiSeq測(cè)序，采用無參考基因組寄主病毒sRNA分析流程進(jìn)行候選病毒評(píng)估。

1.4PCR擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析

根據(jù)小RNA測(cè)序獲得的拼接片段和GenBank中已報(bào)道的PeMoV分離物基因組序列，分段設(shè)計(jì)4組病毒引物（表1），以大豆葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行RTPCR擴(kuò)增。 PCR反應(yīng)體系（50 μL）：2×SanTaq PCR Mix 25 μL，10 μmol/L 引物各1 μL， 模板cDNA 1 μL，ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s， 72℃延伸1～4 min（根據(jù)目的片段大小調(diào)整時(shí)間），35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后， 回收目的片段由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增5′、3′非編碼區(qū)的引物PeMoVR、PeMoVF，采用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（TaKaRa）擴(kuò)增5′、3′非編碼區(qū)。利用DNAMAN軟件拼接序列，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化分析，采用neighborjoining法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1田間感病大豆植株癥狀

對(duì)公主嶺大豆田進(jìn)行病毒病調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)1株染病大豆植株相對(duì)矮小，葉片褪綠、斑駁，葉肉呈泡狀突起（圖1）。

2.2大豆葉片sRNA深度測(cè)序分析

提取大豆葉片總RNA，經(jīng)sRNA測(cè)序共獲得18 822 100個(gè)reads，去除含有接頭的、低質(zhì)量的reads，獲得clean reads 17 549 725個(gè)。篩選18～40 nt的序列與GenBank Virus RefSeq核酸數(shù)據(jù)庫(kù)

進(jìn)行比對(duì)，初步鑒定樣品感染病 毒種類（表2）。其中比對(duì)到花生斑駁病毒（PeMoV）的reads數(shù)占比對(duì)到數(shù)據(jù)庫(kù)的總reads數(shù)的11.8%。

2.3PeMoVGongzhuling基因組序列分析

根據(jù)小RNA測(cè)序獲得的拼接片段和GenBank中已報(bào)道的PeMoV分離物基因組序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行分段擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小一致的片段，對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)5′、3′非編碼區(qū)引物，采用SMARTer RACE 5′/3′試劑盒擴(kuò)增目的片段（圖2），回收產(chǎn)物測(cè)序。

對(duì)分段測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接、校正后，除poly（A）尾外，獲得的PeMoVGongzhuling的基因組序列長(zhǎng)9 709 bp，提交到GenBank取得的登錄號(hào)為MT790744。序列中A、T、C、G 4種堿基的含量分別為32.66%、25.18%、18.17%、23.99%，5′非編碼區(qū)（5′UTR）包含122個(gè)堿基，3′非編碼區(qū)（3′UTR）包含287個(gè)堿基。 PeMoVGongzhuling在第123位 第9422位存在1個(gè)大的開放閱讀框（ORF），編碼1個(gè)由3 099個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白（分子量351.28 kD）。該多聚蛋白自身分解為10個(gè)成熟的蛋白質(zhì)，從N端到C端依次為P1（36.82 kD）、HCPro（ 51.29 kD）、P3（40.31 kD）、6K1（5.75 kD）、CI（70.91 kD）、6K2（6.08 kD）、NIaVpg（21.35 kD）、NIaPro（27.75 kD）、NIb（59.58 kD） 和CP（31.60 kD）。通過與其他PeMoV分離物的氨基酸序列比對(duì)，確定了多聚蛋白的9個(gè)切割位點(diǎn)，分別為KIHQY/S、HYVVG/G、PVVYQ/A、TVRYQ/S、TVQYQ/S、PVKYQ/G、VVATE/G、SVEYQ/S、EVRYQ/S（圖3）。

2.4PeMoVGongzhuling與PeMoV其他分離物的同源性比較

利用DNAMAN軟件將PeMoVGongzhuling全基因組序列與GenBank中已公布的其他PeMoV分離物基因組進(jìn)行序列一致性分析，發(fā)現(xiàn)PeMoVGongzhuling與它們?cè)诤塑账崴缴系囊恢滦詾?5.88%～99.53%，在氨基酸水平上的一致性為97.39%～99.84%，其中與韓國(guó)分離物GYBU92 （MT603819）的同源性在該兩種水平上均為最高。在單個(gè)基因區(qū)段上，HCPro、NIaPro、CP基因的序列一致性多數(shù)高于全基因組序列一致性的平均值，變異程度較低（表3）。

以馬鈴薯Y病毒Potato virus Y（PVY）為外組生物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，所有分離物聚成3個(gè)簇群，其中哥倫比亞分離物PeMoVpintoi（KU708532）單獨(dú)成為1簇，美國(guó)分離物PeMoVM（AF023848）、墨西哥分離物PeMoVINIFAP SJ85（MG640414）、 巴西分離物PeMoV（KY350138）聚成1簇，其余分離物聚成1簇。PeMoVGongzhuling與PeMoVGYBU92 （MT603819）的親緣關(guān)系最近（99.53%）（圖4）。

3討論

PeMoV侵染大豆的情況已陸續(xù)在世界各地報(bào)道，在我國(guó)各地也普遍發(fā)生，目前GenBank上已報(bào)道的PeMoV大豆分離物全基因組序列均來自韓國(guó)。本研究首次在吉林公主嶺大豆上克隆得到了PeMoVGongzhuling的全基因組序列，對(duì)其進(jìn)行一致性分析發(fā)現(xiàn)，PeMoVGongzhuling與侵染大豆的韓國(guó)分離物GYBU92 （MT603819）一致性最高（99.53%），其次是侵染花生的遼寧分離物（MH270528）（99.52%）。 對(duì)PeMoVGongzhuling的基因產(chǎn)物比對(duì)發(fā)現(xiàn)，P1、P3、CI、NIaVpg、NIaPro、NIb和CP在核苷酸水平均與遼寧分離物（MH270528）一致性最高，HCPro與韓國(guó)分離物GYBU92 （MT603819） 一致性最高，而6K1和6K2與侵染大豆的韓國(guó)分離物PeMoVGAWOp （MT603816）和PeMoVHabin （KF977830）一致性最高。

吉林省作為國(guó)家糧食主產(chǎn)區(qū)之一，大豆、花生、雜糧雜豆等種植面積廣泛，近年來隨著花生種植效益優(yōu)勢(shì)日益凸顯，吉林省花生種植面積由2000年的不足6萬hm2到2017年統(tǒng)計(jì)的27萬hm2左右，增長(zhǎng)了近5倍[7]，2018年達(dá)到33萬hm2左右，超過同期大豆的種植面積。PeMoV是侵染花生及豆科植物的重要病害，尤其在花生和大豆毗鄰種植區(qū)，更易造成病毒病大面積暴發(fā)，嚴(yán)重影響花生、大豆的產(chǎn)量及種質(zhì)資源。目前吉林省PeMoV侵染大豆的情況還未見報(bào)道，田間也未見大面積發(fā)病，更應(yīng)予以重視，及時(shí)防控。

本研究為后續(xù)研究PeMoV基因組結(jié)構(gòu)和功能，基因進(jìn)化機(jī)制以及病毒與寄主的互作等研究提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)大豆的PeMoV檢測(cè)、防控以及抗病育種等工作具有重要意義。

參考文獻(xiàn)

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收稿日期：2020-10-16修訂日期：2020- 11- 24

基金項(xiàng)目：

吉林省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（20180201013NY）;吉林省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2021ZY022）

* 通信作者

E-mail：yzwang@126.com